Methodenartikel

Isoleer celtypespecifieke RNA's uit snap-frozen heterogene weefselmonsters zonder celsortering

DOI:

10.3791/63143

⸱

8 december 2021

 , 
1Department of Anatomy, Physiology and Pharmacology, College of Veterinary Medicine, Auburn University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol is bedoeld om celtypespecifiek te isoleren, ribosomale mRNA's te vertalen met behulp van het NuTRAP-muismodel.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cellulaire heterogeniteit vormt een uitdaging voor het begrijpen van de functie van complexe weefsels op transcriptoomniveau. Het gebruik van celtypespecifieke RNA's vermijdt potentiële valkuilen veroorzaakt door de heterogeniteit van weefsels en ontketent de krachtige transcriptoomanalyse. Het hier beschreven protocol demonstreert hoe de Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) methode kan worden gebruikt om ribosoomgebonden RNA's te isoleren van een kleine hoeveelheid EGFP-expresserende cellen in een complex weefsel zonder celsortering. Dit protocol is geschikt voor het isoleren van celtypespecifieke RNA's met behulp van het onlangs beschikbare NuTRAP-muismodel en kan ook worden gebruikt om RNA's te isoleren van EGFP-expressiecellen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

High-throughput benaderingen, waaronder RNA-sequencing (RNA-seq) en microarray, hebben het mogelijk gemaakt om genexpressieprofielen op genoombreed niveau te ondervragen. Voor complexe weefsels zoals het hart, de hersenen en testis zullen de celtypespecifieke gegevens meer details geven waarin het gebruik van RNA's uit het hele weefsel wordt vergeleken 1,2,3. Om de impact van cellulaire heterogeniteit te overwinnen, is de Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) methode ontwikkeld sinds het begin van de jaren 20104. TRAP is in staat om ribosoomgebonden RNA's te isoleren van specifieke celtypen zonder weefseldissociatie. Deze methode is gebruikt voor translatoom (mRNA's die worden gerekruteerd voor het ribosoom voor vertaling) analyse in verschillende organismen, waaronder het richten op een uiterst zeldzame populatie spiercellen in Drosophila embryo's5, het bestuderen van verschillende wortelcellen in de modelplant Arabidopsis thaliana6, en het uitvoeren van transcriptoomanalyse van endotheelcellen bij zoogdieren7.

TRAP vereist een genetische modificatie om het ribosoom van een modelorganisme te labelen. Evan Rosen en collega's hebben onlangs een muismodel ontwikkeld met de naam Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) muis8, dat sinds 2017 beschikbaar is via het Jackson Laboratory. Door te kruisen met een Cre-muislijn kunnen onderzoekers dit NuTRAP-muismodel gebruiken om ribosoomgebonden RNA's en celkernen te isoleren van Cre-tot expressie brengende cellen zonder celsortering. In Cre-expresserende cellen die ook het NuTRAP-allel dragen, maakt het EGFP / L10a-gelabelde ribosoom de isolatie mogelijk van het vertalen van mRNA's met behulp van affiniteit pulldown-assays. In dezelfde cel maakt het biotine ligase herkenningspeptide (BLRP)-gelabelde kernmembraan, dat ook mCherry-positief is, de nucleaire isolatie mogelijk door gebruik te maken van affiniteits- of fluorescentiegebaseerde zuivering. Hetzelfde onderzoeksteam genereerde ook een vergelijkbare muislijn waarin het kernmembraan alleen wordt gelabeld met mCherry zonder biotine8. Deze twee genetisch gemodificeerde muislijnen geven toegang tot het karakteriseren van gepaarde epigenomische en transcriptomische profielen van specifieke soorten cellen in belang.

De egel (Hh) signaleringsroute speelt een cruciale rol in de weefselontwikkeling9. GLI1, een lid van de GLI-familie, fungeert als een transcriptionele activator en bemiddelt de Hh-signalering. Gli1+ cellen zijn te vinden in veel hormoonafscheidende organen, waaronder de bijnier en de testis. Om celtypespecifieke DNA's en RNA's uit Gli1+ cellen te isoleren met behulp van het NuTRAP-muismodel , werden Gli1-CreERT2-muizen gekruist met de NuTRAP-muizen . Shh-CreERT2-muizen werden ook gekruist met de NuTRAP-muizen die sonische egel (Shh) tot expressie brengen van cellen te isoleren. Het volgende protocol laat zien hoe u Gli1-CreERT2 gebruikt; NuTRAP-muizen om ribosoomgebonden RNA's te isoleren uit Gli1+ cellen in volwassen muistestes.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle uitgevoerde dierproeven volgden de protocollen die zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) aan de Auburn University.

OPMERKING: Het volgende protocol gebruikt één testis (ongeveer 100 mg) bij P28 van Gli1-CreERT2; NuTRAP muizen (Mus musculus). Volumes reagentia moeten mogelijk worden aangepast op basis van de soorten monsters en het aantal weefsels.

1. Weefselverzameling

  1. Euthanaseer de muizen met behulp van een CO2-kamer , ontsmet het buikoppervlak met 70% ethanol.
  2. Open de onderbuik met een schaar en verwijder de teelballen. Gebruik vloeibare stikstof (LN2) om de teelballen onmiddellijk te bevriezen.
  3. Bewaar monsters in de dampfase van LN2 tot gebruik.

2. Bereiding van reagentia en kralen

  1. Bereid de homogenisatie stockoplossing: Voeg 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl, 1% NP-40 en 1 mg/ml heparine toe. Bewaar de oplossing bij 4 °C tot gebruik (maximaal 1 maand).
  2. Bereid de homogenisatiewerkbuffer uit de stamoplossing (stap 2.1) vers voor gebruik: Voeg DTT (eindconcentratie: 1 mM), cycloheximide (eindconcentratie: 100 μg/ml), recombinant ribonuclease (eindconcentratie: 200 eenheden/ml) en proteaseremmercocktail (eindconcentratie: 1x) toe aan de homogenisatievoorraadoplossing om de vereiste hoeveelheid van de homogenisatiewerkbuffer te maken. Bewaar de vers bereide werkbuffer op ijs tot gebruik.
  3. Bereid de zoutarme en de zoutrijke wasbuffers:
    1. Voor de bereiding van zoutarme wasbuffer mengt u 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl en 1% NP-40. Voeg voor gebruik DTT (eindconcentratie: 1 mM) en cycloheximide (eindconcentratie: 100 μg/ml) toe.
    2. Voor de bereiding van zoutrijke wasbuffer mengt u 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 300 mM KCl, 1% NP-40. Voeg voor gebruik DTT (eindconcentratie: 2 mM) en Cycloheximide (eindconcentratie: 100 μg/ml) toe.
  4. Bereid eiwit G-kralen (materiaaltabel):
    1. Elk monster heeft 50 μL eiwit G-kralen nodig. Plaats de benodigde hoeveelheid kralen in een centrifugebuis van 1,5 ml en scheid de kralen van de oplossing met behulp van een magnetisch rek door de buis 30-60 s op het rek te laten liggen.
    2. Verwijder het supernatant door te pipetteren. Was de kralen drie keer met telkens 1 ml ijskoude zoutarme wasbuffer.

3. Weefsellyse en homogenisatie

  1. Voeg 2 ml ijskoude homogenisatiewerkbuffer (vers bereid uit stap 2.2) toe aan een glazen weefselslijpset. Plaats het bevroren monster snel in de molen en homogeniseer het weefsel met 30 slagen op ijs met behulp van een losse stamper.
  2. Breng het homogenaat over in een buis met ronde bodem van 2 ml en centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  3. Breng het supernatant over in een nieuwe buis van 2 ml. Bespaar 100 μL aan een buis van 1,5 ml als "ingang".
  4. Incubeer het supernatant in de buis van 2 ml met het anti-GFP-antilichaam (5 μg/ml; 1:400) bij 4 °C op een end-over-end rotator (24 rpm) 's nachts.

4. Immunoprecipitatie

  1. Breng het homogenaat/antilichaammengsel over in een nieuwe buis met ronde bodem van 2 ml met daarin de gewassen eiwit G-kralen uit stap 2.4. Incubeer bij 4 °C op een end-over-end rotator (24 rpm) gedurende 2 uur.
  2. Scheid de magnetische kralen van het supernatant met behulp van een magneetrek. Bewaar het supernatant als de "negatieve fractie". De negatieve fractie bevat (1) RNA's in EGFP-negatieve cellen en (2) RNA's in EGFP-positieve cellen die niet gebonden zijn aan ribosomen.
  3. Voeg 1 ml zoutrijke wasbuffer toe aan de kralen en draai de buis kort om de kralen te wassen. Plaats de buis in een magneetrek.
  4. Verwijder de wasbuffer. Herhaal de wasstap nog twee keer. De kralen bevatten nu het kralen-ribosoom-RNA-complex van EGFP-positieve cellen.

5. RNA-extractie

OPMERKING: De volgende stappen zijn aangepast van de RNA-isolatiekit (Materiaaltabel). Behandel elke fractie (d.w.z. input, positief en negatief) als een onafhankelijk monster en isoleer RNA's onafhankelijk.

  1. Incubeer de kralen uit stap 4.4 met 50 μL extractiebuffer (uit de RNA-isolatiekit) in een thermomixer (42 °C, 500 tpm) gedurende 30 minuten om RNA's uit kralen vrij te maken.
  2. Scheid de kralen met een magneetrek, breng het supernatant dat het kralen-ribosoom-RNA-complex bevat over naar een buis van 1,5 ml.
  3. Centrifugeer de buis op 3000 x g gedurende 2 minuten en pipetteer het supernatant vervolgens naar een nieuwe buis van 1,5 ml. Deze buis bevat de "positieve fractie" van de TRAP-stap.
    OPMERKING: Voor de input en de negatieve fracties, extraheer RNA uit 25 μL monsters met behulp van 1 ml extractiebuffer. Incubeer in een thermomixer (42 °C, 500 tpm) gedurende 30 min.
  4. Conditioneer de RNA-zuiveringskolom vooraf: Pipet 250 μL conditioneringsbuffer op de zuiveringskolom. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT). Centrifugeer de kolom bij 16.000 x g gedurende 1 min.
  5. Pipetteer gelijk volume van 70% EtOH in het supernatant vanaf stap 5.3 (ongeveer 50 μL van 70% EtOH voor de positieve fractie en 1 ml van 70% EtOH voor de input en de negatieve fracties). Meng goed door op en neer te pipetteren.
  6. Pipetteer het mengsel in de kolom vanaf stap 5.4.
  7. Centrifugeer de kolom bij 100 x g gedurende 2 minuten om RNA-binding aan het membraan in de kolom mogelijk te maken en ga vervolgens onmiddellijk verder met centrifugeren bij 16.000 x g gedurende 30 s. Gooi de doorstroom weg.
    OPMERKING: Voeg voor de input en de negatieve fracties telkens 250 μL van het mengsel toe aan de kolom. Herhaal stap 5.6 en 5.7 totdat alle mengsels zijn gebruikt.
  8. Pipetteer 100 μL washbuffer 1 (W1) in de kolom en centrifugeer bij 8.000 x g gedurende 1 min. Gooi de doorstroom weg.
  9. Pipet 75 μL DNase-oplossing meng direct in het zuiveringskolommembraan. Incubeer bij RT gedurende 15 min.
  10. Pipetteer 40 μL W1 in de kolom en centrifugeer bij 8.000 x g gedurende 30 s. Gooi de doorstroom weg.
  11. Pipetteer 100 μL wasbuffer 2 (W2) in de kolom en centrifugeer bij 8.000 x g gedurende 1 minuut. Gooi de doorstroom weg.
  12. Pipetteer 100 μL W2 in de kolom en centrifugeer bij 16.000 x g gedurende 2 min. Gooi de doorstroom weg. Centrifugeer dezelfde kolom opnieuw bij 16.000 x g gedurende 1 minuut om alle sporen van wasbuffer voorafgaand aan de elutiestap te verwijderen.
  13. Breng de kolom over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml.
  14. Pipetteer 12 μL RNase-vrij water rechtstreeks op het membraan van de zuiveringskolom. De pipetpunt mag het membraan niet raken. Incubeer bij RT gedurende 1 min en centrifugeer bij 1000 x g gedurende 1 min. Ga vervolgens door met centrifugatie bij 16.000 x g gedurende 1 minuut om het RNA te elueren.

6. RNA-concentratie en kwaliteit

  1. Gebruik een bioanalyzer om de kwaliteit en kwantiteit van het geëxtraheerde RNA10 te beoordelen.

7. Opslag en verdere analyse

  1. Bewaar het RNA bij -80 °C (tot 1 jaar) tot verdere analyse (bijv. microarray, kwantitatieve PCR (qPCR) en RNA-seq, enz.).
    OPMERKING: Voor details van de qPCR-analyse, inclusief cDNA-synthese, raadpleegt u Lyu et al.11. Primers voor qPCR staan vermeld in de tabel met materialen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli1-CreERT2-muizen (Jackson Lab Stock Number: 007913) werden voor het eerst gekruist met de NuTRAP-reportermuis (Jackson Lab Stock Number: 029899) om dubbelmutante muizen te genereren. Muizen met beide genetisch gemanipuleerde gen-allelen (d.w.z. Gli1-CreERT2 en NuTRAP) werden eenmaal daags, om de andere dag, geïnjecteerd met tamoxifen gedurende drie injecties. Weefselmonsters werden verzameld op de7e dag na de1e dag van de injectie. Immunofluorescen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het nut van de analyse van het hele weefsel transcriptoom kan worden gedempt, vooral bij het bestuderen van complexe heterogene weefsels. Het verkrijgen van celtype-specifieke RNA's wordt een dringende noodzaak om de krachtige RNA-seq-techniek te ontketenen. De isolatie van celtypespecifieke RNA's is meestal afhankelijk van het verzamelen van een specifiek type cellen met behulp van micromanipulatie, fluorescent-activated cell sorting (FACS) of laser capture microdissection (LCM)18. Andere moderne...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door NIH R00HD082686. We bedanken de Endocrine Society Summer Research Fellowship aan H.S.Z. We bedanken ook Dr. Yuan Kang voor het fokken en onderhouden van de muizenkolonie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
ActbeurofinsqPCR primersATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer)
BioanalyzerAgilent2100 Bioanalyzer Instrument
cOmplete Mini EDTA-vrije Protease Inhibitor CocktailMillipore11836170001
cycloheximideMillipore239764-100MG
Cyp11a1eurofinsqPCR primersCTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer)
dNTPThermo Fisher ScientificR0191
DTT, DithiothreitolThermo Fisher ScientificP2325
DynaMag-2 magneetThermo Fisher Scientific12321D
Falcon tubes 15 mLVWR89039-666
GFP antilichaamAbcamab290
Glass grinder setDWK Life Sciences357542
heparineBEANTOWN CHEMICAL139975-250MG
Hsd3beurofinsqPCR primersGACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer)
KClBiosciencesR005
MgCl2BiosciencesR004
Microcentrifuge tubes 2 mLThermo Fisher Scientific02-707-354
Mouse Clariom S Assay microarraysThermo Fisher ScientificMicroarray service
NP-40Millipore492018-50 Ml
oligo (dT)20Invitrogen18418020
PicoPure RNA Isolation KitThermo Fisher ScientificKIT0204
Protein G DynabeadThermo Fisher Scientific10003D
RNase-vrij watergrowcellsNUPW-0500
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease InhibitorThermo Fisher Scientific10777019
Sox9eurofinsqPCR primersTGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer
Superscript IV reverse transcriptaseInvitrogen18090050
SYBR Green PCR Master MixThermo Fisher Scientific4309155
Sycp3eurofinsqPCR primersGAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer)
TrisAlfa AesarJ62848

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yang, K. C., et al. Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support. Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).
  2. Soumillon, M., et al. Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis. Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).
  3. Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
  4. Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).
  5. Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. J. J. TRAP-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e52985(2015).
  6. Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. Translating ribosome affinity purification (trap) to investigate Arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60919(2020).
  7. Moran, P., et al. Translating ribosome affinity purification (TRAP) for RNA isolation from endothelial cells in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59624(2019).
  8. Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
  9. Varjosalo, M., Taipale, J. Hedgehog: functions and mechanisms. Genes & Development. 22 (18), 2454-2472 (2008).
  10. Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. RNA integrity number (RIN)-standardization of RNA quality control. Agilent Technologies. , Application Note 1 1-8 (2004).
  11. Lyu, Q., et al. RNA-seq reveals sub-zones in mouse adrenal zona fasciculata and the sexually dimorphic responses to thyroid hormone. Endocrinology. 161 (9), (2020).
  12. King, P., Paul, A., Laufer, E. Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21185-21190 (2009).
  13. Huang, C. C., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by sonic hedgehog. Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).
  14. Benton, L., Shan, L. -X., Hardy, M. P. Differentiation of adult Leydig cells. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1-6), 61-68 (1995).
  15. Monder, C., Hardy, M., Blanchard, R., Blanchard, D. Comparative aspects of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase. Testicular 11β-hydroxysteroid dehydrogenase: development of a model for the mediation of Leydig cell function by corticosteroids. Steroids. 59 (2), 69-73 (1994).
  16. Bitgood, M. J., Shen, L., McMahon, A. P. Sertoli cell signaling by Desert hedgehog regulates the male germline. Current Biology. 6 (3), 298-304 (1996).
  17. Beverdam, A., et al. Sox9-dependent expression of Gstm6 in Sertoli cells during testis development in mice. Reproduction. 137 (3), 481(2009).
  18. Gross, A., et al. Technologies for single-cell isolation. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 16897-16919 (2015).
  19. Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
  20. Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches. Frontiers in Cell and Development Biology. 6, 108(2018).
  21. Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693(2020).
  22. Barsoum, I., Yao, H. H. Redundant and differential roles of transcription factors Gli1 and Gli2 in the development of mouse fetal Leydig cells. Biology of Reproduction. 84 (5), 894-899 (2011).
  23. Mori, H., Shimizu, D., Fukunishi, R., Christensen, A. K. Morphometric analysis of testicular Leydig cells in normal adult mice. The Anatomical Record. 204 (4), 333-339 (1982).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Celtypespecifiek RNAzuivering van ribosomen met affiniteit voor vertalingribosoomgebonden RNAEGFP expresserende cellenNuTRAP muismodelRNA zuiveringisolatie met magnetische kralenmicroarray analysekwantitatieve RT PCRweefselhomogenisatie

Gerelateerde artikelen