Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Live beeldvorming en kwantificering van virale infectie bij K18 hACE2 transgene muizen met reporter-expressing recombinant SARS-CoV-2

2.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63127

⸱

5 november 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Texas Biomedical Research Institute

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de dynamiek van virale infecties met behulp van luciferase- en fluorescentie-expresserende recombinant (r)SARS-CoV-2 en een in vivo beeldvormingssysteem (IVIS) in K18 hACE2 transgene muizen om de behoefte aan secundaire benaderingen te overwinnen die nodig zijn om SARS-CoV-2-infecties in vivo te bestuderen.

Samenvatting

De pandemie van de coronavirusziekte 2019 (COVID-19) is veroorzaakt door ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Tot op heden is SARS-CoV-2 verantwoordelijk voor meer dan 242 miljoen infecties en meer dan 4,9 miljoen doden wereldwijd. Net als andere virussen vereist het bestuderen van SARS-CoV-2 het gebruik van experimentele methoden om de aanwezigheid van virus in geïnfecteerde cellen en / of in diermodellen te detecteren. Om deze beperking te overwinnen, hebben we replicatie-competente recombinante (r) SARS-CoV-2 gegenereerd die bioluminescente (nanoluciferase, Nluc) of fluorescerende (Venus) eiwitten tot expressie brengt. Deze reporter-expressing rSARS-CoV-2 maken het mogelijk om virale infecties in vitro en in vivo te volgen op basis van de expressie van Nluc- en Venus-reportergenen. Hier beschrijft de studie het gebruik van rSARS-CoV-2/Nluc en rSARS-CoV-2/Venus om SARS-CoV-2-infectie te detecteren en te volgen in het eerder beschreven K18 humane angiotensine-converterende enzym 2 (hACE2) transgene muismodel van infectie met behulp van in vivo beeldvormingssystemen (IVIS). Deze rSARS-CoV-2/Nluc en rSARS-CoV-2/Venus tonen rSARS-CoV-2/WT-achtige pathogeniciteit en virale replicatie in vivo. Belangrijk is dat de expressie van Nluc en Venus ons in staat stelt om virale infecties in vivo en ex vivo, bij geïnfecteerde muizen, direct te volgen. Deze rSARS-CoV-2/Nluc en rSARS-CoV-2/Venus vormen een uitstekende optie om de biologie van SARS-CoV-2 in vivo te bestuderen, virale infectie en bijbehorende COVID-19-ziekte te begrijpen en effectieve profylactische en/of therapeutische behandelingen te identificeren om SARS-CoV-2-infectie te bestrijden.

Inleiding

Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) is een omhuld, positief,enkelstrengs RNA-virus dat behoort tot de Betacoronavirus-afstamming in de Coronaviridae-familie 1. Deze virale familie is onderverdeeld in Alpha-, Beta-, Gamma- en Delta-coronavirus1. Alfa- en Betacoronavirussen infecteren voornamelijk zoogdieren, terwijl Gamma- en Deltacoronavirus bijna uitsluitend vogels infecteren2. Tot op heden hebben zeven coronavirussen (CoV) soortenbarrières overschreden en zijn ze naar voren gekomen als menselijke coronavirussen (HCoV): twee alfa-CoV's (HCoV-229E en HCoV-NL63) en vijf bèta-CoV's (HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, Midden-Oosten respiratoir syndroom coronavirus [MERS-CoV] en SARS-CoV-2)3,4,5,6. SARS-CoV, MERS-CoV en SARS-CoV-2 zijn hoogpathogeen en veroorzaken ernstige infectie van de onderste luchtwegen7. Voorafgaand aan de opkomst van SARS-CoV-2 waren er twee epidemische uitbraken veroorzaakt door CoV's: SARS-CoV in Guangdong Providence, China, van 2002-2003, met een sterftecijfer (CFR) van ongeveer 9,7%; en MERS-CoV in het Midden-Oosten van 2012 tot heden, met een CFR van ongeveer 34%7,8. SARS-CoV-2 heeft een totale CFR tussen 3,4%-49%, waarbij onderliggende aandoeningen bijdragen aan een hogere CFR 8,9. Sinds de ontdekking in december 2019 is SARS-CoV-2 in Wuhan, China, verantwoordelijk voor meer dan 242 miljoen menselijke infecties en meer dan 4,9 miljoen menselijke sterfgevallen wereldwijd 7,10,11,12. Met name sinds eind 2020 hebben nieuwe SARS-CoV-2-varianten van bezorgdheid (VoC) en varianten van belang (VoI) invloed gehad op viruskenmerken, waaronder transmissie en antigeniciteit 9,13, en de algemene richting van de COVID-19-pandemie. Voor de behandeling van SARS-CoV-2-infecties is er momenteel slechts één Verenigde Staten (VS) Food and Drug Administration (FDA) therapeutisch antiviraal (remdesivir) en één Emergency Use Authorization (EUA) geneesmiddel (baricitinib, toe te dienen in combinatie met remdesivir)14. Er zijn ook 6 goedgekeurde EUA monoklonale antilichamen: REGEN-COV (casirivimab en imdevimab, samen toegediend), sotrovimab, tocilizumab en bamlanivimab en etesevimab samen toegediend 15,16,17,18,19. Er is momenteel slechts één door de FDA goedgekeurd profylactisch vaccin, Pfizer-BioNTech, en twee andere profylactische vaccins (Moderna en Janssen) zijn EUA goedgekeurd 20,21,22,23,24. Met de ongecontroleerde infectiegraad en de opkomst van VoC en VoI vormt SARS-CoV-2 echter nog steeds een bedreiging voor de menselijke gezondheid. Daarom zijn nieuwe benaderingen dringend nodig om efficiënte profylactica en therapeutica te identificeren om SARS-CoV-2-infectie en de nog steeds lopende COVID-19-pandemie onder controle te houden.

Het bestuderen van SARS-CoV-2 vereist moeizame technieken en secundaire benaderingen om de aanwezigheid van het virus in geïnfecteerde cellen en / of gevalideerde diermodellen van infectie te identificeren. Het gebruik van omgekeerde genetica heeft het mogelijk gemaakt om recombinante virussen te genereren om belangrijke vragen in de biologie van virale infecties te beantwoorden. Omgekeerde geneticatechnieken hebben bijvoorbeeld middelen geboden om de mechanismen van virale infectie, pathogenese en ziekte te ontdekken en te begrijpen. Evenzo hebben omgekeerde geneticabenaderingen de weg vrijgemaakt om recombinante virussen te manipuleren die geen virale eiwitten hebben om hun bijdrage aan virale pathogenese te begrijpen. Daarnaast zijn omgekeerde geneticatechnieken gebruikt om recombinante virussen te genereren die reportergenen tot expressie brengen voor in vitro en in vivo toepassingen, waaronder het identificeren van profylactische en / of therapeutische benaderingen voor de behandeling van virale infecties. Fluorescerende en bioluminescente eiwitten zijn de meest gebruikte reportergenen vanwege hun gevoeligheid, stabiliteit en eenvoudige detectie op basis van de verbetering van nieuwe technologieën25,26. In vitro is aangetoond dat fluorescerende eiwitten dienen als een betere optie voor de lokalisatie van virussen in geïnfecteerde cellen, terwijl luciferasen handiger zijn voor kwantificeringsstudies 27,28,29. In vivo hebben luciferasen de voorkeur boven fluorescerende eiwitten voor beeldvorming van hele dieren, terwijl fluorescerende eiwitten de voorkeur hebben voor de identificatie van geïnfecteerde cellen of ex vivo beeldvorming 30,31,32. Het gebruik van reporter-expresserende recombinante virussen heeft gediend als een krachtig hulpmiddel voor de studie van virussen in veel families, waaronder flavivirussen, enterovirussen, alfavirussen, lentivirussen, arenavirussen en influenzavirussen 28,33,34,35,36.

Om de behoefte aan secundaire benaderingen voor het bestuderen van SARS-CoV-2 en het karakteriseren van real-time SARS-CoV-2-infectie in vivo te overwinnen, hebben we replicatie-competente recombinant (r) SARS-CoV-2 gegenereerd die bioluminescente (nanoluciferase, Nluc) of fluorescerende (Venus) eiwitten tot expressie brengt met behulp van onze eerder beschreven bacteriële kunstmatige chromosomen (BAC) -gebaseerde omgekeerde genetica, die als een enkele kopie in E. coli worden onderhouden om de toxiciteit van virussequenties tijdens de verspreiding ervan in bacteriën tot een minimum te beperken 37,38. Met name rSARS-CoV-2/Nluc en rSARS-CoV-2/Venus vertoonden rSARS-CoV-2/WT-achtige pathogeniciteit in vivo. Het hoge niveau van Venus-expressie van rSARS-CoV-2 / Venus maakte het mogelijk om virale infectie in de longen van geïnfecteerde K18 hACE2 transgene muizen te detecteren met behulp van een in vivo beeldvormingssysteem (IVIS)39. De niveaus van Venus-expressie correleerden goed met virale titers gedetecteerd in de longen, wat de haalbaarheid aantoont van het gebruik van Venus-expressie als een geldig surrogaat van SARS-CoV-2-infectie. Met behulp van rSARS-CoV-2/Nluc konden we de dynamiek van virale infecties in realtime volgen en SARS-CoV-2-infectie in vivo longitudinaal beoordelen met dezelfde IVIS-benadering in K18 hACE2 transgene muizen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Protocollen met K18 hACE2 transgene muizen werden goedgekeurd door het Texas Biomedical Research Institute (TBRI) Institutional Biosafety Committee (IBC) en de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Alle experimenten volgen de aanbevelingen in de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren van de Nationale Onderzoeksraad40. De juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM' s) zijn vereist bij het werken met muizen.

1. Gebruik van K18 hACE2 transgene muizen

  1. Koop en onderhoud 4-6 weken oude vrouwelijke B6.Cg-Tg (K18-ACE2) 2Prlmn / J-muizen (K18 hACE2 transgene muizen) in een bioveiligheidsniveau (BSL) -2 dierverzorgingsfaciliteit onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden.
    1. Laat de dieren na aankomst in de BSL2-faciliteiten 7 dagen acclimatiseren en breng ze over naar de BSL-3-dierenfaciliteit voor infecties en andere experimentele procedures.
    2. Volg de IACUC-protocollen en plaats 4 muizen per kooi. Om ervoor te zorgen dat het dier is overleden, na muizeninfectie met rSARS-CoV-2 en in vivo beeldvorming, euthanaseer de dieren met een dodelijke dosis Fatal-Plus (>100 mg / kg).

2. Bioveiligheid

OPMERKING: In dit manuscript wordt rSARS-CoV-2 gegenereerd met behulp van de op BAC gebaseerde omgekeerde genetische systemen voor SARS-CoV-2 USA-WA1/2020-stam, zoals eerder beschreven37. Alle in vivo procedures met rSARS-CoV-2/Nluc of rSARS-CoV-2/Venus infecties moeten worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast onder BSL-3 omstandigheden.

  1. Reinig de bioveiligheidskast met 2% Wexicide en 70% Ethanol-desinfectiemiddel sequentieel voor en na het uitvoeren van alle experimentele procedures die in dit artikel worden beschreven.
  2. Steriliseer al het dissectiemateriaal (schaar, ontleedtang, enz.) en de homogenisator voor en na elk gebruik.
  3. Reinig de isolatiekamer en desinfecteer met MB10 tabletten voor en na elk gebruik volgens de instructies van de fabrikant.
  4. Gooi al het biologische materiaal weg dat is geproduceerd tijdens de procedures volgens de IBC- en IACUC-richtlijnen.

3. In vivo karakterisering van rSARS-CoV-2

  1. Muizeninfecties
    1. Plaats vrouwelijke 4-6 weken oude K18 hACE2 transgene muizen in gelabelde kooien, identificeer de muizen in elke kooi met behulp van een oorponscode en plaats 4 muizen per kooi. Gebruik een groep muizen voor lichaamsgewicht en overleving en een andere groep dieren voor virale titratie en beeldvorming.
    2. Scheer vóór infectie de borst van muizen aan de ventrale kant van de borstnippel naar het inguinale tepelgebied om het bioluminescentiesignaal te vergemakkelijken.
    3. Bereid het rSARS-CoV-2 entmateriaal met 105 plaquevormende eenheden (PFU)/muis onder steriele omstandigheden in een totaal volume van 50 μL met behulp van steriele 1x fosfaatbufferzoutoplossing (PBS).
      OPMERKING: Bereken de hoeveelheid rSARS-CoV-2 die moet worden gebruikt in de virale verdunning met de formule: virus nodig = (105 PFU per muis / 50 μL) x eindvolume) / stock virale titer.
    4. Houd het virus entmateriaal gekoeld op ijs.
    5. Gebruik de mock-geïnfecteerde (1x PBS) en rSARS-CoV-2/WT-geïnfecteerde muizen als interne controles. Plaats de nep-geïnfecteerde muizen in een aparte kooi dan rSARS-CoV-2-geïnfecteerde muizen.
    6. Verdoof de muizen met 5% isofluraan gasvormige sedatie in een anesthesiekamer en handhaaf met 3% isofluraan.
    7. Zodra de houdingsreactie en de rechtzettingsreflex zijn bevestigd, plaatst u de muis in de dorsale lighoudingspositie.
    8. Krabbel de nek van de muis tussen de wijsvinger en duim en houd de staart tegen de palm van de hand met de pink om het dier in een dorsale positie te houden.
    9. Plaats de pipetpunt met 50 μL van het virusoculum in het neusgat en werp de oplossing langzaam uit. Zorg ervoor dat het virus entmateriaal wordt ingeademd en dat er geen reflux is door de entruppel te zien verdwijnen.
  2. Bioluminescentiemonitoring K18 hACE2 transgene muizen geïnfecteerd met rSARS-CoV-2/Nluc (figuur 1 en figuur 2)
    OPMERKING: Dit experiment volgt de schematische weergave en gebruikt de virussen die in figuur 1 worden weergegeven. Een isofluraan anesthesie-bevestiging is vereist voor het in vivo beeldvormingssysteem (IVIS). Zie materiaaltabel voor meer informatie over de vereiste instrumenten en systemen.
    1. Start de beeldbewerkingssoftware en stel de parameters in, klik op de afbeeldingsmodus op Bioluminescentie, open het filter en stel de belichtingstijd in op automatisch.
    2. Plaats de muizen bij het initialiseren van de IVIS-machine in de isolatiekamer terwijl ze zich nog in de bioveiligheidskast bevinden. Induceer muizen met isofluraan in een concentratie van 5%. Zodra het verlies van de houdingsreactie en de rechtzettingsreflex is bevestigd, handhaaf dan met 3% isofluraan.
    3. Zodra muizen zijn verdoofd, verwijdert u ze uit de isolatiekamer en dient u het luciferasesubstraat verdund 1:10 in 1x PBS (laatste volume 100 μL / muis) retro-orbitaal toe met een naald van 25 G.
    4. Na toediening van luciferasesubstraat plaatst u de muizen terug in de isolatiekamer met hun borst naar boven gericht en neusholte in de spruitstukkegel om het dier verdoofd te houden tijdens de beeldvormingsprocedure.
    5. Breng de isolatiekamer over naar de IVIS-machine en selecteer onmiddellijk na het sluiten van de IVIS-imagerdeur Aanschaffen in het softwareprogramma om te initialiseren (figuur 2A).
    6. Om verkregen bioluminescentiebeelden te analyseren, gebruikt u de ROI-tool (regio van belang) in de software om het precieze signaal aan te wijzen en de flux te meten (figuur 2B).
    7. Klik op Meten en laat het systeem beginnen met het beoordelen van de bioluminescentie in fotonen om de absolute fotonenemissie te leveren die vergelijkbaar is met de outputmetingen van de verschillende parameters.
    8. Beeld muizen op 1-, 2-, 4- en 6-dagen na infectie.
    9. Plaats na beeldvorming muizen terug in de kooi.
  3. Fluorescentieanalyse bij K18 hACE2 transgene muizen geïnfecteerd met rSARS-CoV-2/Venus (figuur 3 en figuur 4)
    OPMERKING: Dit experiment volgt de schematische weergave en rSARS-CoV-2 in figuur 3. Zie materiaaltabel voor meer informatie over de vereiste instrumenten en systemen.
    1. Start de beeldvormingssoftware en stel de parameters in, stel excitatie ( 500 nm) en emissiefilters (530 nm) in, klik op de beeldmodus op Fluorescentie en stel de belichtingstijd in op automatisch.
    2. Intraperitoneale euthanasie de muizen met een dodelijke dosis Fatal-Plus (>100 mg/kg). Desinfecteer na euthanasie de incisieplaats met 70% ethanol.
    3. Trek met een pincet aan de huid, maak een incisie van het borstbeen naar de buik en knip de incisie vanaf de zijkanten met een schaar. Snijd de leverader om de hoeveelheid bloed in de longen te minimaliseren en hoge achtergrondsignalen tijdens beeldvorming te voorkomen.
    4. Knip met een schaar het borstbeen en open de ribbenkast. Knip vervolgens het uiteinde van de luchtpijp met een schaar en verwijder de longen met een pincet.
    5. Plaats de weggesneden longen in een 6-wells plaat met 2 ml 1x PBS en spoel af om overtollig bloed te verwijderen. Minimaliseer de kans op besmetting tussen monsters door chirurgische hulpmiddelen tussen monsters te desinfecteren en te reinigen met 70% ethanol.
    6. Na het initialiseren van de IVIS-machine, plaatst u de longen in een zwarte lade en scheidt u de weefsels van elkaar.
    7. Plaats de lade in de isolatiekamer in de bioveiligheidskast en breng de isolatiekamer vervolgens over naar de IVIS. Sluit de deur en klik op Acquire om het beeldvormingssysteem te starten (figuur 4A).
    8. Om fluorescentie te analyseren, gebruikt u de ROI-tool en tekent u ROI's rond elk van de individuele longen. Meet elke ROI handmatig en gebruik vervolgens de gemiddelde stralingsefficiëntiewaarden die zijn opgegeven en trek af van die van de mock-geïnfecteerde muizen (figuur 4B).
    9. Zodra de beeldvorming is voltooid, plaatst u de weefsels op ijs voor analyse op dezelfde dag of in een cryobuis voor droogijsbevriezing om op te slaan bij -80 ° C voor latere verwerking.
  4. Long bright field imaging en pathologie scoring van K18 hACE2 transgene muizen geïnfecteerd met rSARS-CoV-2/Nluc (Figuur 2A-C) en rSARS-CoV-2/Venus (Figuur 4A-C)
    1. Na beeldvorming van bioluminescentie van muizen geïnfecteerd met rSARS-CoV-2 / Nluc, rSARS-CoV-2 / WT en mock-geïnfecteerd, brengen de muizen terug naar hun kooien. Ga verder met euthanasie en de ex vivo beeldvorming van het heldere veld van muizenlongen (figuur 2A).
    2. Na beeldvorming ex vivo fluorescentie van longen van geïnfecteerde muizen, maak je bright-field beelden van de longen (figuur 4A).
    3. Analyseer de grove laesies op het oppervlak van de long met behulp van ImageJ (figuren 2C en 4C).
    4. Open het longbeeld dat moet worden geanalyseerd in ImageJ.
    5. Bereken de verhouding tussen pixel en cm, gebruik het gereedschap Recht en meet de werkelijke lengte van de afbeelding.
    6. Klik na het selecteren op Analyseren > meten om de lengte van pixels voor de lengte te berekenen.
    7. Klik op Analyse > Schaal instellen en voer de getallen in die uit de vorige stap zijn berekend.
    8. Gebruik het gereedschap Selecties uit de vrije hand en selecteer het volledige longoppervlak. Klik op Analyseren > meten om het totale longoppervlak te meten.
    9. Klik op Bewerken > selectie > Omgekeerd maken om de rest van het longgebied te selecteren en druk vervolgens op delete of backspace om de achtergrond te verwijderen.
    10. Verwijder het geselecteerde gebied en klik vervolgens op Afbeelding > > kleurdrempel aanpassen.
    11. Om het pathologische laesiegebied te selecteren, past u de helderheid aan op een minimum (tussen 1 tot 50) en een maximum (tussen 50 en 200), afhankelijk van de aanwezige niveaus van congestie en bloedingen.
    12. Zodra pathologische laesies zijn geselecteerd, klikt u op Selecteren onderaan het drempelkleurpaneel en klikt u vervolgens op Analyseren > meten om pathologische gebieden te meten.
    13. Bereken het percentage grove laesies met de formule: % van het pathologische gebied = (meting van het pathologische gebied/totaal longoppervlak) x 100.
  5. Virale titraties (figuur 2D en figuur 4D)
    1. Voltooi bij beeldvorming de euthanasie van de muizen en verzamel longen, hersenen en neusslijmvlies.
    2. Plaats de longen, hersenen en neusslijmvlies in afzonderlijke steriele weefselhomogenisatoren en voeg 1 ml koude 1x PBS toe.
    3. Homogeniseer de monsters door gedurende 10 minuten te centrifugeren bij 21.500 x g naar pelletcelresten. Verzamel en breng de supernatanten over in een nieuwe steriele buis en gooi de pellet weg.
    4. Als virale titraties dezelfde dag worden uitgevoerd, bewaar de supernatanten dan bij 4 °C. U kunt ook het supernatant van de gehomogeniseerde monsters invriezen bij -80 °C totdat het later wordt geëvalueerd.
    5. Met behulp van de supernatanten verkregen uit de weefselhomogenaten maken 10-voudige seriële verdunningen en infecteren confluente monolagen van Vero E6-cellen met 1 ml van elke verdunning van het supernatant (6-well plaatformaat, 1,2 × 106 cellen / put, drievoud).
    6. Laat het virus 1 uur adsorberen bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO2-incubator .
    7. Was na virale adsorptie de cellen met 1 ml 1x PBS en incubeer in 2 ml post-infectiemedia met 1% Agar in de bevochtigde 5% CO2-incubator bij 37 °C gedurende 72 uur.
    8. Na de incubatie inactiveer de platen in 10% neutraal gebufferd formaline gedurende 24 uur bij 4 °C, zorg ervoor dat de hele plaat wordt ondergedompeld.
    9. Haal platen uit BSL3 en was de cellen drie keer met 1 ml 1x PBS en permeabiliseer met 1 ml 0,5% Triton X-100 gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT).
    10. Blokkeer de cellen met 1 ml runderserumalbumine (BSA) in 1x PBS gedurende 1 uur bij 37 °C, gevolgd door incubatie in 1 ml 1 μg/ml van het SARS-CoV-nucleocapside (N)-eiwit cross-reactief monoklonaal antilichaam (1C7C7), verdund in 2,5% BSA gedurende 1 uur bij 37 °C.
    11. Was de cellen drie keer met 1 ml 1x PBS en ontwikkel de plaques met behulp van de ABC-kit en DAB Peroxidase Substrate-kit volgens de instructies van de fabrikant.
    12. Bereken de virale titers als PFU/ml.
      OPMERKING: Bereken met de formule PFU/ml = verdunningsfactor x aantal plaques x (1 ml/entvolume).
  6. Nluc-activiteit in weefsels van K18 hACE2 transgene muizen geïnfecteerd met rSARS-CoV-2/Nluc (Figuur 2E)
    1. Kwantificeer de aanwezigheid van Nluc in de orgaanhomogenen van mock, rSARS-CoV-2/WT en rSARS-CoV-2/Nluc geïnfecteerde K18 hACE2 transgene muizen met behulp van een luciferasetest volgens de instructies van de fabrikant.
  7. Evaluatie van morbiditeit en mortaliteit (figuur 2F, G en figuur 4E, F)
    1. Intranasaal infecteren 4-6 weken oude vrouwelijke K18 hACE2 transgene muizen met 105 PFU van rSARS-CoV-2/WT, rSARS-CoV-2/Venus, rSARS-CoV-2/Nluc, of mock-geïnfecteerd zoals beschreven in rubriek 3.1.
    2. Controleer en weeg de muizen gedurende 12 dagen tegelijkertijd om de gewichtsvariatie als gevolg van voedselinname te minimaliseren. Euthanaseer de muizen die 25% van hun oorspronkelijke lichaamsgewicht verliezen sinds ze een humaan eindpunt hebben bereikt en merk op dat deze muizen bezwijken aan een virale infectie.
    3. Na 12 dagen euthanaseer je de muizen die een virale infectie overleven en bereken je het percentage van de verandering en overleving van het lichaamsgewicht.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

rSARS-CoV-2/Nluc infectie bij K18 hACE2 transgene muizen (figuren 1 en 2)
Figuur 1A toont een schematische weergave van de rSARS-CoV-2/WT (boven) en rSARS-CoV-2/Nluc (onder) die worden gebruikt om infecties in vivo te beoordelen. Figuur 1B toont het schematische stroomschema dat wordt toegepast om de rSARS-CoV-2/Nluc-infectiedynamiek in K18 hACE2 transgene muizen te beoordelen. Vier tot ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol toont de haalbaarheid aan van het gebruik van deze rSARS-CoV-2-expressie van reportergenen om virale infecties in vivo te volgen. Beide reporter-expresserende recombinante virussen bieden een uitstekend hulpmiddel voor het bestuderen van SARS-CoV-2-infecties in vivo. De beschreven ex vivo (rSARS-CoV-2/Venus) en in vivo (rSARS-CoV-2/Nluc) beeldvormingssystemen vormen een uitstekende optie om de dynamiek van SARS-CoV-2-infectie, virale pathogenese te begrijpen en geïnfecteer...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd bij afwezigheid van enig commercieel, financieel en niet-financieel of persoonlijk belangenconflict met betrekking tot het beschreven werk.

Dankbetuigingen

We willen de leden van ons instituut (Texas Biomedical Research Institute) bedanken voor hun inspanningen om onze faciliteiten volledig operationeel en veilig te houden tijdens de COVID-19-pandemie. We willen ook onze Institutional Biosafety Committee (IBC) en spell (IACUC) bedanken voor het herzien van onze protocollen op een tijdsefficiënte manier. We bedanken Dr. Thomas Moran van de Icahn School of Medicine op de berg Sinaï voor het verstrekken van het SARS-CoV cross-reactieve 1C7C7 nucleocapsid (N) eiwit monoklonale antilichaam. SARS-CoV-2-onderzoek in het laboratorium van Martinez-Sobrido wordt momenteel ondersteund door de NIAID / NIH-subsidies RO1AI161363-01, RO1AI161175-01A1 en R43AI165089-01; het Ministerie van Defensie (DoD) verleent W81XWH2110095 en W81XWH2110103; het San Antonio Partnership for Precision Therapeutic; het Texas Biomedical Research Institute Forum; het Health Science Center van de Universiteit van Texas in San Antonio; de San Antonio Medical Foundation; en door het Center for Research on Influenza Pathogenesis and Transmission (CRIPT), een door NIAID gefinancierd Center of Excellence for Influenza Research and Response (CEIRR, contract # 75N93021C00014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.5% Triton X-100J.T.BakerX198-07Bewaar bij kamertemperatuur (RT)
1% DEAE-DextranMP Biomedicals195133
10% Formalin solution, neutral bufferedSigma-AldrichHT501128
AgarOxoidLP0028
24-well Cell Culture PlateGreiner Bio-one662160
5% Sodium bicarbonateSigma AldrichS-5761
6-well Cell Culture PlateGreiner Bio-one657160
96-well Cell Culture PlateGreiner Bio-one655-180
African green monkey kidney epithelial cells (Vero E6)ATCCCRL-1586
Ami HTSpectral Instruments Imaging
Aura Imaging Software 3.2.0Spectral Instruments ImagingBeeldanalysesoftware
Bovine Serum Albumin (BSA), 35%Sigma-AldrichA9647Bewaar bij 4 °C
Cell culture grade waterCorning25-055-CV
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)Corning Cellgro15-013-CVBewaar bij 4 °C
Anesthesia gas machineVeterinary Anesthesia Systems, Inc.VAS 2001R
Fetal Bovine Serum (FBS)Seradigm1500-050Bewaar bij -20 °C
Four- to six-week-old female K18-hACE2 transgenic miceThe Jackson Laboratory34860
Graphpad Prism Version 9.1.0GraphPad
IsofluraneBaxter1001936040Bewaar bij RT
MARS Data Analysis SoftwareBMG LABTECH
MB10 tabletsQUIP LaboratoriesMBTAB1.5Bewaar bij RT
Nano-Glo Luciferase Assay ReagentPromegaN1110Dit reagens wordt gebruikt om Nluc-activiteit te meten. Bewaar bij -20 °C
Nunc MicroWell 96-Well MicroplatesThermoFisher Scientific269620
Nunc MicroWell 96-Well MicroplatesThermoFisher Scientific269620
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100xCorning30-009-CIBewaar bij -20 °C
PHERAstar FSXBMG LABTECHPHERAstar FSX
Precelleys Evolution homogenizerBertin InstrumentsP000062-PEVO0-A
Soft tissue homogenizing CK14 – 7 mLBertin InstrumentsP000940-LYSK0-A
T75 EasYFlaskThermoFisher Scientific156499
VECTASTAIN ABC-HRP Kit, PeroxidaseVector LaboratoriesPK-4002ABC-kit en DAB Peroxidase Substraatkit

Referenties

  1. V'Kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 155-170 (2021).
  2. Pal, M., Berhanu, G., Desalegn, C., Kandi, V. Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV-2): An update. Cureus. 12 (3), 7423(2020).
  3. Su, S., et al. Epidemiology, genetic recombination, and pathogenesis of coronaviruses. Trends in Microbiology. 24 (6), 490-502 (2016).
  4. Cui, J., Li, F., Shi, Z. L. Origin and evolution of pathogenic coronaviruses. Nature Reviews Microbiology. 17 (3), 181-192 (2019).
  5. Lu, R., et al. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. Lancet. 395 (10224), 565-574 (2020).
  6. Evans, J. P., Liu, S. L. Role of host factors in SARS-CoV-2 entry. Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100847(2021).
  7. Petersen, E., et al. Comparing SARS-CoV-2 with SARS-CoV and influenza pandemics. Lancet Infectious Diseases. 20 (9), 238-244 (2020).
  8. Alfaraj, S. H., et al. Clinical predictors of mortality of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) infection: A cohort study. Travel Medicine and Infectious Disease. 29, 48-50 (2019).
  9. Harvey, W. T., et al. SARS-CoV-2 variants, spike mutations and immune escape. Nature Reviews Microbiology. 19 (7), 409-424 (2021).
  10. Dong, E., Du, H., Gardner, L. An interactive web-based dashboard to track COVID-19 in real time. Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 533-534 (2020).
  11. Bar-On, Y. M., Flamholz, A., Phillips, R., Milo, R. ARS-CoV-2 (COVID-19) by the numbers. Elife. 9, 57309(2020).
  12. Roussel, Y., et al. SARS-CoV-2: fear versus data. International Journal of Antimicrobial Agents. 55 (5), 105947(2020).
  13. Scialo, F., et al. SARS-CoV-2: One year in the pandemic. What have we learned, the new vaccine era and the threat of SARS-CoV-2 variants. Biomedicines. 9 (6), 611(2021).
  14. Coronavirus (COVID-19) update: FDA authorizes additional monoclonal antibody for treatment of COVID-19. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-authorizes-additional-monoclonal-antibody-treatment-covid-19 (2021).
  15. Dougan, M., et al. Bamlanivimab plus Etesevimab in Mild or Moderate Covid-19. New England Journal of Medicine. 385 (15), 1382-1392 (2021).
  16. Ledford, H. COVID antibody treatments show promise for preventing severe disease. Nature. 591 (7851), 513-514 (2021).
  17. Tuccori, M., et al. An overview of the preclinical discovery and development of bamlanivimab for the treatment of novel coronavirus infection (COVID-19): reasons for limited clinical use and lessons for the future. Expert Opinion on Drug Discovery. , 1-12 (2021).
  18. Phan, A. T., Gukasyan, J., Arabian, S., Wang, S., Neeki, M. M. Emergent inpatient administration of casirivimab and imdevimab antibody cocktail for the treatment of COVID-19 pneumonia. Cureus. 13 (5), 15280(2021).
  19. O'Brien, M. P., et al. Subcutaneous REGEN-COV antibody combination in early SARS-CoV-2 infection. medRxiv. , (2021).
  20. Beigel, J. H., et al. Remdesivir for the treatment of Covid-19 - Final report. New England Journal of Medicine. 383 (19), 1813-1826 (2020).
  21. Li, L., et al. Effect of convalescent plasma therapy on time to clinical improvement in patients with severe and life-threatening COVID-19: A randomized clinical trial. Journal of the American Medical Association. 324 (5), 460-470 (2020).
  22. Polack, F. P., et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 vaccine. New England Journal of Medicine. 383 (27), 2603-2615 (2020).
  23. Oliver, S. E., et al. The advisory committee on immunization practices' interim recommendation for use of Pfizer-BioNTech COVID-19 vaccine - United States, December 2020. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (50), 1922-1924 (2020).
  24. Oliver, S. E., et al. The advisory committee on immunization practices' interim recommendation for use of Janssen COVID-19 vaccine - United States, February 2021. Morbidity and Mortality Weekly Report. 70 (9), 329-332 (2021).
  25. Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210(2005).
  26. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  27. Nogales, A., et al. A novel fluorescent and bioluminescent bireporter Influenza A Virus to evaluate viral infections. Journal of Virology. 93 (10), 00032(2019).
  28. Nogales, A., et al. Replication-competent fluorescent-expressing influenza B virus. Virus Research. 213, 69-81 (2016).
  29. Welsh, D. K., Noguchi, T. Cellular bioluminescence imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (8), (2012).
  30. Tran, V., Moser, L. A., Poole, D. S., Mehle, A. Highly sensitive real-time in vivo imaging of an influenza reporter virus reveals dynamics of replication and spread. Journal of Virology. 87 (24), 13321-13329 (2013).
  31. Schoggins, J. W., et al. Dengue reporter viruses reveal viral dynamics in interferon receptor-deficient mice and sensitivity to interferon effectors in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14610-14615 (2012).
  32. Luker, G. D., et al. Noninvasive bioluminescence imaging of herpes simplex virus type 1 infection and therapy in living mice. Journal of Virology. 76 (23), 12149-12161 (2002).
  33. Li, X., et al. Development of a rapid antiviral screening assay based on eGFP reporter virus of Mayaro virus. Antiviral Research. 168, 82-90 (2019).
  34. Kirui, J., Freed, E. O. Generation and validation of a highly sensitive bioluminescent HIV-1 reporter vector that simplifies measurement of virus release. Retrovirology. 17 (1), 12(2020).
  35. Shang, B., et al. Development and characterization of a stable eGFP enterovirus 71 for antiviral screening. Antiviral Research. 97 (2), 198-205 (2013).
  36. Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening. Antiviral Research. 91 (1), 11-19 (2011).
  37. Ye, C., et al. Rescue of SARS-CoV-2 from a single bacterial artificial chromosome. mBio. 11 (5), 02168(2020).
  38. Avila-Perez, G., Park, J. G., Nogales, A., Almazan, F., Martinez-Sobrido, L. Rescue of recombinant Zika virus from a bacterial artificial chromosome cDNA clone. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59537(2019).
  39. Chiem, K., et al. A bifluorescent-based assay for the identification of neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 variants of concern in vitro and in vivo. Journal of Virology. , (2021).
  40. Committee for the update of the guide for the care and use of laboratory animals., Institute for laboratory animal research (U.S) & National Academies Press (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. 8th edn. National Research Council (US). , National Academies Press. (2011).
  41. Ye, C., et al. Analysis of SARS-CoV-2 infection dynamic in vivo using reporter-expressing viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

SARS CoV 2 infectieK18 hACE2 muizenreporter SARS CoV 2bioluminescentie imagingfluorescentie imagingvirale kwantificatievirale trackingin vivo imagingvirale replicatie
Live beeldvorming en kwantificering van virale infectie bij K18 hACE2 transgene muizen met reporter-expressing recombinant SARS-CoV-2
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.