Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Injectie van van varkensweefsel afgeleide stromacellen via waterstraaltechnologie

1.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63132

⸱

23 november 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Urology, University Hospital Tübingen, 2Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital Tübingen, 3ERBE Elektromedizin GmbH Tübingen

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

We presenteren een methode van celinjectie via naaldvrije waterstraaltechnologie in combinatie met een vervolg op onderzoeken na toediening in termen van cellulaire levensvatbaarheid, proliferatie en elasticiteitsmetingen.

Samenvatting

Urine-incontinentie (UI) is een veel voorkomende aandoening die wordt gekenmerkt door het tekort aan de urethrale sluitspier. Regeneratieve geneeskunde takken, met name celtherapie, zijn nieuwe benaderingen om de urethrale sluitspierfunctie te verbeteren en te herstellen. Hoewel injectie van actieve functionele cellen routinematig wordt uitgevoerd in klinische omgevingen met naald en spuit, hebben deze benaderingen aanzienlijke nadelen en beperkingen. In deze context is naaldvrije waterstraaltechnologie (WJ) een haalbare en innovatieve methode die levensvatbare cellen kan injecteren door visueel geleide cystoscopie in de urethrale sluitspier. In de huidige studie gebruikten we WJ om van varkensweefsel afgeleide stromale cellen (pADSCs) af te leveren in cadaveric urethraal weefsel en onderzochten vervolgens het effect van WJ-afgifte op celopbrengst en levensvatbaarheid. We beoordeelden ook de biomechanische kenmerken (d.w.z. elasticiteit) door atomaire krachtmicroscopie (AFM) metingen. We toonden aan dat door WJ geleverde pADSC's significant verminderd waren in hun cellulaire elasticiteit. De levensvatbaarheid was aanzienlijk lager in vergelijking met controles, maar ligt nog steeds boven de 80%.

Inleiding

Urine-incontinentie (UI) is een wijdverspreide aandoening met een prevalentie van 1,8 - 30,5% in Europese populaties1 en wordt voornamelijk gekenmerkt door slecht functioneren van de urethrale sluitspier. Vanuit een klinisch perspectief wordt chirurgische behandeling vaak aangeboden aan patiënten wanneer conservatieve therapieën of fysiotherapie er niet in slagen om de opkomende symptomen aan te pakken en te verlichten.

Celtherapie voor het potentiële regeneratieve herstel van de sfinctercomplexstoring is in opkomst als een avant-gardistische benadering voor de behandeling van UI-pathologie 2,3. De belangrijkste doelen zijn het vervangen, repareren en herstellen van de biologische functionaliteit van het beschadigde weefsel. In diermodellen voor UI heeft stamceltransplantatie veelbelovende resultaten laten zien in urodynamische uitkomsten 2,4,5. Stamcellen ontstaan als optimale cellulaire kandidaten omdat ze het vermogen hebben om zelfvernieuwing en multipotente differentiatie te ondergaan, waardoor de aangetaste weefselregeneratiewordt bevorderd 6. Ondanks het aanstaande regeneratieve potentieel, blijft het praktische gebruik van celtherapie belemmerd, aangezien minimaal invasieve toediening van cellen nog steeds voor verschillende uitdagingen staat met betrekking tot de injectieprecisie en dekking van het doelwit. Hoewel de huidige aanpak die wordt gebruikt voor celafgifte injectie via een naald-spuitsysteem7 is, resulteert dit meestal in een algemeen tekort aan levensvatbare cellen, met gerapporteerde levensvatbaarheden zo laag als 1% - 31% na transplantatie8. Bovendien is aangetoond dat celafgifte via naaldinjectie ook van invloed is op de plaatsing, de retentiesnelheid en de distributie van getransplanteerde cellen in het beoogde weefsel 9,10,11. Een haalbare, nieuwe aanpak die de bovengenoemde beperking overwint, is de naaldvrije celafgifte via waterstraaltechnologie.

Waterjet (WJ) technologie is in opkomst als een nieuwe aanpak die een hoge doorvoer levering van cellen door cystoscoop onder visuele controle in de urethrale sluitspier 12,13 mogelijk maakt. De WJ maakt celafgifte mogelijk bij verschillende drukken (E = effecten in bar) variërend van E5 tot E8013. In de eerste fase (weefselpenetratiefase) wordt isotone oplossing toegepast met hoge druk (d.w.z. E60 of E80) om de extracellulaire matrix rond het beoogde weefsel los te maken en kleine onderling verbonden microlacunes te openen. In de tweede fase (de injectiefase) wordt de druk binnen milliseconden verlaagd (d.w.z. tot E10) om de cellen voorzichtig in het beoogde weefsel af te leveren. Na deze toepassing in twee stappen worden de cellen niet blootgesteld aan extra druk tegen het weefsel wanneer ze worden uitgeworpen, maar zweven ze in een lagedrukstroom in een met vloeistof gevuld caverneus gebied13. In een ex vivo modelsetting waarbij stamcellen via WJ in cadaveric urethraweefsel werden geïnjecteerd, konden levensvatbare cellen daarna worden geaspireerd en uit het weefsel worden gehaald en in vitro verder worden uitgebreid 13. Hoewel een studie uit 2020 door Weber et al. de haalbaarheid en toepasbaarheid van WJ aantoonde om voetafdrukvrije cardiomyocyten in hetmyocardium 14 te leveren, moet er rekening mee worden gehouden dat de WJ-technologie zich nog in een prototypefase bevindt.

Het volgende protocol beschrijft hoe varkens vetweefsel-afgeleide stromale cellen (pADSC) kunnen worden voorbereid en gelabeld en hoe ze kunnen worden afgeleverd in vanvangvloeistof en kadaverweefsel via WJ-technologie en Williams cystoscopienaalden (WN). Na cellulaire injectie wordt de cellulaire vitaliteit en elasticiteit via atomaire krachtmicroscopie (AFM) beoordeeld. Via stapsgewijze instructies geeft het protocol een duidelijke en beknopte aanpak om betrouwbare gegevens te verkrijgen. Het discussiegedeelte presenteert en beschrijft de belangrijkste voordelen, beperkingen en toekomstperspectieven van de techniek. De WJ-levering van cellen en de sequela-posttransformatieanalyses die hier worden gerapporteerd, vervangen de standaard naaldinjectie en bieden een solide celafgiftekader voor regeneratieve genezing van het doelweefsel. In onze recente studies leverden we bewijs dat WJ cellen nauwkeuriger en ten minste met een vergelijkbare levensvatbaarheid afleverde in vergelijking met naaldinjecties15,16.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De vetweefselmonsters van varkens werden verkregen van het Instituut voor Experimentele Chirurgie van de Universiteit van Tübingen. Alle procedures werden goedgekeurd door lokale dierenwelzijnsautoriteiten onder het dierproefnummer CU1/16.

1. Isolatie van van vetweefsel afgeleide stromale cellen van varkens

  1. Gebruik vetweefsel van varkens dat door het Instituut voor Experimentele Chirurgie in een centrifugebuis van 50 ml naar het laboratorium wordt gebracht.
  2. Breng het weefsel over in een steriel petrischaaltje onder de steriele bank en hak het met twee scalpels (nr. 10) in kleine fragmenten en brij.
    OPMERKING: Een schaar kan ook worden gebruikt om kleine fragmenten te krijgen. Hoe kleiner de fragmenten zijn, hoe beter voor de volgende spijsvertering.
    1. Breng de kleine fragmenten/brij over in een centrifugebuis van 50 ml en incubeer deze gedurende 30 minuten bij 37 °C op een schudder met 5 ml homogenisatoroplossing. De homogenisatoroplossing is PBS met 1% runderserumalbumine (BSA) (stamoplossing: 1 % (w/v) BSA in PBS) en 0,1% collagenase type I.
      OPMERKING: Bereid de homogenisatoroplossing altijd vers voor. De shaker heeft een cirkelvormige schudbeweging bij een lage snelheid van 25-500 tpm.
  3. Om de incubatie te stoppen, voegt u 10 ml groeimedia toe [Dulbecco's Modified Eagle's Medium - low glucose (DMEM-LG), 2,5% HEPES natriumzoutoplossing (1 M), 10% foetaal runderserum (FBS), 1% L-glutamin (200 mM), 1% penicilline-streptomycine (10000 U / ml penicilline; 10.000 μg / ml streptomycine) en 1% amfotericine B (250 μg / ml)].
    OPMERKING: Groeimedia kunnen van tevoren worden voorbereid. Antibiotica en antischimmelmiddelen zijn nodig bij de bereiding van de groeimedia voor celkweek om cellen te beschermen tegen besmettingen.
  4. Incubeer de centrifugebuizen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Zuig de fractie op met adipocyten, die lichter is en daarom bovenop de vloeistof zwemt, met een pipet van 10 ml en gooi deze weg.
  6. Filtreer de resterende stromale fractie door een celzeef van 100 μm met een polyethyleentereftalaat (PET) membraan vrij van zware metalen om vetweefselfragmenten tegen te houden en alleen de celsuspensie op te halen.
  7. Centrifugeer de gefilterde celsuspensie gedurende 7 minuten bij 630 x g bij kamertemperatuur.
  8. Resuspend de celkorrel in 2 ml PBS om de cellen eenmaal te wassen.
  9. Centrifugeer de celsuspensie opnieuw gedurende 7 minuten bij 630 x g bij kamertemperatuur.
  10. Na centrifugeren en herhaalde resuspensie van de celkorrel in 10 ml groeimedia per kolf, zaadcellen in 75 cm2 celkweekkolven.
    OPMERKING: Afhankelijk van de grootte van de celkorrel na de wasstap met PBS, zaadcellen in één tot vier kolven.

2. Celkweek van van vetweefsel afgeleide stromale cellen van varkens

  1. Oogst en passeer cellen wanneer ze 70% samenvloeiing bereiken.
  2. Was cellen tweemaal met 10 ml PBS en aspirateer PBS volledig.
    OPMERKING: Deze stap is nodig om resterende groeimedia te verwijderen, die worden aangevuld met 10% FBS. FBS heeft verschillende proteaseremmers die de functie van de volgende trypsinisatie kunnen belemmeren.
  3. Voeg 3 ml 0,05%-Trypsine-EDTA per kolf toe om de cellen los te maken.
  4. Incubeer kolven gedurende 3 min bij 37 °C.
  5. Controleer onder de microscoop of cellen zijn losgemaakt.
    OPMERKING: Soms duurt het wat meer tijd om de cellen los te maken. In dit geval incubeer kolven gedurende maximaal 5 minuten bij 37 °C.
  6. Om het incubatie- en losmaakproces te stoppen, voegt u 3 ml groeimedia toe.
    OPMERKING: Zoals hierboven vermeld, worden groeimedia aangevuld met 10% FBS dat proteaseremmers bevat.
  7. Breng de losgemaakte cellen over in een centrifugatiebuis en centrifugeer gedurende 7 minuten bij 630 x g bij kamertemperatuur.
  8. Resuspend de cellen in 10 ml groeimedia en tel ze met een hemocytometer.
  9. Zaadcellen met een inentingsdichtheid van 3 x 105 cellen per 75 cm2 kolf.

3. Etikettering van cellen met calceïne-AM

OPMERKING: Cellen die in cadaverische weefsels worden geïnjecteerd, worden gekleurd met een groen-fluorescerende membraandoorlatende levende-celvlek en een rood-fluorescerende membraan-ondoordringbare levensvatbaarheidsindicator om te verifiëren dat geëxtraheerde cellen hetzelfde zijn als de geïnjecteerde cellen en geen weefselfragmenten van de urethra.

  1. Was cellen tweemaal met 10 ml PBS.
  2. Voeg 5 ml kleurstofoplossing toe per 75 cm2 kolf. De kleurstofoplossing bestaat uit groeimedia met 2 μM van de groen-fluorescerende membraandoorlatende levende-celkleurstof en 4 μM rood-fluorescerende membraan-ondoordringbare levensvatbaarheidsindicator.
  3. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
  4. Aspirateer en gooi de kleurstofoplossing weg.
  5. Was de cellen nogmaals tweemaal met 10 ml PBS.
  6. Voeg groeimedia toe en documenteer het groene en rode fluorescentiesignaal door fluorescentiemicroscopie.
    1. Leg de kolf van 75 cm2 op de microscooptafel, gebruik het 10x objectief, selecteer geen fluorescentiefilter en zorg ervoor dat het doorgelaten lichtpad actief is.
      OPMERKING: Deze stappen worden allemaal handmatig uitgevoerd op de microscoop.
    2. Parallel aan stap 3.6.1 opent u het softwareprogramma.
    3. Druk op de Knop Live onder het tabblad Zoeken om een live beeld te krijgen van de cellen in de kolf op de tafel en concentreer u erop met de grove en fijnafstellingsaandrijvingen.
      OPMERKING: In het rechter zicht verschijnt het live beeld zodra de Live-knop is geactiveerd.
    4. Selecteer in het subtabblad Microscoopcomponenten het juiste objectief (10x).
    5. Pas op het subtabblad Camera een vinkje toe voor Automatische belichting.
    6. Druk op de knop Snap om de eerste foto met doorgelaten licht te maken.
    7. Voeg de schaalbalk in met behulp van het tabblad Afbeeldingen in de menubalk en selecteer Schaalbalk.
    8. Sla de afbeelding op via het tabblad Bestanden in de menubalk en selecteer Opslaan als czi.
    9. Voor de fluorescentiefoto's verandert u het filter in het filter dat specifiek is voor groene of rode fluorescentie en selecteert u het gereflecteerde lichtpad.
      OPMERKING: Deze wijzigingen moeten handmatig op de microscoop worden uitgevoerd.
    10. Druk nogmaals op de knop Live onder het tabblad Zoeken om een live beeld van de cellen te krijgen.
    11. Druk op de knop Snap om de tweede foto te maken met groene of rode fluorescentie.
    12. Voeg de schaalbalk in met behulp van het tabblad Afbeeldingen in de menubalk en selecteer Schaalbalk.
    13. Sla de afbeelding op via het tabblad Bestanden in de menubalk en selecteer Opslaan als czi.
    14. Herhaal stap 3.6.9 tot en met 3.6.13 met het andere fluorescentiekanaal.

4. Bereid urethrale weefselmonsters voor injecties

  1. Ontleed de urethra en de verbindingsblaas uit het varken.
    OPMERKING: Urethrale weefselmonsters van verse kadastermonsters van volwassen vrouwelijke landrasvarkens werden gebruikt voor de experimenten.
  2. Transporteer het naar het laboratorium in zakken op nat ijs.
    OPMERKING: De monsters moeten op ijs worden achtergelaten tot verdere verwerking. Aan de monsters werden geen additieven toegevoegd.
  3. Plaats de urethra met de blaas op een spons, die de elasticiteit van de onderste bekkenbodem nabootst.
    1. Gebruik de blaas om de oriëntatie (proximaal, distaal, dorsaal en ventraal) van de urethra te bepalen. Dit is mogelijk door de lokalisatie van de urineleiders en de drie ligamenten die de blaas in de buik- en bekkenholte fixeren. De drie ligamenten zijn de twee vesicae lateralia ligamenten aan de zijkanten van de blaas en het vesicae medianum, dat ontstaat uit het ventrale oppervlak van de blaas (figuur 1).
  4. Snijd de plasbuis in de lengterichting aan de dorsale zijde open met behulp van een katheter.
  5. Injecteer de cellen in de geopende urethra zoals beschreven in de volgende hoofdstukken.

5. Injecties van cellen via een Williams-naald in vloeistoffen en weefselmonsters

  1. Oogst cellen zoals beschreven in stap 2.
  2. In tegenstelling tot stap 2.9, past u de celdichtheid voor injecties aan op 2,4 x 106 cellen per ml.
    OPMERKING: Voor injecties in weefselmonsters labelen de cellen met een groen-fluorescerende membraandoorlatende levende cel.
  3. Zuig de celsuspensie op met een spuit en breng de Williams cystoscopische injectienaald (WN) erop aan.
  4. Houd de naald kort boven de 2 ml groeimedia in een centrifugatiebuis van 15 ml of steek de naald in het geopende urethraweefsel. Injecteer in beide gevallen 250 μL cellen handmatig.
    OPMERKING: Cellen die in de cadaverische urethra worden geïnjecteerd, vormen een injectiekoepel.
  5. Verzamel cellen die rechtstreeks in media worden geïnjecteerd door centrifugeren gedurende 7 minuten bij 630 x g bij kamertemperatuur.
  6. Voor cellen die in de cadaverische urethra worden geïnjecteerd, zuigt u ze uit de injectiekoepel met een naald van 18 G die op een spuit wordt aangebracht.
  7. Breng de geïnjecteerde en geaspireerde cellen over in een centrifugatiebuis en centrifugeer gedurende 7 minuten bij 630 x g bij kamertemperatuur, vergelijkbaar met de cellen die in de media worden geïnjecteerd.
  8. Na centrifugeren, resuspend de cellen in 4 ml groeimedia in beide gevallen.
  9. Bepaal de celopbrengst en levensvatbaarheid met behulp van Trypan blauwe kleurstofuitsluiting met een hemocytometer.
    1. Meng 20 μL celsuspensie grondig met 20 μL Trypan blauw.
    2. Vul 10 μL van dit mengsel in elke kamer van de hemocytometer.
      OPMERKING: Beide kamers worden gevuld en geteld om statistische optimalisatie te krijgen door de bemonstering te verdubbelen.
    3. Tel onder een microscoop cellen in alle vier de hoekvierkanten.
      OPMERKING: Tel cellen die in wit schijnen (onbevlekt) als levensvatbare cellen, terwijl cellen die blauw schijnen (gekleurd) worden geteld als dode cellen.
    4. Om het celgetal per ml te berekenen, berekent u het gemiddelde van de twee kamers, deelt u dit getal door twee en vermenigvuldigt u het met 104.

6. Injecties van cellen via Waterjet in vloeistoffen en weefselmonsters

  1. Oogst cellen zoals beschreven in stap 2.
  2. In tegenstelling tot stap 2.9 en 5.2, pas de celdichtheid voor injecties aan tot 6 x 106 cellen per ml.
    OPMERKING: Gebruik voor injecties in weefselmonsters cellen die zijn gelabeld met een groen-fluorescerende membraandoorlatende levende cel.
  3. Vul de celsuspensie in de doseereenheid van het WJ-apparaat.
  4. Houd het injectiemondstuk kort boven de 2 ml groeimedia in een centrifugatiebuis van 15 ml of kort boven het geopende urethraweefsel.
  5. Injecteer in beide gevallen 100 μL cellen door het apparaat met behulp van een hoge druk voor weefselpenetratie gevolgd door een lagedrukfase voor celinjecties. Gebruik de drukinstellingen E60-10.
    OPMERKING: Cellen die in de cadaverische urethra worden geïnjecteerd, vormen een injectiekoepel.
  6. Verzamel cellen die rechtstreeks in media worden geïnjecteerd door centrifugeren gedurende 7 minuten bij 630 x g bij kamertemperatuur.
  7. Voor cellen die in de cadaverische urethra worden geïnjecteerd, zuigt u ze uit de injectiekoepel met een naald van 18 G die op een spuit wordt aangebracht.
  8. Breng de geïnjecteerde en geaspireerde cellen over in een centrifugatiebuis en centrifugeer gedurende 7 minuten bij 630 x g bij kamertemperatuur, vergelijkbaar met de cellen die in de media worden geïnjecteerd.
  9. Na centrifugeren resuspend cellen in 4 ml groeimedia in beide gevallen.
  10. Bepaal de celopbrengst en levensvatbaarheid met behulp van Trypan blauwe kleurstofuitsluiting met een hemocytometer zoals in detail beschreven in 5.10.

7. Biomechanische beoordeling van cellulaire elasticiteit door atomaire krachtmicroscopie (AFM)

  1. Bereiding van monsters
    OPMERKING: De opgehaalde cellen na injectie worden nu onderworpen aan verdere analyses door AFM. Bovendien worden cellen die niet zijn geïnjecteerd als controles gebruikt.
    1. Zaadcellen in weefselkweekschalen met een dichtheid van 5 x 105 cellen per schaal.
      LET OP: Zaad één weefselkweekschaal per conditie. De voorwaarden zijn controles, ADSC's geïnjecteerd door WJ of WN in media en ADSC's geïnjecteerd door WJ of WN in kadaverweefsel.
    2. Incubeer cellen in weefselkweekschalen gedurende 3 uur bij 37 °C.
      OPMERKING: Om afwijkingen als gevolg van cellen in de G1-fase en tijdens mitose te voorkomen, voerden we AFM-metingen uit 3 uur na de celzaaistap.
    3. Vervang vlak voor de meting met de AFM de groeimedia door 3 ml L-15 media van Leibovitz zonder L-glutamine.
    4. Plaats de weefselkweekschaal in de monsterhouder van het AFM-apparaat en zet de petrischaalverwarming op 37 °C aan.
  2. Voorbereiding van AFM- en cantileverkalibratie
    1. Gebruik een glasblok dat is gespecificeerd voor metingen in vloeistoffen en pas dit aan op de AFM-houder.
      OPMERKING: Het bovenoppervlak van het glasblok moet recht en parallel aan de AFM-houder zijn.
    2. Plaats de uitkraging voorzichtig op het oppervlak van het glazen blok. De punt A moet over het gepolijste optische vlak liggen.
      OPMERKING: Kras het gepolijste optische oppervlak van het glasblok niet, omdat krassen kunnen leiden tot interferenties in de metingen. De punt A moet over het gepolijste optische vlak uitsteken omdat anders de reflectie van de laser van de AFM op de fotodetector niet mogelijk is.
    3. Om de slede op het glasblok te stabiliseren, voegt u een metalen veer toe met behulp van een pincet.
    4. Wanneer de slede op het glazen blok is bevestigd, plaatst u het blok op de AFM-kop en vergrendelt u het geïntegreerde vergrendelingsmechanisme.
    5. Monteer de AFM-kop op het AFM-apparaat.
      OPMERKING: De veer moet naar de linkerkant gericht zijn om correct te worden geplaatst. Als dit niet het geval is, corrigeer dan de positie van het glasblok en pas de AFM-kop opnieuw aan.
    6. Initialiseer de software-instelling en open de software samen met het laseruitlijningsvenster en de instellingen van de naderingsparameter. Schakel daarnaast de stappenmotor, het laserlicht en de CCD-camera in.
    7. Identificeer de sledepunt A met behulp van de CCD-camera.
    8. Laat de slede zakken totdat deze volledig in het medium is gedompeld. Gebruik de stappenmotorfunctie om dit doel te bereiken.
    9. Zodra de cantilever volledig is bedekt door medium, wordt de laser uitgelijnd op de cantilever met behulp van de stelschroeven. De gereflecteerde straal moet op het midden van de fotodetector vallen en de som van de signalen moet 1 V of hoger zijn. De zijdelingse en verticale doorbuigingen moeten dicht bij 0 liggen.
      OPMERKING: Als het centrum wordt bereikt, kan worden bewaakt in de laseruitlijningsfunctie en de signaalwaarden. Als de signaalwaarden niet correct zijn, zijn verdere aanpassingen noodzakelijk.
    10. Voer nu de scanner Approach met de naderingsparameters uit (tabel 1).
    11. Trek de slede met 100 μm in zodra deze de bodem bereikt door op de retract-knop te drukken.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen cel is bevestigd op dat veld waar de aanpak wordt uitgevoerd, omdat dit de kalibratie zou vervalsen.
    12. Stel de Run-parameters in volgens de volgende specificaties: Setpoint 1 V, Pulling Length 90 μm, Velocity: 5 μm/s, Sample rate: 2000 Hz en als Delay Mode: Constant Force.
    13. Start de kalibratiekracht-afstandscurvemeting door op de knop Uitvoeren te drukken.
      OPMERKING: Door op de knop Uitvoeren in de software te klikken, wordt een force-distance curve verkregen.
    14. Selecteer het gebied van lineaire pasvorm van de ingetrokken curve in de software op de verkregen kalibratiekracht-afstandscurve. Bereken de veerconstante meting door de software.
    15. Kalibreer de cantilever volgens de exacte parameters en stappen zoals beschreven door Danalache et al.17.
  3. Het meten van de elasticiteit van individuele cellen
    1. Identificeer een cel visueel en concentreer je erop. Plaats de computermuis in het midden van de cel. Om de precisie van de metingen te verbeteren, plaatst u de AFM-tip direct boven de celkern.
      OPMERKING: De computermuis wordt gebruikt als visuele markering om de doellocatie van inspringing te identificeren.
    2. Richt je nu op de cantilever en verplaats deze op de computermuis.
    3. Start de meting met Run met de parameters in tabel 2.
      OPMERKING: De instelpuntparameter die wordt verkregen door kalibratie van de cantilever wordt gebruikt. Verder wordt één cel drie keer gemeten. Meet ten minste 50 cellen.
  4. Gegevensverwerking
    1. Verwerk de gegevens volgens exacte stappen en parameters zoals eerder beschreven door Danalache17.
    2. Sla het bestand op en exporteer het.

8. Statistische analyse

  1. Open de statistische software.
  2. Kies de selectie van Nieuwe gegevensset.
    OPMERKING: Er worden twee bestanden geopend. De ene is de "DataSet" en de andere is het bestand "Output".
  3. Selecteer het DataSet-bestand en open het tabblad Variabele weergave .
  4. Voeg de numerieke variabelen in voor injectie op de plaats (vangvloeistof of kadaverweefsel), categorie (controle, WJ-injectie, WN-injectie) en elasticiteit.
  5. Voeg de gemeten elasticiteitsgegevens met de bijbehorende injectieplaats en het categorienummer in het tabblad Gegevensweergave in.
  6. Analyseer de gegevens door het menubalktabblad Analyseren | Beschrijvende statistiek en kies voor verkennende data-analyse.
  7. Selecteer als afhankelijke variabele Elasticiteit en factorlijst Categorie.
    OPMERKING: De resultaten worden weergegeven in het bestand "Uitvoer", inclusief een boxplot die wordt gebruikt voor de resultatensectie.
  8. Als u een statistische test wilt uitvoeren, selecteert u de onafhankelijke monsters in de niet-parametrische test onder het tabblad Analyseren van de menubalk.
  9. Houd in het nieuw geopende bestand de instellingen op het tabblad Doel en Instellingen.
  10. Open het tabblad Velden en kies Elasticiteit als testvelden en Categorie als groepen.
  11. Druk op Uitvoeren.
    OPMERKING: De resultaten worden weergegeven in het bestand "Uitvoer". Voor deze analyses wordt een Mann-U-Whitney test uitgevoerd.
  12. Neem het resultaat van de niet-parametrische test op in de boxplot van de verkennende gegevensanalyse.
  13. Sla de bestanden op door Bestand te selecteren in de menubalk en Opslaan te kiezen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Na celafgifte via de twee benaderingen was de levensvatbaarheid van cellen die via het WN werden toegediend (97,2 ± 2%, n = 10, p<0,002) hoger in vergelijking met injecties door WJ met behulp van de E60-10-instellingen (85,9 ± 0,16%, n = 12) (figuur 2). Biomechanische beoordelingsresultaten toonden aan dat: WN-injecties van cellen in afvangvloeistof geen significant verschil vertoonden met betrekking tot de elastische moduli (EM; 0,992 kPa) in vergelijking met de controles (1,176 kPa;

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In de huidige studie hebben we een stapsgewijze aanpak voor de WJ-celafgifteprocedure gedemonstreerd en gepresenteerd en een vervolg van kwantitatief onderzoek gebruikt om het effect van WJ-afgifte op cellulaire kenmerken te beoordelen: cellulaire levensvatbaarheid en biomechanische kenmerken (d.w.z. EM). Na WJ-injectie was 85,9% van de geoogste cellen levensvatbaar. In termen van WN-injectie behield 97,2% van de cellen hun levensvatbaarheid na injectie. De WJ-aanpak voldoet dus aan een absolute vereiste voor een klinisc...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs J.K., M.D, T.A., A.S., W.K. A. hebben niets te onthullen. De auteurs W.L. en M.D.E. zijn medewerkers van ERBE Medizintechnik Lt. Tübingen, de producent van de ERBEJet2 en het WJ-prototype dat in deze studie is gebruikt.

Dankbetuigingen

We danken onze co-auteurs uit de originele publicaties voor hun hulp en steun.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
50 mL centrifuge tubeGreiner BioOne227261
1 mL BD Luer-LokTM SyringeBD Plastik Incn.a.
100 µm cell sieveGreiner BioOne542000
15 mL centrifuge tubeGreiner BioOne188271
75 cm2 tissue culture flaskCorning Incorporated353136
AFM head(CellHesion 200) JPKJPK00518
AFM processing softwareBrukerJPK00518
AFM softwareBrukerJPK00518
AFM system Cell Hesion 200BrukerJPK00518
All-In-One-Al cantileverBudget SensorsAIO-10tip A, Conatct Mode, Shape: Beam
Force Constant: 0.2 N/m (0.04 - 0.7 N/m)
Resonance Frequency: 15 kHz (10 - 20 kHz)
Length: 500 µm (490 - 510 µm)
Width: 30 µm (35 - 45 µm)
Thickness: 2.7 µm (1.7 - 3.7 µm)
Amphotericin B solutionSigmaA2942250 µg/ml
Atomic Force Microscope (AFM)CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, GermanyJPK00518
BD Microlance 3 18GBD304622
bovine serum albuminGibcoA10008-01
Cantilever All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, BulgariaAIO-TL-10tip A, k ¼ 0.2 N/m
C-chip disposable hemocytometerNanoEnTek631-1098
centrifuge: Rotina 420RHettich Zentrifugen
Collagenase, Type I, powderGibco17100-017
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - low glucoseSigmaD5546
Feather disposable scalpel (No. 10)Feather02.001.30.010
fetal bovine serum (FBS)SigmaF7524
HEPES sodium salt solution (1 M)SigmaH3662
Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM)AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, GermanyL201306_03
laboratory bagsBrand759705
Leibovitz's L-15 medium without l-glutamineMerckF1315
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)F1315
L-glutamineLonzaBE 17-605C1200 mM
LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity KitInvitrogen by Thermo Fisher ScientificL3224Calcein AM and EthD-1 are used from this kit.
Microscope software: Zen 2.6Zeiss
Microscope: AxioVertA.1Zeiss
Nelaton-Catheter femaleBicakcilar19512051
Penicillin-StreptomycinGibco15140-12210000 U/ml Penicillin
10000 µg/ml Streptomycin
Petri dish heater associated with AFMBrukerT-05-0117
Petri dish heater associated with AFMJPK Instruments AG, Berlin, GermanyT-05-0117
Phosphate buffered saline (PBS)Gibco10010-015
Statistical Software: SPSS Statistics 22IBM
Sterile Petri dish - CellStarGreiner BioOne664160
Tissue culture dishesTPP AGTPP93040
Tissue culture dishesTPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, SwitzerlandTPP93040
Trypan Blue 0.4%
0.85% NaCl		Lonza17-942E
Trypsin-EDTA solutionSigmaT3924
Waterjet: ERBEJET2 deviceErbe Elektromedizin GmbH
Williams Cystoscopic Injection NeedleCook MedicalG1422023G, 5.0 Fr, 35 cm

Referenties

  1. Milsom, I., et al. Global prevalence and economic burden of urgency urinary incontinence: a systematic review. European Urology. 65 (1), 79-95 (2014).
  2. Lee, J. Y., et al. The effects of periurethral muscle-derived stem cell injection on leak point pressure in a rat model of stress urinary incontinence. International Urogynecology Journal and Pelvic Floor Dysfunction. 14 (1), 31-37 (2003).
  3. Tran, C., Damaser, M. S. The potential role of stem cells in the treatment of urinary incontinence. Therapeutic Advances in Urology. 7 (1), 22-40 (2015).
  4. Fu, Q., Song, X. F., Liao, G. L., Deng, C. L., Cui, L. Myoblasts differentiated from adipose-derived stem cells to treat stress urinary incontinence. Urology. 75 (3), 718-723 (2010).
  5. Corcos, J., et al. marrow mesenchymal stromal cell therapy for external urethral sphincter restoration in a rat model of stress urinary incontinence. Neurourology and Urodynamics. 30 (3), 447-455 (2011).
  6. Smaldone, M. C., Chen, M. L., Chancellor, M. B. Stem cell therapy for urethral sphincter regeneration. Minerva Urologica e Nefrologica. 61 (1), 27-40 (2009).
  7. Perin, E. C., López, J. Methods of stem cell delivery in cardiac diseases. Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine. 3, Suppl 1 110-113 (2006).
  8. Zhang, M., et al. Cardiomyocyte grafting for cardiac repair: graft cell death and anti-death strategies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (5), 907-921 (2001).
  9. Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: administration and formulation considerations for cell therapies. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (5), 640-650 (2015).
  10. Amer, M. H., Rose, F. R. A. J., Shakesheff, K. M., Modo, M., White, L. J. Translational considerations in injectable cell-based therapeutics for neurological applications: concepts, progress and challenges. NPJ Regenerative Medicine. 2, 23-23 (2017).
  11. Linzenbold, W., Fech, A., Hofmann, M., Aicher, W. K., Enderle, M. D. Novel Techniques to Improve Precise Cell Injection. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6367(2021).
  12. Adamo, A., Roushdy, O., Dokov, R., Sharei, A., Jensen, K. F. Microfluidic jet injection for delivering macromolecules into cells. Journal of Micromechanics and Microengineering: Structures, Devices, and Systems. 23, 035026(2013).
  13. Jäger, L., et al. A novel waterjet technology for transurethral cystoscopic injection of viable cells in the urethral sphincter complex. Neurourology and Urodynamics. 39 (2), 594-602 (2020).
  14. Weber, M., et al. Hydrojet-based delivery of footprint-free iPSC-derived cardiomyocytes into porcine myocardium. Scientific Reports. 10 (1), 16787(2020).
  15. Jäger, L., et al. A novel waterjet technology for transurethral cystoscopic injection of viable cells in the urethral sphincter complex. Neurourology and Urodynamics. 39 (2), 594-602 (2020).
  16. Linzenbold, W., et al. Rapid and precise delivery of cells in the urethral sphincter complex by a novel needle-free waterjet technology. BJU International. 127 (4), 463-472 (2021).
  17. Danalache, M., Tiwari, A., Sigwart, V., Hofmann, U. K. Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis. Journal of Visualized Experiments. (159), e61041(2020).
  18. Gálvez-Martín, P., Hmadcha, A., Soria, B., Calpena-Campmany, A. C., Clares-Naveros, B. Study of the stability of packaging and storage conditions of human mesenchymal stem cell for intra-arterial clinical application in patient with critical limb ischemia. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 86 (3), 459-468 (2014).
  19. Danalache, M., et al. Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stromal Cells by a Novel Waterjet Technology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), (2021).
  20. Amend, B., et al. Precise injection of human mesenchymal stromal cells in the urethral sphincter complex of Göttingen minipigs without unspecific bulking effects. Neurourology and Urodynamics. 36 (7), 1723-1733 (2017).
  21. Danalache, M., et al. Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stromal Cells by a Novel Waterjet Technology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), 3958(2021).
  22. Strasser, H., et al. 328: Transurethral Ultrasound Guided Stem Cell Therapy of Urinary Incontinence. Journal of Urology. 175 (4), 107(2006).
  23. Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728-742 (2017).
  24. Ding, Y., Xu, G. -K., Wang, G. -F. On the determination of elastic moduli of cells by AFM based indentation. Scientific Reports. 7 (1), 45575(2017).
  25. Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysical Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
  26. Carl, P., Schillers, H. Elasticity measurement of living cells with an atomic force microscope: data acquisition and processing. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 457 (2), 551-559 (2008).
  27. Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).
  28. Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (76), e50497(2013).
  29. Li, M., Dang, D., Liu, L., Xi, N., Wang, Y. Atomic Force Microscopy in Characterizing Cell Mechanics for Biomedical Applications: A Review. IEEE Trans Nanobioscience. 16 (6), 523-540 (2017).
  30. Morimoto, A., et al. A conserved KASH domain protein associates with telomeres, SUN1, and dynactin during mammalian meiosis. The Journal of Cell Biology. 198 (2), 165(2012).
  31. Lombardi, M. L., et al. The interaction between nesprins and sun proteins at the nuclear envelope is critical for force transmission between the nucleus and cytoskeleton. Journal of Biological Chemistry. 286 (30), 26743-26753 (2011).
  32. Isermann, P., Lammerding, J. Nuclear Mechanics and Mechanotransduction in Health and Disease. Current Biology. 23 (24), 1113-1121 (2013).
  33. Méjat, A. LINC complexes in health and disease. Nucleus. 1 (1), 40-52 (2010).
  34. Folker, E. S., Östlund, C., Luxton, G. G., Worman, H. J., Gundersen, G. G. Lamin A variants that cause striated muscle disease are defective in anchoring transmembrane actin-associated nuclear lines for nuclear movement. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (1), 131-136 (2011).
  35. Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nature cell biology. 16 (4), 376-381 (2014).
  36. Fischer, T., Hayn, A., Mierke, C. T. Effect of Nuclear Stiffness on Cell Mechanics and Migration of Human Breast Cancer Cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 393(2020).
  37. Kuznetsova, T. G., Starodubtseva, M. N., Yegorenkov, N. I., Chizhik, S. A., Zhdanov, R. I. Atomic force microscopy probing of cell elasticity. Micron. 38 (8), 824-833 (2007).
  38. Schillers, H., et al. Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples. Scientific Reports. 7 (1), 5117(2017).
  39. Costa, K. D., Yin, F. C. Analysis of indentation: implications for measuring mechanical properties with atomic force microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 121 (5), 462-471 (1999).
  40. Stolz, M., et al. Dynamic elastic modulus of porcine articular cartilage determined at two different levels of tissue organization by indentation-type atomic force microscopy. Biophysical Journal. 86 (5), (2004).
  41. Park, S., Costa, K. D., Ateshian, G. A., Hong, K. S. Mechanical properties of bovine articular cartilage under microscale indentation loading from atomic force microscopy. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 223 (3), 339-347 (2009).
  42. Usukura, E., Narita, A., Yagi, A., Ito, S., Usukura, J. An Unroofing Method to Observe the Cytoskeleton Directly at Molecular Resolution Using Atomic Force Microscopy. Scientific Reports. 6 (1), 27472(2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Waterjet-injectieadipose weefselstromaceltherapieurinaire incontinentienaaldvrije injectieurethrasfincteratomaire krachtmicroscopiecelviabiliteitbiomechanische beoordelingporcine stromale cellen
Injectie van van varkensweefsel afgeleide stromacellen via waterstraaltechnologie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.