De interactie van een ATP-afhankelijke chromatine remodeller met een DNA-ligand wordt beschreven met behulp van CD-spectroscopie. De geïnduceerde conformatieveranderingen op een genpromotor geanalyseerd door de gegenereerde pieken kunnen worden gebruikt om het mechanisme van transcriptionele regulatie te begrijpen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
CD-spectroscopie om DNA-eiwitinteracties te bestuderen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Circulaire dichroïsme (CD) spectroscopie is een eenvoudige en handige methode om de secundaire structuur en interacties van biomoleculen te onderzoeken. Recente ontwikkelingen in CD-spectroscopie hebben de studie van DNA-eiwitinteracties en conformatiedynamiek van DNA in verschillende micro-omgevingen in detail mogelijk gemaakt voor een beter begrip van transcriptionele regulatie in vivo. Het gebied rond een potentiële transcriptiezone moet worden afgewikkeld om transcriptie te laten plaatsvinden. Dit is een complex proces dat de coördinatie van histonmodificaties, binding van de transcriptiefactor aan DNA en andere chromatineremodelleringsactiviteiten vereist. Met behulp van CD-spectroscopie is het mogelijk om conformationele veranderingen in het promotorgebied te bestuderen die worden veroorzaakt door regulerende eiwitten, zoals ATP-afhankelijke chromatineremodelleurs, om transcriptie te bevorderen. De conformatieveranderingen die zich in het eiwit voordoen, kunnen ook worden gevolgd. Bovendien kunnen vragen over de affiniteit van het eiwit ten opzichte van het doel-DNA en de sequentiespecificiteit worden beantwoord door mutaties in het doel-DNA op te nemen. Kortom, het unieke begrip van deze gevoelige en goedkope methode kan veranderingen in de chromatinedynamica voorspellen, waardoor het begrip van transcriptionele regulatie wordt verbeterd.
Inleiding
Circulair dichroïsme (CD) is een spectroscopische techniek die vertrouwt op de inherente chiraliteit van biologische macromoleculen die leidt tot differentiële absorptie van rechtshandig en linkshandig circulair gepolariseerd licht. Deze differentiële absorptie staat bekend als circulair dichroïsme. De techniek kan daarom worden gebruikt om de conformatie van biologische macromoleculen, zoals eiwitten en DNA, die beide chirale centra bevatten1,2 af te bakenen.
Elektromagnetische golven bevatten zowel elektrische als magnetische componenten. Zowel het elektrische als het magnetisch v....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Werkconcentratie van de reactiecomponenten
- Bereid de werkconcentraties van buffers voor CD en andere reactiecomponenten vers voor (zie tabel 1) en houd ze op 4 °C voordat u de reacties instelt.
OPMERKING: Voor de cd-reacties die in dit artikel worden beschreven, zijn de werkconcentraties van componenten als volgt: Natriumfosfaatbuffer (pH 7,0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 nM, Eiwit 1 μM, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 μM.
2. ATPase activiteit
- Stel vóór cd-spectroscopie de ATPase-activiteit van het eiwit vast in aanwezigheid van de DNA-moleculen om e....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
ADAAD stabiliseert een steel-loop achtige structuur op de MYC promotor
Eerder experimenteel bewijs toonde aan dat SMARCAL1 een negatieve regulator is van MYC29. Analyse van het 159 bp lange promotorgebied van het MYC-gen door QGRS mapper toonde aan dat de voorwaartse streng het potentieel had om een G-quadruplex te vormen (tabel 2). Mfold toonde aan dat beide strengen van het MYC-DNA een sten.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het doel van dit artikel is om de CD-spectroscopietechniek te introduceren als een benadering om de conformatieveranderingen in het DNA te bestuderen in de aanwezigheid van ATP-afhankelijke chromatineremodelleringseiwitten en om deze conformatieveranderingen te koppelen aan genexpressie. CD-spectroscopie biedt een snelle en gemakkelijk toegankelijke methode om de conformationele veranderingen in DNA te bestuderen.
Een cruciaal punt om te overwegen voor deze techniek is de zuiverheid va.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenverstrengeling te melden.
Dankbetuigingen
De auteurs willen Advanced Instrumentation Research Facility, JNU, bedanken voor de CD spectrofotometer. V.J. en A.D. werden ondersteund door een fellowship van CSIR.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 2-Mercaptoethanol | Fisher scientific | O3446I-100 | |
| Adenosine 5'-trifosfaat dinatriumzoutwater | Sigmaaldrich | A2383 | |
| CD Quartz Cuvet | STARNA | 21-Q-1 | |
| Chirascan V100 CD-spectrometer | Applied Photophysics | Niet beschikbaar | |
| EDTA-dinatriumzoutdihydraat | SRL | 43272 | |
| Glutathione Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0756-01 | Glutathione affiniteitschromatografie |
| Hellmanex III reinigingsoplossing | Hellma | 9-307-011-4-507 | |
| L-Lactaatdehydrogenase | Sigmaaldrich | L2625 | |
| Magnesiumacetaattetrahydraat | Fisher scientific | BP215-500 | |
| Magnesiumchloridehexahydraat | Fisher scientific | M33-500 | |
| NADH-dinatriumzout | Sigmaaldrich | 10107735001 | |
| Fosfoenolpyrovaatmonocyclohexylammoniumzout | SRL | 40083 | |
| Kaliumacetaat | Fisher scientific | P178-3 | |
| Pyruvatkinase | Sigmaaldrich | P1506 | |
| Dinatriumfosfaatwatervrij | Fisher scientific | S374-500 | |
| Mononatriumfosfaatmonohydraat | Fisher scientific | S369-500 | |
| Synergy HT microplaatlezer | BioTek | Niet beschikbaar | |
| Tris-base | Fisher scientific | BP152-500 |
Referenties
- Woody, R. W. Circular dichroism. Methods in Enzymology. 246, 34-71 (1995).
- Kelly, S., Price, N. The Use of Circular Dichroism in the Investigation of Protein Structure and Function. Current Protein & Peptide Science. 1 (4), 349-384 (2000).
- Rodg....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
