Dit protocol beschrijft de dynamiek van virale infecties met behulp van luciferase- en fluorescentie-expresserende recombinant (r)SARS-CoV-2 en een in vivo beeldvormingssysteem (IVIS) in K18 hACE2 transgene muizen om de behoefte aan secundaire benaderingen te overwinnen die nodig zijn om SARS-CoV-2-infecties in vivo te bestuderen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Live beeldvorming en kwantificering van virale infectie bij K18 hACE2 transgene muizen met reporter-expressing recombinant SARS-CoV-2
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De pandemie van de coronavirusziekte 2019 (COVID-19) is veroorzaakt door ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Tot op heden is SARS-CoV-2 verantwoordelijk voor meer dan 242 miljoen infecties en meer dan 4,9 miljoen doden wereldwijd. Net als andere virussen vereist het bestuderen van SARS-CoV-2 het gebruik van experimentele methoden om de aanwezigheid van virus in geïnfecteerde cellen en / of in diermodellen te detecteren. Om deze beperking te overwinnen, hebben we replicatie-competente recombinante (r) SARS-CoV-2 gegenereerd die bioluminescente (nanoluciferase, Nluc) of fluorescerende (Venus) eiwitten tot expressie brengt. Deze reporter-expressing rSARS-CoV-2 maken het mogelijk om virale infecties in vitro en in vivo te volgen op basis van de expressie van Nluc- en Venus-reportergenen. Hier beschrijft de studie het gebruik van rSARS-CoV-2/Nluc en rSARS-CoV-2/Venus om SARS-CoV-2-infectie te detecteren en te volgen in het eerder beschreven K18 humane angiotensine-converterende enzym 2 (hACE2) transgene muismodel van infectie met behulp van in vivo beeldvormingssystemen (IVIS). Deze rSARS-CoV-2/Nluc en rSARS-CoV-2/Venus tonen rSARS-CoV-2/WT-achtige pathogeniciteit en virale replicatie in vivo. Belangrijk is dat de expressie van Nluc en Venus ons in staat stelt om virale infecties in vivo en ex vivo, bij geïnfecteerde muizen, direct te volgen. Deze rSARS-CoV-2/Nluc en rSARS-CoV-2/Venus vormen een uitstekende optie om de biologie van SARS-CoV-2 in vivo te bestuderen, virale infectie en bijbehorende COVID-19-ziekte te begrijpen en effectieve profylactische en/of therapeutische behandelingen te identificeren om SARS-CoV-2-infectie te bestrijden.
Inleiding
Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) is een omhuld, positief,enkelstrengs RNA-virus dat behoort tot de Betacoronavirus-afstamming in de Coronaviridae-familie 1. Deze virale familie is onderverdeeld in Alpha-, Beta-, Gamma- en Delta-coronavirus1. Alfa- en Betacoronavirussen infecteren voornamelijk zoogdieren, terwijl Gamma- en Deltacoronavirus bijna uitsluitend vogels infecteren2. Tot op heden hebben zeven coronavirussen (CoV) soortenbarrières overschreden en zijn ze naar voren gekomen als menselijke coronavirussen (HCoV): twee alfa-CoV's (HCoV-229E en HCoV-NL63) en....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Protocollen met K18 hACE2 transgene muizen werden goedgekeurd door het Texas Biomedical Research Institute (TBRI) Institutional Biosafety Committee (IBC) en de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Alle experimenten volgen de aanbevelingen in de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren van de Nationale Onderzoeksraad40. De juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM' s) zijn vereist bij het werken met muizen.
1. Gebruik van K18 hACE2 transgene muizen
- Koop en onderhoud 4-6 weken oude vrouwelijke B6.Cg-Tg (K18-ACE2) 2Prlmn / J-muizen (K18 hACE2 transgene muizen)....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
rSARS-CoV-2/Nluc infectie bij K18 hACE2 transgene muizen (figuren 1 en 2)
Figuur 1A toont een schematische weergave van de rSARS-CoV-2/WT (boven) en rSARS-CoV-2/Nluc (onder) die worden gebruikt om infecties in vivo te beoordelen. Figuur 1B toont het schematische stroomschema dat wordt toegepast om de rSARS-CoV-2/Nluc-infectiedynamiek in K18 hACE2 transgene muizen te beoordelen. Vier tot .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol toont de haalbaarheid aan van het gebruik van deze rSARS-CoV-2-expressie van reportergenen om virale infecties in vivo te volgen. Beide reporter-expresserende recombinante virussen bieden een uitstekend hulpmiddel voor het bestuderen van SARS-CoV-2-infecties in vivo. De beschreven ex vivo (rSARS-CoV-2/Venus) en in vivo (rSARS-CoV-2/Nluc) beeldvormingssystemen vormen een uitstekende optie om de dynamiek van SARS-CoV-2-infectie, virale pathogenese te begrijpen en geïnfecteer.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd bij afwezigheid van enig commercieel, financieel en niet-financieel of persoonlijk belangenconflict met betrekking tot het beschreven werk.
Dankbetuigingen
We willen de leden van ons instituut (Texas Biomedical Research Institute) bedanken voor hun inspanningen om onze faciliteiten volledig operationeel en veilig te houden tijdens de COVID-19-pandemie. We willen ook onze Institutional Biosafety Committee (IBC) en spell (IACUC) bedanken voor het herzien van onze protocollen op een tijdsefficiënte manier. We bedanken Dr. Thomas Moran van de Icahn School of Medicine op de berg Sinaï voor het verstrekken van het SARS-CoV cross-reactieve 1C7C7 nucleocapsid (N) eiwit monoklonale antilichaam. SARS-CoV-2-onderzoek in het laboratorium van Martinez-Sobrido wordt momenteel ondersteund door de NIAID / NIH-subsidies RO1AI161363-01, R....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.5% Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | Bewaar bij kamertemperatuur (RT) |
| 1% DEAE-Dextran | MP Biomedicals | 195133 | |
| 10% Formalin solution, neutral buffered | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Agar | Oxoid | LP0028 | |
| 24-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 662160 | |
| 5% Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S-5761 | |
| 6-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 96-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 655-180 | |
| African green monkey kidney epithelial cells (Vero E6) | ATCC | CRL-1586 | |
| Ami HT | Spectral Instruments Imaging | ||
| Aura Imaging Software 3.2.0 | Spectral Instruments Imaging | Beeldanalysesoftware | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), 35% | Sigma-Aldrich | A9647 | Bewaar bij 4 °C |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Corning Cellgro | 15-013-CV | Bewaar bij 4 °C |
| Anesthesia gas machine | Veterinary Anesthesia Systems, Inc. | VAS 2001R | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | Bewaar bij -20 °C |
| Four- to six-week-old female K18-hACE2 transgenic mice | The Jackson Laboratory | 34860 | |
| Graphpad Prism Version 9.1.0 | GraphPad | ||
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Bewaar bij RT |
| MARS Data Analysis Software | BMG LABTECH | ||
| MB10 tablets | QUIP Laboratories | MBTAB1.5 | Bewaar bij RT |
| Nano-Glo Luciferase Assay Reagent | Promega | N1110 | Dit reagens wordt gebruikt om Nluc-activiteit te meten. Bewaar bij -20 °C |
| Nunc MicroWell 96-Well Microplates | ThermoFisher Scientific | 269620 | |
| Nunc MicroWell 96-Well Microplates | ThermoFisher Scientific | 269620 | |
| Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x | Corning | 30-009-CI | Bewaar bij -20 °C |
| PHERAstar FSX | BMG LABTECH | PHERAstar FSX | |
| Precelleys Evolution homogenizer | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
| Soft tissue homogenizing CK14 – 7 mL | Bertin Instruments | P000940-LYSK0-A | |
| T75 EasYFlask | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| VECTASTAIN ABC-HRP Kit, Peroxidase | Vector Laboratories | PK-4002 | ABC-kit en DAB Peroxidase Substraatkit |
Referenties
- V'Kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 155-170 (2021).
- Pal, M., Berhanu, G., Desalegn, C., Kandi, V. Severe acute respiratory syndrome cor....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
