Een muismodel van ernstige acute pancreatitis wordt hierin beschreven. De hier gepresenteerde procedure is zeer snel, eenvoudig en toegankelijk, waardoor de studie van de moleculaire mechanismen en verschillende therapeutische interventies bij acute pancreatitis op een handige manier mogelijk is.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Vaststelling van een muis ernstig acuut pancreatitismodel met behulp van retrograde injectie van natrium taurocholaat in het biliopancreatische kanaal
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De prevalentie van acute pancreatitis (AP), met name ernstige acute pancreatitis (SAP), neemt jaarlijks toe in jongere leeftijdsgroepen. Er is echter een gebrek aan effectieve behandelingen in de huidige klinische praktijk. Met de gemakkelijke toegankelijkheid van transgene en knock-out stammen en hun kleine formaat, waardoor minimale doses geneesmiddelen nodig zijn voor in vivo evaluatie, heeft een goed ingeburgerd experimenteel model bij muizen de voorkeur voor AP-onderzoek. Bovendien is SAP geïnduceerd door natrium taurocholaat (TC) momenteel een van de meest gebruikte en best gekarakteriseerde modellen. Dit model is onderzocht op nieuwe therapieën en mogelijke moleculaire gebeurtenissen tijdens het proces van AP. Hier presenteren we de generatie van een AP-muismodel met natrium taurocholaat en een eenvoudige zelfgemaakte microsyringe. Bovendien bieden we ook de methodologie voor de daaropvolgende histologie en serologische testen.
Inleiding
Acute pancreatitis (AP) is een acute ontsteking van de pancreas die wordt gekenmerkt door obstructie van het hoofdkanaal van de pancreas met daaropvolgende ductale opgezette en pancreasautodigestie door de abnormaal geactiveerde enzymen. De klinische manifestaties omvatten lokale of systemische ontsteking, buikpijn en verhoging van serum amylase1,2. Volgens de ernstclassificatie3 kan AP aanwezig zijn in milde, matige en ernstige vormen, en onder hen is ernstige acute pancreatitis (SAP) de meest zorgwekkende aandoening vanwege het hoge sterftecijfer van meer dan 30% 4. In de Verenigde Staten is AP een van de meest voorkomende redenen voor ziekenhuisopname, die meer dan 200.000 patiënten treft5. Bovendien neemt AP, met name SAP, jaarlijks toe en treft het jongere leeftijdsgroepen6. Er is echter een gebrek aan effectieve behandelingsopties in de huidige klinische praktijk6,7. Daarom is het noodzakelijk om de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij AP te onderzoeken, waardoor de behandelingsverbetering wordt vergemakkelijkt.
Gevestigde experimentele diermodellen zijn nodig voor het bestuderen van de mechanismen die betrokken zijn bij AP en het evalueren van de effectiviteit van verschillende behandelingsmodaliteiten. Met de gemakkelijke toegankelijkheid van transgene en knock-out stammen en hun kleine formaat, waardoor de doses geneesmiddelen die nodig zijn voor in vivo evaluatie worden geminimaliseerd, hebben muizen de voorkeur voor AP-onderzoek. Daarom zijn er verschillende modellen van AP ontwikkeld bij muizen8,9.
Op basis van een mild pancreatitis rattenmodel geïnduceerd door de intraveneuze toediening van caerulein10, ontwikkelden Niederau et al. een SAP-muismodel gepresenteerd met acinaire celnecrose geïnduceerd met behulp van hetzelfde medicijn en dezelfde injectieroute11. Hoewel dit model verschillende voordelen heeft, waaronder niet-invasieve aanwezigheid, snelle inductie, brede reproduceerbaarheid en toepasbaarheid, is het grote nadeel dat in de meeste gevallen slechts een milde vorm van AP wordt ontwikkeld, waardoor de klinische relevantie ervan wordt beperkt. Alcohol wordt beschouwd als een van de belangrijkste etiologische factoren van AP; Foitzik et al. meldden echter dat het alleen pancreasbeschadiging veroorzaakt in combinatie met andere factoren, zoals exocriene hyperstimulatie12. Bovendien, hoewel alcohol-geïnduceerde AP-modellen ontwikkeld via verschillende toedieningsroutes en medicijndoses zijn gemeld13,14,15, is hun grootste nadeel de moeilijkheid om ze te reproduceren. Intraperitoneale toediening van L-arginine kan ook AP induceren bij muizen16; de lage klinische relevantie belemmert echter de toepassing ervan. Taurocholaat, een galzout, werd voor het eerst voorgesteld door Creutzfeld et al. in 1965 voor het induceren van een aandoening die lijkt op menselijk AP via pancreaskanaalinfusie17. Hoewel er controverses bestaan over de klinische relevantie ervan in de pathofysiologie18,19, blijft taurocholaat-geïnduceerde pancreatitis een onmisbaar model voor SAP.
Omdat dit model eenvoudig te realiseren is en ook effectief is bij muizen, is het nu een van de meest gebruikte AP-modellen voor in vivo studies bij kleine dieren. Perides et al. gebruikten natrium taurocholaat (TC) om SAP te induceren bij muizen20, wat inzichten verschafte om de pathologie ervan te begrijpen. In combinatie met genetische modificatietechnieken heeft dit model ons in staat gesteld om verschillende specifieke genen die betrokken zijn bij AP te bevestigen. Bicozo et al. toonden bijvoorbeeld aan dat een knock-out van het CD38-gen beschermde tegen een model van TC-infusie pancreatitis en schreef de mechanismen toe aan veranderingen in intracellulaire Ca2 + -signalering21. Fanczal et al. onderzochten de fysiologische implicatie van TRPM2-expressie in het plasmamembraan van pancreasacinar- en ductale cellen van muizen en toonden een verminderde ernst van TC-geïnduceerde SAP aan bij TRPM2 knock-out muizen22. Bovendien biedt dit model ook een eenvoudige en effectieve manier om veel nieuwe geneesmiddelen in vivo te testen. Deze methode maakte bijvoorbeeld validatie mogelijk van de therapeutische effecten van cafeïne23, dehydrocholzuur24 en verschillende antioxidanten en anticoagulantia25,26. Dit bewijs toont de veelzijdigheid van het TC-geïnduceerde SAP-model. Hoewel Wittel et al. een vergelijkbaar muismodel27 beschreven, zou een gebrek aan details over de implementatieprocedures kunnen leiden tot een onvermogen om de bevindingen te reproduceren. In dit artikel richten we ons op methoden met behulp van een eenvoudige zelfgemaakte microsyringe en bestuderen we TC-geïnduceerde SAP, waardoor we niet alleen mogelijke richtlijnen bieden voor verdere studie van de pathogenese en behandeling van AP, maar ook voor een perfect aanpasbare experimentele methode voor vele andere stoffen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimenten met dieren werden goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van soochow University. Alle chirurgische ingrepen werden uitgevoerd onder volledige anesthesie. Pijnstillers werden volgens eerdere literatuur niet gebruikt om interferentie met het natuurlijke verloop van de ziekte te voorkomen28,29. Goedkeuring voor het ontbreken van analgesie werd ook verleend door de Animal Ethics Committee van Soochow University.
1. Voorbereiding
- Snel een C57BL/6 wild-type muis 8-12 uur voor de operatie.
- Bereid 5% (w/v) TC-oplossing (93 mM) verdund tot 0,9% natriumchloride. Filtreer de oplossing door een filter van 0,22 μm.
- Autoclaaf de chirurgische instrumenten en materialen, waaronder een tang, schaar, meshouder, naaldhouder, hemostatische clip, vaatklemmen en steriele gordijnen, met behulp van een druksterilisator bij een temperatuur van 121 °C gedurende 30 minuten.
- Bereid een zelfgemaakte microsyringe. Installeer hiervoor handmatig een wegwerp insulinetip en een verlengde plastic pipetpunt op een microliterspuit met platte punt van 25 μL. Steriliseren door bestraling.
2. Anesthesie en preoperatieve voorbereiding
- Weeg 6- tot 8 weken oude mannelijke C57BL / 6 wild-type muizen (ongeveer 21-23 g). Induceer algemene anesthesie met een intraperitoneale injectie van 1% pentobarbitale natriumoplossing in een dosis van 50 mg / kg.
- Bevestig de muis in rugligging op een vlakke plaat van bestraald hoornvlies met de tape.
- Bereid het operatiegebied van elk dier voor door zijn vacht te verwijderen met een ontharen crème van het xiphoid-procesniveau tot aan de verbindingslijn van de bilaterale voorste superieure iliacale wervelkolom, met de linker- en rechterkant evenwijdig aan de voorste oksellijn.
- Bereid een steriel chirurgisch veld voor met bijzondere aandacht voor het chirurgische gebied, bestaande uit het gebied dat op het dier en de voorkant van de chirurg is voorbereid.
- Desinfecteer het tafelblad.
- Reinig de incisieplaats met meerdere toepassingen van chirurgische scrub-oplossing. Veeg de huid twee tot drie keer af met 0,5% jodofor en laat het elke keer 1-2 minuten drogen.
- Bedek de muis met steriele gordijnen.
3. Chirurgische ingreep
OPMERKING: Figuur 1 toont de anatomie en morfologie van de alvleesklier van de muis voor en na retrograde injectie van TC in het biliopancreatische kanaal door micro-injectie.
- Maak een ongeveer 2 tot 3 cm lange mediane abdominale incisie.
- Lokaliseer de twaalfvingerige darm van links naar rechts langs de maag. Trek de twaalfvingerige darm voorzichtig naar buiten en naar de linkerkant met behulp van een chirurgische tang en een met ontsmettingsmiddel doordrenkt wattenstaafje om de alvleesklier, het biliopancreatische kanaal en de duodenale papilla bloot te leggen. Zorg ervoor dat u de darmwand of gerelateerde bloedvaten niet verwondt.
- Gebruik 8-0 hechtingen om door de verbinding tussen de twaalfvingerige darm en de alvleesklier rond de papilla te gaan en trek ze naar de linkerkant van het muizenlichaam om de twaalfvingerige darm te fixeren.
- Trek de huid en de onderrand van de lever voorzichtig opzij. Klem het gemeenschappelijke leverkanaal vast en zorg ervoor dat u de poortader of pancreas niet klemt. Klem het proximale biliopancreatische kanaal vast.
- Prik de micro-injector retrograde in het distale biliopancreatische kanaal. Bevestig de naaldpunt in de buurt van de papilla van de twaalfvingerige darm met een klem. Infundeer 10 μL van 5% TC in de pancreaskanalen met een snelheid van 5 μL / min.
- Houd het biliopancreatische kanaal gedurende 5 minuten gesloten om een stabiele druk te bereiken. Trek vervolgens de micro-injector eruit en verwijder de klemmen.
- Herstel de twaalfvingerige darm naar de oorspronkelijke anatomische positie en controleer de bloeding.
- Sluit de wond met 6-0 hechtingen en desinfecteer met 0,5% jodofor.
4. Herstel en postoperatief beheer
- Herstel de dieren van de anesthesie op een thermische pad van 37 °C. Stuur de geopereerde dieren niet naar de tijdelijke postoperatieve ruimte totdat alle dieren wakker zijn geworden.
- Dien 0,8 ml van 0,9% zoutoplossing subcutaan en langzaam toe voor vochtsuppletie.
- Controleer de dieren postoperatief op hun algemene toestand en tekenen van infecties of ziekte.
5. Serologisch testen en histologische evaluatie
- Verdoven de muizen 24 uur na de operatie met pentobarbitaalnatrium met dezelfde dosis en injectieroute.
- Verzamel al het bloed uit de abdominale aorta (ongeveer 0,8 ml per muis) en draai gedurende 15 minuten op 1.500 x g om het serum te isoleren voor verder onderzoek.
- Verzamel de weefsels van de alvleesklier.
- Open de thoracale holte om de longweefsels te verzamelen.
- Meet de biochemische functie-indexen van het serum, waaronder amylase, lipase, leverfunctie (alaninetransaminase (ALT) en aspartaattransaminase (AST)) en nierfunctie (ureum en creatine), met behulp van commerciële kits volgens de instructies van de fabrikant.
- Homogeniseer de long- en pancreasweefsels en meet het myeloperoxidase (MPO) -niveau met behulp van een commerciële kit volgens de instructies van de fabrikant.
- Open de thoracale holte en perfundeer tweemaal met 20 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en verzamel vervolgens de alvleesklier. Dompel onder in 4% paraformaldehyde-oplossing gedurende 24 uur. Uitdrogen in een reeks alcoholconcentraties en inbedden in paraffine.
- Gebruik een microtoom om 5 μm dikke pancreasweefselsecties te bereiden.
- Voer H & E-kleuring uit voor histologische evaluatie van de pancreas.
- Evalueer de pathologische scores volgens de criteria voorgesteld door Schmidt et al.30.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Door de bovenstaande instructies zorgvuldig op te volgen, verkregen we een gemiddelde operatieduur van ongeveer 40 minuten. De muizen waren licht inactief en hadden ongeveer 0,5-1,75 g, 0,85-1,85 g en 0,5-4,73 g gewicht verloren na respectievelijk 24 uur, 48 uur en 72 uur na de operatie (figuur 2).
Vanaf het moment van voltooiing van de operatie tot 24 uur na de operatie, naarmate de ziekte zich ontwikkelde, werden de muizen inactief en vertoonden ze langzame reac...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het TC-geïnduceerde SAP-model is een uitstekend onderzoeksinstrument. Zoals in deze studie is aangetoond, is dit model zeer gemakkelijk te realiseren in algemene laboratoria zonder specifieke apparaten te gebruiken. Bij gebruik in combinatie met histologie en biochemische analyse biedt het een kostenbesparende (goedkope reagentia) en tijdbesparende (24-uurs tijdvenster) benadering voor het induceren en evalueren van AP. Het aanpassen van de concentratie van TC biedt ook de mogelijkheid om milde en matige AP te produceren...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dankbetuigingen
We zijn dankbaar voor de steun van de volgende beurzen: een Translational Research Grant van NCRCH [2020WSA01], een KJXW Scientific Grant van Suzhou Commission of Health for Young Scholars [KJXW2020002], een Science and Technology Plan van Suzhou City (SKY2021038 en SKJY2021050), een beurs van de Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD), en een Primary Research & Social Development Plan van de provincie Jiangsu (BE2018659).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.5% iodofoor | Shanghai Likang Disinfectant | 310102 | 4 mL/muis |
| 0.9% natriumchloride | Sinopharm Group Co., Ltd. | 10019318 | 0.8 mL/muis |
| 1% Pentobarbital natrium | Sigma | P3761 | 0.2 -0.25 mL/muis |
| 25 μL Microlietere spuit met platte punt | Gaoge, Shanghai | A124019 | |
| 4% Paraformaldehyde | Beyotime, Nantong, China | P0099-500ml | |
| 5% natrium taurocholaat (TC) | Aladdin | S100834-5g | 10 μL/SAP muis |
| 6-0 Sterile nylon microsuture met gedraaide naald (1/2 cirkel) | Cheng-He | 20093 | |
| 75% alcohol | Sinopharm Group Co., Ltd. | 10009218 | 4 mL/muis |
| 8-0 Sterile nylon microsuture met gedraaide naald (3/8 cirkel) | Cheng-He | 19064 | |
| ALT Activiteitskit | EPNK, Anhui, China | ALT0012 | |
| Amylase Activiteitskit | EPNK, Anhui, China | AMY0012 | |
| Gekantelte kleine bulldogklem met 12 mm kaak (3 cm) | Cheng-He | HC-X022 | |
| Espen spaanders of snippers voor muisbed | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology | VR03015 | |
| AST Activiteitskit | EPNK, Anhui, China | AST0012 | |
| Blood Urea Nitrogen (BUN) Activiteitskit | EPNK, Anhui, China | BUN0011 | |
| C57BL/6 muis | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology | 213 | |
| Creatine Activiteitskit | EPNK, Anhui, China | CRE0012 | |
| Feature microtoomblad | Beyotime, Nantong, China | E0994 | |
| Hemostatische pincet (9,5 cm, gebogen) | JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd. | JC3901 | |
| Lipase Activiteitskit | Jiancheng, Nanjing, China | A054-2-1 | |
| Microtoom | Leica biosystem, Duitsland | RM2245 | |
| Mindray biochemische analyzer | Mindray, Shenzhen, China | BS-420 | |
| MPO Activiteitskit | Jiancheng, Nanjing, China | A044-1-1 | |
| Normaal muisvoer | Trophic, Nantong, China | LAD 1000 | |
| Fosfaat gebufferde zoutoplossing | Beyotime, Nantong, China | C0221A | |
| Rechte micro-bulldogklem met 5 mm kaak (1,5 cm) | JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd. | W40130 | |
| Rechte of gebogen pincet (11,0 cm) | Cheng-He | HC-X091A of HC-X090A | |
| Rechte schaar (10,0 cm) | Cheng-He, Ningbo, China | HC-J039102 | |
| Thermo Scientific Centrifuge | Thermo Scientific, USA | Multifuge X1R |
Referenties
- Lee, P. J., Papachristou, G. I. New insights into acute pancreatitis. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (8), 479-496 (2019).
- Mandalia, A., Wamsteker, E. J., DiMagno, M. J. Recent advances in understanding and managing acute pancreatitis. F1000Research. 7, 959(2018).
- Banks, P. A., et al. Classification of acute pancreatitis-2012: revision of the Atlanta classification and definitions by international consensus. Gut. 62 (1), 102-111 (2013).
- Munir, F., et al. Advances in immunomodulatory therapy for severe acute pancreatitis. Immunology Letters. 217, 72-76 (2020).
- Peery, A. F., et al. Burden of gastrointestinal disease in the United States: 2012 update. Gastroenterology. 143 (5), 1179-1187 (2012).
- Hines, O. J., Pandol, S. J. Management of severe acute pancreatitis. BMJ. 367, 6227(2019).
- James, T. W., Crockett, S. D. Management of acute pancreatitis in the first 72 hours. Current Opinion in Gastroenterology. 34 (5), 330-335 (2018).
- Silva-Vaz, P., et al. Murine models of acute pancreatitis: a critical appraisal of clinical relevance. International Journal of Molecular Sciences. 20 (11), 2794(2019).
- Hyun, J. J., Lee, H. S. Experimental models of pancreatitis. Clinical Endoscopy. 47 (3), 212-216 (2014).
- Renner, I. G., Wisner, J. R., Rinderknecht, H. Protective effects of exogenous secretin on ceruletide-induced acute pancreatitis in the rat. Journal of Clinical Investigation. 72 (3), 1081-1092 (1983).
- Niederau, C., Ferrell, L. D., Grendell, J. H. Caerulein-induced acute necrotizing pancreatitis in mice: protective effects of proglumide, benzotript, and secretin. Gastroenterology. 88 (5), 1192-1204 (1985).
- Foitzik, T., et al. Exocrine hyperstimulation but not pancreatic duct obstruction increases the susceptibility to alcohol-related pancreatic injury. Archives in Surgery. 129 (10), 1081-1085 (1994).
- Schneider, L., Dieckmann, R., Hackert, T., Gebhard, M. M., Werner, J. Acute alcohol-induced pancreatic injury is similar with intravenous and intragastric routes of alcohol administration. Pancreas. 43 (1), 69-74 (2014).
- Huang, W., et al. Fatty acid ethyl ester synthase inhibition ameliorates ethanol-induced Ca2+-dependent mitochondrial dysfunction and acute pancreatitis. Gut. 63 (8), 1313-1324 (2014).
- Sun, J., et al. NRF2 mitigates acute alcohol-induced hepatic and pancreatic injury in mice. Food and Chemical Toxicology. 121, 495-503 (2018).
- Kui, B., et al. New insights into the methodology of L-arginine-induced acute pancreatitis. PLoS One. 10 (2), 0117588(2015).
- Creutzfeldt, W., Schmidt, H., Horbach, I. Studies on the effects of a trypsin inhibitor (Trasylol) on Enzyme activities and morphology in taurocholate and calciphylaxis pancreatitis of the rat (a contribution to the pathogenesis of pancreatitis). Klin Wochenschr. 43, 15-22 (1965).
- Liu, Z. H., et al. A simple taurocholate-induced model of severe acute pancreatitis in rats. World Journal of Gastroenterology. 15 (45), 5732-5739 (2009).
- Cavdar, F., et al. Controversial issues in biliary pancreatitis: when should we perform MRCP and ERCP. Pancreatology. 14 (5), 411-414 (2014).
- Perides, G., van Acker, G. J., Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct. Nature Protocols. 5 (2), 335-341 (2010).
- Orabi, A. I., et al. Cluster of differentiation 38 (CD38) mediates bile acid-induced acinar cell injury and pancreatitis through cyclic ADP-ribose and intracellular calcium release. Journal of Biological Chemistry. 288 (38), 27128-27137 (2013).
- Fanczal, J., et al. TRPM2-mediated extracellular Ca(2+) entry promotes acinar cell necrosis in biliary acute pancreatitis. Journal of Physiology. 598 (6), 1253-1270 (2020).
- Huang, W., et al. Caffeine protects against experimental acute pancreatitis by inhibition of inositol 1,4,5-trisphosphate receptor-mediated Ca2+ release. Gut. 66 (2), 301-313 (2017).
- Zhang, X., et al. Dehydrocholic acid ameliorates sodium taurocholate-induced acute biliary pancreatitis in mice. Biology and Pharmaceutical Bulletin. 43 (6), 985-993 (2020).
- Hagiwara, S., et al. Antithrombin III prevents cerulein-induced acute pancreatitis in rats. Pancreas. 38 (7), 746-751 (2009).
- Hagiwara, S., et al. Danaparoid sodium prevents cerulein-induced acute pancreatitis in rats. Shock. 32 (1), 94-99 (2009).
- Wittel, U. A., et al. Taurocholate-induced pancreatitis: a model of severe necrotizing pancreatitis in mice. Pancreas. 36 (2), 9-21 (2008).
- Barlass, U., et al. Morphine worsens the severity and prevents pancreatic regeneration in mouse models of acute pancreatitis. Gut. 67 (4), 600-602 (2018).
- Wu, D., et al. A systematic review of NSAIDs treatment for acute pancreatitis in animal studies and clinical trials. Clinical Research in Hepatology and Gastroenterology. 44, 100002(2020).
- Schmidt, J., et al. A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy. Annals in Surgery. 215 (1), 44-56 (1992).
- Junyuan, Z., et al. Quercetin protects against intestinal barrier disruption and inflammation in acute necrotizing pancreatitis through TLR4/MyD88/p38MAPK and ERS inhibition. Pancreatology. 18 (7), 742-752 (2018).
- Waldron, R. T., et al. The Orai Ca(2+) channel inhibitor CM4620 targets both parenchymal and immune cells to reduce inflammation in experimental acute pancreatitis. Journal of Physiology. 597 (12), 3085-3105 (2019).
- Petersen, O. H., Gerasimenko, J. V., Gerasimenko, O. V., Gryshchenko, O., Peng, S. The roles of calcium and ATP in the physiology and pathology of the exocrine pancreas. Physiological Reviews. 101 (4), 1691-1744 (2021).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
