Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Real-time cell metabolic flux analyzer gebruiken om osteoblast bio-energetica te monitoren

3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63142

⸱

1 maart 2022

 ,  , 
1Vanderbilt Center for Bone Biology, Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Medicine, Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt University Medical Center, 3Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University

In dit artikel

Samenvatting

Real-time cel metabole flux assay meet het zuurstofverbruik en de extracellulaire verzuringssnelheid, die overeenkomt met mitochondriale en glycolytische adenosinetrifosfaatproductie, met behulp van pH- en zuurstofsensoren. Het manuscript legt een methode uit om de energiestatus van osteoblasten en de karakterisering en interpretatie van de cellulaire bio-energetische status te begrijpen.

Samenvatting

Botvorming door osteoblasten is een essentieel proces voor een goede botacquisitie en botomzetting om de homeostase van het skelet te behouden en uiteindelijk fracturen te voorkomen. In het belang van zowel het optimaliseren van de piekbotmassa als het bestrijden van verschillende musculoskeletale aandoeningen (d.w.z. postmenopauzale osteoporose, anorexia nervosa, type 1 en 2 diabetes mellitus), zijn ongelooflijke inspanningen geleverd op het gebied van botbiologie om osteoblasten volledig te karakteriseren tijdens hun differentiatieproces. Gezien de primaire rol van volwassen osteoblasten om matrixeiwitten en mineralisatieblaasjes af te scheiden, is opgemerkt dat deze processen een ongelooflijke hoeveelheid cellulaire energie of adenosinetrifosfaat (ATP) vergen. De algehele cellulaire energiestatus wordt vaak cellulaire bio-energetica genoemd en omvat een reeks metabole reacties die de beschikbaarheid van substraat detecteren om ATP af te leiden om aan cellulaire behoeften te voldoen. Daarom beschrijft de huidige methode het proces van het isoleren van primaire, muriene beenmergstromale cellen (BMSCs) en het monitoren van hun bio-energetische status met behulp van de Real-time cel metabole flux analyzer in verschillende stadia van osteoblastdifferentiatie. Belangrijk is dat deze gegevens hebben aangetoond dat het metabole profiel dramatisch verandert tijdens de differentiatie van osteoblasten. Het gebruik van dit fysiologisch relevante celtype is dus vereist om volledig te begrijpen hoe de bio-energetische status van een cel de algehele functie kan reguleren.

Inleiding

De vorming van bot door de osteoblast gaat gepaard met gecoördineerde vernietiging of resorptie van botten door osteoclasten. De balans tussen osteoblastische botvorming en osteoclastenresorptie is een gekoppeld proces dat botomzetting of remodellering beschrijft, wat essentieel is voor skelethomeostase. Osteoblastdisfunctie leidt tot verminderde botvorming en resulteert in verschillende ziekten, waaronder osteoporose 1,2,3. Ex vivo/in vitro differentiatie van beenmergstromale stamcellen (BMSCs) naar osteoblastvoorlopers en volwassen osteoblasten resulteert in de vorming en afzetting van de gemineraliseerde botmatrix in het kweekvat in de loop van de tijd 4,5,6. Deze botvorming door de osteoblast vereist een aanzienlijke hoeveelheid cellulaire energie. In het bijzonder is aangetoond dat collageensynthese en secretie sterk afhankelijk zijn van cellulaire ATP: ADP-verhoudingen, en vermoedelijk vereisen gemineraliseerde blaasjeshandel en secretie extra ATP 7,8,9,10,11. Veel onderzoekers hebben aangetoond dat het proces van osteoblastogenese en osteoblastfunctie een voldoende toevoer van energie vereist om te voldoen aan de metabole vraag naar botvorming 12,13,14,15,16. Daarom is het doel van deze methode om de bio-energetische status van primaire, muriene stromale cellen te karakteriseren gedurende osteoblastdifferentiatie met behulp van de real-time cel metabole flux analyzer. Deze technieken helpen bij het ontwikkelen van een beter begrip van skelethomeostase, wat uiteindelijk kan leiden tot de ontwikkeling van nieuwe therapeutische opties die skeletaandoeningen kunnen verbeteren.

De real-time cel metabole flux analyzer kan worden gebruikt om de zuurstofverbruikssnelheid (OCR) en extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) van levende osteoblasten te meten, wat overeenkomt met respectievelijk mitochondriale en glycolytische ATP-productie. Fundamenteel voor deze methodologie is het feit dat één H + -ion per lactaat vrijkomt tijdens glycolyse bij de omzetting van glucose in lactaat, wat de media-pH verandert die wordt weerspiegeld in de ECAR-waarden. Omgekeerd, tijdens de TCA (tricarbonzuur) cyclus, oxidatieve fosforylering via de mitochondriën produceert CO2 door zuurstof te gebruiken of te consumeren, en daarom is het monitoren van OCR een weerspiegeling van dit metabolische proces. De analyzer meet zowel OCR als ECAR in de extracellulaire micro-omgeving tegelijkertijd en in realtime, wat een enorm potentieel mogelijk maakt bij het bestuderen van cellulaire bio-energetica 6,17. Bovendien is het uitvoeren van deze testen relatief eenvoudig en gemakkelijk aan te passen, afhankelijk van het experimentele doel. Vergelijkbare technieken zijn gebruikt om de metabool regulatie van het immuunsysteem18,19, kankerinitiatie en progressie20 verder te begrijpen, samen met meerdere andere celtypen die bijdragen aan metabool syndroom21,22.

De voordelen van real-time metabole flux analyzer ten opzichte van alternatieve technieken omvatten (1) de mogelijkheid om cellulaire bio-energetica van levende cellen in real-time te meten, (2) het vermogen om assay uit te voeren met een relatief klein aantal cellen (vereist slechts 5.000 cellen), (3) injectiepoorten om parallel meerdere behandelingen te manipuleren in een high-throughput 96-well systeem, (4) gebruik van radioactieve labelvrije geautomatiseerde celbeeldcamera voor normalisatie18, 23,24. De volgende methoden zijn bedoeld om een algemene maar gedetailleerde beschrijving te geven van het monitoren van cellulaire bio-energetica in muriene BMSCs gedurende de differentiatie van osteoblasten met behulp van de analyzer. Het omvat routinematig uitgevoerde assays; echter, zoals met veel technieken en methoden, wordt het sterk aangemoedigd dat individuele laboratoria specifieke details voor hun experimenten bepalen.

Selectie van assays en verschillende soorten assays beschikbaar: Een breed scala aan assay kits en reagentia zijn beschikbaar om de bio-energetica van cellen te bestuderen en tegelijkertijd de betrouwbaarheid en consistentie van de experimentele resultaten te waarborgen. Bovendien biedt de desktopsoftware ook testsjablonen die eenvoudig kunnen worden aangepast. De test kan worden gedefinieerd op basis van de behoeften van de gebruiker om verschillende metabole parameters te meten. Deze assays kunnen op verschillende manieren worden aangepast op basis van het experimentele doel en/of de wetenschappelijke vraag. Met vier injectiepoorten kunnen bijvoorbeeld meerdere verbindingen in de testmedia worden geïnjecteerd om de cellulaire respons te analyseren die specifiek is voor elke metabole route.

Celenergie fenotype test: Deze test meet het metabole fenotype en het metabolisch potentieel van de levende cellen. Deze test wordt ook aanbevolen als de eerste stap om een gegeneraliseerd idee te krijgen van pathway-specifiek metabolisme. Een mengsel van oligomycine A-een remmer van ATP-synthase en carbonylcyanide 4-(trifluormethoxy) fenylhydrazon (FCCP)-een mitochondriaal ontkoppelingsmiddel wordt geïnjecteerd om het celenergiepotentieel te begrijpen. De injectie van oligomycine A remt de synthese van ATP, wat resulteert in een toename van de snelheid van glycolyse (ECAR) om de cellen in staat te stellen aan hun energiebehoeften te voldoen; aan de andere kant resulteert de injectie van FCCP in een hogere OCR als gevolg van depolarisatie van het mitochondriale membraan. In wezen toont deze test basale metabole ademhaling en na de dubbele injecties, duwen of spanningen de metabole respons. Op basis van deze parameters plot de software vervolgens OCR en ECAR van de cellen door de cellen te classificeren als aerobe, rustige, glycolytische of energetische toestand in de loop van de tijd25,26.

ATP real-time productiesnelheidstest: Dit meet de cellulaire ATP-productie tegelijkertijd uit glycolyse en mitochondriale ademhaling. Deze test meet kwantitatief de metabole verschuivingen van de twee energieroutes en levert gegevens over de mitochondriale en glycolytische ATP-productiesnelheden in de loop van de tijd. De test verkrijgt basale OCR- en ECAR-gegevens, gevolgd door het berekenen van mitochondriale ATP-productiesnelheid door injectie van oligomycine A en glycolytische ATP-productiesnelheid door injectie van rotenon + antimycine A-mengsel (totale remming van mitochondriale functie), resulterend in mitochondriale verzuring17,27.

Cel mitochondriën stresstest (of cel mito stress test): Dit meet de mitochondriale functie door atp-gebonden ademhaling, kwantificeert cellulaire bio-energetica, identificeert mitochondriale disfunctie en meet de reactie van cellen op stress. Verschillende parameters, waaronder basale en reserve ademhalingscapaciteit, ATP-gebonden ademhaling, maximale ademhaling en niet-mitochondriaal zuurstofverbruik, kunnen in één test worden verkregen. Deze test omvat sequentiële injecties van oligomycine A, FCCP (mitochondriaal ontkoppelingsmiddel), een mengsel van rotenon / antimycine A-remmers om het effect hiervan op de mitochondriale functie efficiënt te analyseren28.

Flexibiliteit mito fuel flex test: Dit meet de mitochondriale ademhalingssnelheid door de oxidatie van de drie primaire mitochondriale brandstoffen door de aan- en afwezigheid van hun remmers. De sequentiële remming van glucose, glutamine en vetzuren helpt bij het meten van de afhankelijkheid, capaciteit en flexibiliteit van cellen en de afhankelijkheid van de cellen in verschillende cellulaire routes om aan de energievraag te voldoen. Wanneer de mitochondriën niet kunnen voldoen aan de eisen van de geblokkeerde route van belang door andere brandstoffen te oxideren, komen de cellen in een afhankelijkheidstoestand. De capaciteit van de cellen wordt berekend door remming van de andere twee alternatieve routes gevolgd door de remming van de route van belang. De flexibiliteit van cellen helpt bij het begrijpen van het vermogen van mitochondriën om te compenseren en te voldoen aan de brandstofbehoeften van de geremde route. Het wordt berekend door de afhankelijkheid van cellen af te trekken van de capaciteit van cellen. Drie verschillende remmers worden onafhankelijk van elkaar of als een mengsel van twee gebruikt om de testparameters effectief te berekenen. 2-cyano-3-(1-fenyl-1H-indol-3-yl)-2-propeenzuur (UK5099) remt de oxidatie van glucose door de pyruvaatdrager in glycolyse te blokkeren. Bis-2-(5-fenylacetamido-1,3,4-thiadiazol-2-yl) (BPTES) ethylsulfide remt de glutamine-oxidatieroute en etomoxir remt de oxidatie van langeketenvetzuren29.

figure-introduction-1
Figuur 1: Schematische weergave van de methodologie voor het kweken en voorbereiden van osteoblasten voor analyse. Murine BMSC's worden geïsoleerd uit lange botten, gekweekt en gezaaid in 96-well platen met 25.000 cellen / putdichtheid. Het kweken van deze cellen in osteoblastspecifieke media wordt gestart wanneer ze 80% -100% confluentie bereiken om hun differentiatie te starten. De assays worden uitgevoerd in verschillende stadia van differentiatie. De patroonplaten worden een dag voorafgaand aan de test gehydrateerd. Op de dag van de test worden verschillende remmers geïnjecteerd in de poorten van de sensorcartridges op basis van de testvereisten en wordt een kalibratiebuffer toegevoegd aan de 96-well kalibratieplaat. Na kalibratie wordt de real-time cel metabole flux assay uitgevoerd, gevolgd door het in beeld brengen van de celkweekmicroplaat met behulp van de microplate imager om real-time cel metabole flux analyzer gegevens met celgetal te normaliseren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures waren gebaseerd op de richtlijnen en goedkeuring van de Institutional Animal Care and Use Committee in het Vanderbilt University Medical Center.

1. Bereiding van reagentia en assay-opstelling

  1. Isolatie en kweken van beenmergstromale cellen (zie ook het vorige artikel30).
    1. Bereid volledige alfa minimum etherische media (αMEM) celkweekmedia door minimale essentiële media aan te vullen met alfamodificatie met 10% FBS (foetaal runderserum), 100 E/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine.
    2. Bereid de beenmergopvangbuis voor door het uiteinde van een microcentrifugebuis van 0,6 ml af te snijden zodat de cellen er doorheen kunnen en breng deze in een microcentrifugebuis van 1,5 ml met 100 μL volledige αMEM.
    3. Euthanaseer de muizen met behulp van CO2-behandeling als volgt. Plaats het dier in de CO2-kamer gedurende 2-3 minuten of totdat de ademhaling stopt. Wacht minstens 1 minuut nadat het dier bewusteloos is geraakt om de muizen uit de kamer te verwijderen en cervicaal te ontwrichten.
    4. Knip met behulp van een steriele tang en een schaar de onderbuik van de geëuthanaseerde muizen open om een kleine incisie te maken. Isoleer de lange botten (dijbeen, scheenbeen en iliacale kam) van de muizen.
    5. Trim de lange botten om al het zachte weefsel te verwijderen. Zodra het bot is gereinigd, snijdt u ~ 1-2 mm van de distale en proximale uiteinden om een opening te creëren waar het merg doorheen kan spoelen.
      OPMERKING: Deze opening moet conservatief zijn om te voorkomen dat het merg verloren gaat terwijl het kan worden weggespoeld.
    6. Plaats de botten in een verzamelbuis met 100 μL 1x steriel PBS (fosfaatbuffered saline) om het totale beenmerg te isoleren.
    7. Spoel het merg door centrifugeren bij 10.000 x g gedurende 15-20 s bij kamertemperatuur. Mergcellen pellet op de bodem van de buis.
    8. Herhaal de centrifugering totdat de botholte wit lijkt en verstoken van de meeste mergelementen. Resuspend de gemengde populatie van beenmerg door zachtjes op en neer te pipetteren.
    9. Kweek de cellen van één dier (zowel dijbeen als scheenbeen) in een 75 cm2 celkweekkolf in 10 ml celkweekmedia en incubeer bij 37 °C in een celkweekincubator met 5% CO2. Als u cellen van 2-3 dieren poolt, gebruik dan een 150 cm2 cel kweekkolf (aanbevolen).
    10. Na 24-48 uur incubatie van de gemengde populatie, aspirateer de niet-adherente hematopoietische celpopulatie in de kweekmedia en was de aanhangende cellen met 1x PBS.
  2. Celzaaien van BMSCs en osteoblastdifferentiatie
    1. Trypsiniseren van de aanhangende cellen door voldoende 0,25% trypsine-EDTA (ongeveer 3-4 ml) toe te voegen om het kolfoppervlak enigszins te bedekken, gevolgd door een incubatie van 3 minuten bij 37 °C.
    2. Voeg 6-7 ml volledige αMEM toe aan de kolf/trypsine om de aanhangende BMSCs te resuspenderen door voorzichtig op en neer te pipetteren. Breng bmsc-suspensie over op een conische centrifugebuis.
    3. Verwijder een aliquot van 50 μL van de BMSC-suspensie en voeg er 50 μL trypan blue (1:1 verdunning) aan toe. Tel het totale aantal levensvatbare cellen dat de kleurstof uitsluit door 10 μL van dit mengsel op een hemocytometer te pipetteren en onder de microscoop te observeren. Tel geen dode of ongezonde cellen die blauw gekleurd lijken (<10% cellen).
    4. Bereken op basis van het celgetal het volume celsuspensie in volledige αMEM dat nodig is voor een eindconcentratie van 2,4 x 106 cellen/ml voor een totaal volume van ten minste 10 ml per plaat.

figure-protocol-1
Figuur 2: De celkweekmicroplaat, speciaal ontworpen voor de analysator. (A) De vier achtergrondcorrectieputten, A1, A12, H1, H12, zijn gemarkeerd. Deze putten bevatten alleen testmedia zonder cellen. (B) De streepjescode aan de zijkant van de plaat om de plaat te scannen met behulp van de beeldlezer en analyzer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Centrifugeer de cellen in de conische buis bij 1.000 x g gedurende 5 minuten en resuspend de cellen tot de gewenste eindconcentratie van 2,4 x 106 cellen/ml.
  2. Breng de celsuspensie over naar een reservoir en breng de cellen met behulp van een meerkanaalspipet voorzichtig opnieuw op om een homogeen mengsel van cellen te garanderen.
  3. Zaad 2,5 x 104 cellen per put in de 96-well celkweekmicroplaat met 80 μL volledige αMEM. Zaai geen cellen in de achtergrondcorrectieputten (A1, A12, H1, H12); voeg in plaats daarvan gewoon het medium toe in deze vier putten.
    OPMERKING: BMSC's voor de testen zijn verguld in 96-well celkweekmicroplaat ontworpen voor de analyzer in combinatie met de sensorcartridges. De oppervlakte van deze platen is anders dan bij een gewone 96-putplaat. Het oppervlak van elke put in de plaat is 0,106 cm2, wat ongeveer 40% is van het typische 96-putplaatoppervlak. Optimale celzaaidichtheid wordt gekozen op basis van het celtype. Meestal kan de analyzer tussen 0,5-4 x 104 cellen per put detecteren. Osteoblasten moeten in contact zijn om effectief te differentiëren; hiervoor is gekozen voor beplating tussen 2,0 x 10 4-3,0 x 104 BMSCs/put in 80 μL volledige αMEM.
  4. Roer de plaat voorzichtig om de gelijkmatige verdeling van de cellen in de putten te garanderen en incubeer bij 37 °C, 5% CO2. Controleer de groei van de cellen en de celconfluentie onder de microscoop na 48 uur. Wijzig indien nodig de celkweekmedia.
  5. Afhankelijk van het doel van de test, wanneer BMSCs 60% -80% confluent zijn (meestal 48-72 h), start osteoblastdifferentiatie door de celkweekmedia te veranderen in osteoblastdifferentiatiemedia (volledige αMEM aangevuld met 5 mM β-glycerolfosfaat en 50 μg / ml L-ascorbinezuur).
  6. Als ongedifferentieerde stromale cellen (dag 0) moeten worden geanalyseerd, moet u cellen onder volledige αMEM houden.
  7. Verander de osteoblastdifferentiatiemedia om de andere dag en visualiseer de cellen onder de microscoop om ervoor te zorgen dat ze gezond zijn tot de dag van de test. Verander bij voorkeur 24 uur voor de geplande test de media en houd een consistent mediumwisselschema aan (aanbevolen).
    OPMERKING: Verander de media voorzichtig door de platen enigszins onder een hoek te kantelen; dit voorkomt onbedoeld contact van pipetpunten met de celkweekplaten en verstoring van de monolaag van cellen.

2. Voorbereiding van de sensorcartridge voor extracellulaire fluxkalibratie

  1. Hydrateer de sensorpatronen uit de extracellulaire testkit vóór de dag van de test. Verwijder de sensorcartridges (groene plaat) en plaats de sensoren ondersteboven.
  2. Voeg met behulp van een meerkanaals pipet 200 μL H2O toe aan elke put van de nutsplaat. Plaats de sensorcartridges voorzichtig terug op de gebruiksplaat en incubeer de plaat 's nachts bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: De fabrikant raadt aan om de sensorcartridges 's nachts in een niet-CO2 incubator van 37 °C te injecteren. Er kan echter een aanzienlijke verdamping van de sensorcartridges optreden. Als dit gebeurt, kunnen sensorcartridges bij kamertemperatuur worden geïncubeerd. Deze platen moeten minimaal 4 uur en maximaal 72 uur worden geïncubeerd.
  3. Gooi op de dag van de test de H2O van de gebruiksplaat en voeg 200 μL kalibrant toe. Incubeer de gebruiksplaat gedurende ten minste 1 uur vóór de test.

3. Real-time cel metabole flux analyzer media voorbereiding

  1. Gebruik de fenolrode vrije DMEM-media met een vooraf aangepaste pH van 7,4 (aanbevolen) om de test met BMSC's uit te voeren.
  2. Bereid 80 ml testmedia door DMEM-media aan te vullen met 1 mM natriumpyruvaat, 2 mM glutamine, 10 mM glucose, 200 nM insuline, 50-200 μM oliezuur BSA.
  3. Incubeer de volledige testmedia bij 37 °C in een waterbad.

4. Voorbereiding van verbindingen voor de sensorpatronen

  1. Ontdooi oligomycine A, rotenon en antimycine A op ijs. Pipetteer op en neer om de verbindingen voor gebruik op te lossen.
  2. Voeg 3 ml bereid testmedium toe aan elke buis, gevolgd door de toevoeging van de respectieve samengestelde buis A: 26,4 μl 2,5 mM oligomycine A; buis B: 3,1 μL van 12,67 mM rotenon + 4,1 μL van 9,4 mM antimycine A + 30 μL Hoechstvlek.
  3. Laad een 10x concentratie van deze remmers in de overeenkomstige poort. De uiteindelijke concentratie van benodigde injectieoplossingen is 2 μM oligomycine A, 1 μM rotenon en 4,1 μM antimycine A.
    OPMERKING: Hoechst wordt toegevoegd aan de laatste injectiepoort voor fluorescerende kleuring van de kernen voor beeldvormings- en normalisatiedoeleinden. Deze concentraties kunnen worden geoptimaliseerd op basis van het celtype.
  4. Laad 20 μL van deze verbindingen in de cellen in 180 μL testmedia.

5. Bereid celkweekmicroplaat voor voor assay

  1. Verwijder de celkweekmicroplaat uit de incubator van 37 °C en observeer de cellen onder de microscoop.
  2. Verwijder het testmedium uit het waterbad.
  3. Was de cellen voorzichtig tweemaal met 200 μL testmedium en voeg 200 μL testmedia per put toe.
    OPMERKING: Zodra het laatste testmedium aan de cellen is toegevoegd, is de tijd totdat de platen in de analysator komen cruciaal. Begin daarom niet met het vervangen van de media totdat de volgende stappen binnen 1 uur zijn uitgevoerd.
  4. Controleer de cellen onder de microscoop om ervoor te zorgen dat de cellen aan de putjes blijven kleven.
  5. Zorg ervoor dat cellen in D5 en E8 met een consistente monolaag worden gehecht en niet worden weggespoeld tijdens de wasstap. Cell imaging software gebruikt deze twee putten voor het instellen van de autofocus en autoexposure.
    OPMERKING: De fabrikant beveelt aan om de plaat gedurende 1 uur in een niet-CO2 37 °C incubator te incuberen; deze stap kan worden overgeslagen als geautomatiseerde beeldvorming de voorkeur heeft. De microplaatbeeldcamera handhaaft bijvoorbeeld dezelfde omstandigheden in een gesloten kamer en cellen kunnen onder een helder veld worden afgebeeld.

6. Opzetten van de assay en beeldvorming

figure-protocol-2
Figuur 3: De controllersoftware. De software controleert of de apparatuur is aangesloten en is ingesteld op 37 °C. De sjabloonbestanden voor verschillende assays die kunnen worden uitgevoerd met de extracellulaire fluxanalysator kunnen worden geselecteerd om de assay verder aan te passen op basis van de experimentele doelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Open de desktopsoftware op de computer naast de apparatuur.
  2. Controleer de verbindingsstatus in de linkerbenedenhoek van de controllersoftware.
  3. Ga naar Sjablonen en selecteer het XF ATP Rate Assay-sjabloonbestand of de juiste testsjabloon.
  4. Selecteer Groepsdefinities boven aan het scherm en definieer de groepen.
  5. Selecteer de lay-out van de plaattoewijzing en wijs de putten toe, afhankelijk van de gedefinieerde groepen.
  6. Controleer het instrumentprotocol, zorg ervoor dat de toegevoegde verbindingen correct worden vermeld en neem de projectinformatie op voor toekomstige referenties.
  7. Klik op Run Assay; dit zal de selectie van de opslaglocatie van het resultaatbestand vragen.
  8. Selecteer de locatie waar u het resultaatbestand wilt opslaan.
  9. Sla het bestand op met de datum van de test en klik op Start Run.
  10. Plaats de sensorcartridge en de gebruiksplaat op de lade en klik op Ik ben klaar om de kalibratie te starten.
  11. Voordat u met de kalibratie begint, moet u ervoor zorgen dat het deksel van de cartridge is verwijderd en dat de sensorcartridge in de juiste richting op de gebruiksplaat is geplaatst. Deze stap duurt 10-20 minuten en als deze is voltooid, geeft de software het dialoogvenster Load Cell Plate weer.

7. Verkrijg brightfield-afbeeldingen

OPMERKING: Deze stap is optioneel. Als er geen beeldapparatuur beschikbaar is, gaat u verder met stap 8.

figure-protocol-3
Figuur 4: De cell imaging software communiceert met de imaging reader via de computer. De cellen in de microplaat kunnen voor en na de test in beeld worden gebracht en het celgetal / de put wordt na de test verkregen om de gegevens te normaliseren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Open de cell imaging-software op de computer.
  2. Zorg ervoor dat de microplate imager is ingeschakeld en dat de poorten zijn aangesloten op de computer.
  3. Controleer de statusbalk linksonder in het scherm om er zeker van te zijn dat de temperatuur is ingesteld op 37 °C en of de verbindingsstatus groen moet worden gemarkeerd als gereed.
  4. Scan de streepjescode van de plaat om het beeldvormingsproces te starten.
  5. Geef een naam aan de celplaat en druk op Opslaan (dit is de naam waar zowel heldere veld- als fluorescerende afbeeldingen worden opgeslagen). Klik op Brightfield Scan uitvoeren.
  6. Het volgende scherm, de plaat en het scanmenu tonen de opties voor beeldvorming. Selecteer vóór de test Brightfield-scan starten.
  7. Plaats de celkweekmicroplaat samen met het plaatdeksel/deksel op de ladehouder en lijn goed A1 uit met de A1-markering. Klik op Lade sluiten.
  8. Het volgende scherm, brightfield image acquisition, met een platenkaart verschijnt. Klik op Scan All Wells, waarmee het systeeminitialisatieproces wordt gestart, gevolgd door 30 tot 35 minuten van een scan.
  9. Verwijder na de brightfield-scan de celkweekmicroplaat en plaats deze in de analysator om de test uit te voeren.

8. De test uitvoeren

  1. Zodra de kalibratie is voltooid, geeft de software het dialoogvenster Load Cell Plate weer.
  2. Klik op Lade openen om de nutslade te vervangen door een microplaat voor celkweek. Zorg ervoor dat het deksel is verwijderd en dat de A1 van de plaat in de juiste richting past.
  3. Klik vervolgens op Load Cell Plate om de test te starten. De sensorcartridge blijft in de analysator voor de testinjecties.
  4. Wacht tot de test begint en de geschatte tijd van voltooiing wordt weergegeven.
  5. Na voltooiing van de test geeft de software het dialoogvenster Sensorcartridge verwijderen weer. Klik op Uitwerpen en verwijder de celkweekmicroplaat uit de analyzer.
  6. Verwijder voorzichtig de sensorcartridge en plaats het deksel van de celplaat terug. De cellen zijn klaar voor fluorescerende beeldvorming en celtelling.
  7. Nadat u de celplaat en de sensorcartridge hebt verwijderd, wordt het dialoogvenster Test voltooid weergegeven.
  8. Klik op Resultaten bekijken om het testresultaatbestand te openen en de gegevens onmiddellijk te normaliseren of klik op Home.

9. Verkrijg fluorescentiebeelden en normaliseer

OPMERKING: Deze stap is een optionele maar geprefereerde methode voor de normalisatie van BMSC's en osteoblasten. Als er geen beeldvormingsapparatuur beschikbaar is, moet een andere normalisatiemethode worden uitgevoerd, zoals eiwit- of DNA-isolatie en kwantificering.

figure-protocol-4
Figuur 5: Representatieve beelden van de beeldvormingssoftware die wordt gebruikt voor de normalisatie van gegevens uit de test. (A) Gestikt helder veldbeeld dat de celconfluentie door de hele put laat zien. (B) Gestikte fluorescentieafbeelding met Hoechst-gekleurde kernen van osteoblasten die worden gebruikt voor het tellen van celnummers om de testresultaten te normaliseren. Dit zijn osteoblasten na 7 dagen differentiatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Nadat de test is voltooid, scant u de streepjescode van de plaat met de handheld barcodelezer. Als de plaat al is afgebeeld, is er geen nieuwe naam nodig.
  2. Selecteer Fluorescentie en celtelling, plaats de celplaat op de ladehouder en klik op Lade sluiten.
  3. Selecteer in het venster voor het verkrijgen van afbeeldingen de optie Alle putten scannen om de beeldvorming te starten. Fluorescentiebeeldvorming duurt ongeveer 15-20 minuten om de hele plaat te scannen. Let op het groene vinkje dat aangeeft dat de scan is voltooid.
  4. Bekijk de fluorescerende beelden en celtellingen in de imaging- en celbeeldvormingstoepassing door willekeurig op een paar van de putten te klikken.
    OPMERKING: Er is een optie om getelde cellen rechtsonder in het scherm te bekijken. Met deze optie wordt een gemaskeerde afbeelding weergegeven, waarbij de objecten worden gemarkeerd die zijn geteld.
  5. Zodra de fluorescentiebeeldvorming is voltooid, exporteert u de afbeeldingen voor aanvullende verwijzingen.
  6. Zodra de beeldvorming en het aantal cellen zijn voltooid, opent u het resultatenbestand en klikt u op Normaliseren. Het normalisatiescherm geeft de plaatindeling en een optie om het celgetal te importeren.
  7. Klik op Importeren en selecteer Toepassen voor de desktopsoftware om de test automatisch te normaliseren met het aantal cellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

figure-results-1
Figuur 6: Representatieve grafieken voor routinematig uitgevoerde assays om het cellulaire bio-energetische profiel van controle versus behandelingsgroep met hun respectieve standaardfouten te begrijpen. (A) De celenergiefenotypetest. De grafiek vertegenwoordigt de glycolyse (ECAR) versus mitochondriale ademhaling (OCR) van d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De real-time cel metabole flux analyzer kan worden gebruikt om cellulaire energetica onder verschillende omstandigheden te verkennen. Het protocol illustreert de efficiënte isolatie van BMSC's, het kweken van cellen in geschikte celkweekplaten en hun differentiatie tot volwassen osteoblasten, die kunnen worden gebruikt voor verschillende testen met behulp van de extracellulaire fluxanalysator. Verder worden de kritieke stappen van real-time celstofwisselingsfluxtest, inclusief hydratatie van sensorpatronen, laden van de ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Health (NIH) National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS) Grant AR072123 en National Institute on Aging (NIA) Grant AG069795 (aan ERR).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.25% Trypsin EDTASigma-AldrichT4049
2-cyano-3-(1-phenyl-1H-indol-3-yl)-2-propenoic acidSigma - AldrichPZ0160UK5099
Antimycin ASigma - AldrichA8674
Ascorbic acidSigma-AldrichA4544-100G
Bis-2-(5-phenylacetamido-1,3,4-thiadiazol-2-yl)ethyl sulfideSigma - AldrichSML0601BPTES
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazoneSigma - AldrichC2920FCCP
Cytation 5 imaging readerBioTekN/AMicroplate imager
Etomoxir sodium salt hydrateSigma - AldrichE1905
Hoechst 33342 Solution (20 mM)Thermo Scientific62249
InsulinSigma - AldrichI6634
Oleic Acid-Albumin from bovine serumSigma - AldrichO3008
Oligomycin A - 5 mgSigma - Aldrich75351
RotenoneSigma - AldrichR8875-1G
Seahorse XF 1.0 M Glucose SolutionAgilent Technologies103577-100
Seahorse XF 100mM Pyruvate SolutionAgilent Technologies103578-100
Seahorse XF 200mM Glutamine solutionAgilent Technologies103579-100
Seahorse XF DMEM mediaAgilent Technologies103575-100DMEM assay media eith 5mM HEPES, pH 7.4, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, pyruvate, and L-glutamine
Seahorse XFe96 AnalyzerAgilent TechnologiesS7800BReal- Time Metabolic flux analyzer
Seahorse XFe96 FluxPakAgilent Technologies102416-100Includes XFe96 Sensor cartridges, Cell culture microplates, and Seahorse XF Calibrant solution
The Cell imaging 1.1.0.11 softwareAgilent Technologies - BioTek
Wave software 2.6.1Agilent Technologies
β-glycerol phosphateSigma-AldrichG9422-50G

Referenties

  1. Rodan, G. A. Bone homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (23), 13361-13362 (1998).
  2. Nakahama, K. I. Cellular communications in bone homeostasis and repair. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (23), 4001-4009 (2010).
  3. Kim, J. M., Lin, C., Stavre, Z., Greenblatt, M. B., Shim, J. H. Osteoblast-osteoclast communication and bone homeostasis. Cells. 9 (9), 2073(2020).
  4. Gao, J., et al. SIRT3/SOD2 maintains osteoblast differentiation and bone formation by regulating mitochondrial stress. Cell Death and Differentiation. 25 (2), 229-240 (2018).
  5. Baron, R. Molecular mechanisms of bone resorption by the osteoclast. The Anatomical Record. 224 (2), 317-324 (1989).
  6. Tian, L., Rosen, C. J., Guntur, A. R. Mitochondrial Function and Metabolism of Cultured Skeletal Cells. Methods in Molecular Biology. 2230, Clifton, N.J. 437-447 (2021).
  7. Zanotelli, M. R., et al. Regulation of ATP utilization during metastatic cell migration by collagen architecture. Molecular Biology of the Cell. 29 (1), 1-9 (2018).
  8. Gonzales, S., Wang, C., Levene, H., Cheung, H. S., Huang, C. Y. C. ATP promotes extracellular matrix biosynthesis of intervertebral disc cells. Cell and Tissue Research. 359 (2), 635-642 (2015).
  9. Kruse, N. J., Bornstein, P. The metabolic requirements for transcellular movement and secretion of collagen. Journal of Biological Chemistry. 250 (13), 4841-4847 (1975).
  10. Rendina-Ruedy, E., Guntur, A. R., Rosen, C. J. Intracellular lipid droplets support osteoblast function. Adipocyte. 6 (3), 250-258 (2017).
  11. Sinnott-Armstrong, N., et al. A regulatory variant at 3q21.1 confers an increased pleiotropic risk for hyperglycemia and altered bone mineral density. Cell Metabolism. 33 (3), 615-628 (2021).
  12. Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).
  13. Borle, A. B., Nichols, N., Nichols, G. Metabolic studies of bone in vitro: I. Normal bone. Journal of Biological Chemistry. 235, 1206-1210 (1960).
  14. Borle, A. B., Nichols, N., Nichols, G. Metabolic studies of bone in vitro: II. The metabolic patterns of accretion and resorption. Journal of Biological Chemistry. 235, 1211-1214 (1960).
  15. Adamek, G., Felix, R., Guenther, H. L., Fleisch, H. Fatty acid oxidation in bone tissue and bone cells in culture. Characterization and hormonal influences. The Biochemical Journal. 248 (1), 129-137 (1987).
  16. Frey, J. L., et al. Wnt-Lrp5 signaling regulates fatty acid metabolism in the osteoblast. Molecular and Cellular Biology. 35 (11), 1979-1991 (2015).
  17. Romero, N., Rogers, G., Neilson, A., Dranka, B. P. Quantifying cellular ATP production rate using agilent seahorse XF technology. , (2018).
  18. vander Windt, G., Chang, C., Pearce, E. Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse Extracellular Flux Analyzer. Current Protocols in Immunology. 113, 1(2016).
  19. Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (117), e54918(2016).
  20. Noel, P., et al. Preparation and metabolic assay of 3-dimensional spheroid co-cultures of pancreatic cancer cells and fibroblasts. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (126), e56081(2017).
  21. Nicholls, D., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2511(2010).
  22. Sakamuri, S. S. V. P., et al. Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 Analyzer: applications for aging research. GeroScience. 40 (3), 347-356 (2018).
  23. What are the advantages of using Seahorse XF technology. , Available from: https://www.agilent.com/en/support/cell-analysis/advantages-of-using-xf-tech (2018).
  24. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. O. Review: Quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. Journals of Gerontology - Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  25. XF cell energy phenotype test. , Available from: https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740884 (2021).
  26. Leung, D. T. H., Chu, S. Measurement of oxidative stress: Mitochondrial function using the seahorse system. Methods in Molecular Biology. 1710, Clifton, N.J. 285-293 (2018).
  27. XF ATP rate assay. , Available from: https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740889 (2021).
  28. XF cell mito stress test. , Available from: https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740885 (2021).
  29. XF cell mito fuel flex test. , Available from: https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740888 (2021).
  30. Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors from mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56750(2018).
  31. Wei, J., et al. Glucose uptake and Runx2 synergize to orchestrate osteoblast differentiation and bone formation. Cell. 161 (7), 1576-1591 (2015).
  32. Zoch, M. L., Abou, D. S., Clemens, T. L., Thorek, D. L. J., Riddle, R. C. In vivo radiometric analysis of glucose uptake and distribution in mouse bone. Bone Research. 4, 16004(2016).
  33. Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).
  34. Kam, Y., Jastromb, N., Clayton, J., Held, P., Dranka, B. Normalization of agilent seahorse XF data by in-situ cell counting using a BioTek cytation 5 application note. , (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

ATP-productiesnelheidbeenmergstromale cellenosteoblastdifferentiatiemitochondriale respiratieglycolysesnelheidcellulaire energeticaXF ATP Rate Assayfluorescentiebeeldvorming
Real-time cell metabolic flux analyzer gebruiken om osteoblast bio-energetica te monitoren
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.