Dit protocol beschrijft een sandwich-enzymgekoppelde immunosorbenttest om speekselkliersporozoïeten bij muggen te detecteren. Met behulp van gemakkelijk verkrijgbare monoklonale antilichamen maakt de methode kosteneffectieve detectie met hoge doorvoer mogelijk van muggen die Plasmodium falciparum of Plasmodium vivax dragen. De methode is geschikt voor onderzoek naar de overdracht van malaria, inclusief vectoronderzoeken.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Detectie van Plasmodium Sporozoïeten bij Anopheles-muggen met behulp van een enzymgekoppelde immunosorbenttest
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Plasmodium sporozoïeten zijn het infectieuze stadium van malariaparasieten die mensen infecteren. De sporozoïeten die zich in de speekselklieren van vrouwelijke Anopheles-muggen bevinden, worden via muggenbeten tijdens de bloedvoeding op mensen overgedragen. De aanwezigheid van sporozoïeten in de speekselklieren van muggen bepaalt dus de besmettelijkheid van muggen. Om te bepalen of een Anopheles-mug Plasmodium sporozoïeten bij zich draagt, is de enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA) -methode het standaardhulpmiddel geweest om het Plasmodium circumsporozoiet-eiwit (CSP), het belangrijkste oppervlakte-eiwit van de sporozoïeten, te detecteren. Bij deze methode wordt het hoofd samen met de thorax van elke mug gescheiden van de buik, gehomogeniseerd en onderworpen aan een sandwich-ELISA om de aanwezigheid van CSP te detecteren die specifiek is voor Plasmodium falciparum en elk van de twee subtypen, VK210 en VK247, van Plasmodium vivax. Deze methode is gebruikt om de overdracht van malaria te bestuderen, inclusief de seizoensgebonden dynamiek van muggeninfectie en de soorten van de belangrijkste malariavectoren op de onderzoekslocaties.
Inleiding
Plasmodium sporozoïeten zijn het infectieuze stadium van de malariaparasieten in de muggen. De sporozoïeten worden via muggenbeten bij de mens afgeleverd. Bij de mug vormen de sporozoïeten zich eerst in de oöcysten op de middendarmwand. Eenmaal klaar, worden ze vrijgelaten in de hemocoel en reizen ze naar de speekselklieren van muggen. Daar rijpen ze en worden ze klaar voor overdracht op mensen tijdens bloedvoeding. Bij mensen worden de sporozoïeten afgezet in de dermis. Vervolgens komen ze het bloedvat binnen en reizen ze langs de bloedcirculatie om de lever te bereiken om een infectie in de hepatocyten vast te stellen 1,2.
Er zijn drie verschillende methoden gebruikt om sporozoietinfectie van de speekselklieren van muggen vast te stellen. De eerste methode is de dissectie van de speekselklieren, gevolgd door direct onderzoek van sporozoïeten onder een lichtmicroscoop. Deze methode is de gouden standaard voor het detecteren en kwantificeren van sporozoïeten in de speekselklieren van Anopheles-muggen 3. Het vereist echter een technicus die goed is opgeleid in zowel dissectie als microscopisch onderzoek. Bovendien kan het niet worden gebruikt om Plasmodium-soorten en CSP-subtypering (voor P. vivax) te bepalen4,5. De tweede methode maakt gebruik van polymerasekettingreactie (PCR) om Plasmodium-DNA in het bovenste deel van het muggenlichaam te detecteren6. Gezien de specificiteit van PCR zijn zowel soorten als subtypering van de parasiet mogelijk 7,8,9,10. Hoewel PCR steeds vaker wordt gebruikt, vereist het relatief dure apparatuur en goed opgeleid personeel. De laatste methode, de ELISA om het Plasmodium-specifieke circumsporozoiet-eiwit (CSP) te detecteren, is al drie decennia de steunpilaar 11,12,13. CSP is aanwezig in zowel oöcystsporozoïeten als speekselkliersporozoïeten 12,14. Met behulp van specifieke antilichamen maakt deze methode het mogelijk om Plasmodium-soorten te identificeren en CSP-subtypering van P. vivax sporozoïeten te bepalen. De grondgedachte voor deze test is de vereiste van een eenvoudige high-throughput assay om een groot aantal wilde muggen te onderzoeken om de overdracht van malaria te begrijpen (d.w.z. het sporozoietinfectiepercentage te bepalen).
De ELISA-methode heeft twee belangrijke voordelen ten opzichte van microscopisch onderzoek. Ten eerste kunnen onderzoekers muggenmonsters bewaren totdat ze klaar zijn voor monsterverwerking. Ten tweede kan de ELISA-methode worden gebruikt om Plasmodium-soorten te differentiëren door middel van soortspecifieke monoklonale antilichamen. Bovendien kan ELISA een groter aantal muggen herbergen, waardoor een veel hogere doorvoer mogelijkis 15. Vergeleken met PCR, dat sporozoiet-DNA detecteert, kost de ELISA-procedure meer tijd, maar minder16. De hier beschreven ELISA-test is ontwikkeld om de infectiviteit van muggen te bepalen en CSP van P. falciparum en elk van de twee CSP-varianten van P. vivax, VK210 en VK247, afzonderlijk te detecteren. Deze ELISA-methode is in veel onderzoeken gebruikt om de seizoensgebonden dynamiek van muggeninfectie te bepalen en de soorten van de belangrijkste malariavectoren in het veld te identificeren 12,13,17,18. Om deze test uit te voeren, volstaat een standaard laboratorium dat is uitgerust met een ELISA-plaatlezer.
De algemene aanpak is samengevat in figuur 1. In deze sandwich ELISA wordt het primaire (capture) monoklonale antilichaam (mAb) dat specifiek is voor elke Plasmodium-soort /subtype eerst gebruikt om de ELISA-plaat te coaten. Elke plaat is gecoat met een enkele capture mAb. De functie van de mAb is om het overeenkomstige CSP-antigeen in de muggenhomogenaten op te vangen. Na het afvangen van antigeen en het wassen van platen, wordt een tweede CSP-specifiek antilichaam gelabeld met peroxidase gebruikt om de aanwezigheid van CSP gebonden aan de vangst-mAb te detecteren. De chemische reactie die door peroxidase wordt gekatalyseerd, resulteert in kleurontwikkeling in putten die positief zijn voor CSP.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bereiding van reagentia
OPMERKING: Raadpleeg de Tabel met materialen voor een lijst van apparatuur, reagentia en andere verbruiksartikelen die in dit protocol worden gebruikt en naar Tabel 1 voor een lijst met oplossingen en hun samenstelling.
- Vangst en peroxidase-geconjugeerde mAbs
- Om de mAb te reconstitueren, resuspendeert u de gevriesdroogde mAb in een 1:1 mengsel van gedestilleerd water:glycerol bij 0,5 mg/ml. Maak zo nodig aliquots om herhaaldelijk vries- en dooien te voorkomen en bewaar ze bij -20 °C.
- Blokkerende buffer (BB)
- Bereid de blokkeerbuffer voor door 5 g caseïne van ELISA-kwaliteit op te lossen in 100 ml 0,1 N NaOH. Voeg 900 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe (zie tabel 1) om het uiteindelijke volume op 1,0 l te brengen.
- Voeg 0,02 g fenolrood toe als indicator en pas de pH aan naar 7,4 met HCl. Bewaar BB maximaal een week bij 4 °C, of aliquot in 50 ml voor langdurige opslag bij -20 °C.
- Positieve controles
- Om de positieve controles te reconstrueren, rehydrateert u de gevriesdroogde eiwitten door 1.000 μL BB toe te voegen. Maak naar behoefte aliquots van de positieve controleoplossingen en bewaar deze bij -20 °C.
- Voor seriële verdunning wordt elke positieve controlegroep verder verdund tot de uiteindelijke werkconcentratie in BB als volgt: Pf, 2 pg/μl; Pv (VK210), 182 (pg/μL); Pv (VK247), 89 pg/μL.
OPMERKING: De exacte concentraties van de positieve controles kunnen van partij tot partij verschillen. Raadpleeg de productinformatiefiche voor de exacte benodigde concentratie. De concentraties positieve controles, uitgaande van de bovenstaande werkconcentratie, zijn 2, 1, 0,5, 0,25, 0,13, 0,06 pg/μL voor Pf; 182, 91, 46, 23, 11, 5,7 pg/μl voor PV210; en 89, 45, 22, 11, 5.6, 2.8 pg/μL PV247.
- Negatieve controles
OPMERKING: De ideale negatieve controle is de kop-thoraxhomogenaat van vrouwelijke Anopheles-muggen die identiek zijn bereid als de testmonsters. BB kan echter ook worden gebruikt als negatieve controle.- Met BB als negatieve controle gebruikt u de 2-voudige absorptiedrempel voor betrouwbare positieve uitlezingen.
2. Voorbereiding van muggenmonsters
- Scheid het hoofd en de borstkas van elke verzamelde volwassen mug van de buik met een steriel scheermesje. Plaats de kop en de thorax in een vooraf gelabelde centrifugemaalbuis van 1.5 ml. Zwembadhoofden en thoraces van maximaal 10 muggen indien gewenst.
OPMERKING: Voor de voorbereiding van het monster wordt meestal de speekselklier van een geïnfecteerde mug ontleed en onderworpen aan CS-ELISA. Het hoofd en de borstkas van verzamelde muggen kunnen echter ook worden gebruikt om CS-ELISA rechtstreeks uit te voeren (zonder speekselklieren te ontleden)12,13,19. - Voeg 50 μL Grinding Buffer (GB) toe aan elke buis en homogeniseer het monster met een schone stamper (gewassen met zeep). Spoel de gebruikte stamper met 250 μL GB in de buis met de gehomogeniseerde mug(en) tot een eindvolume van ~300 μL.
- Bewaar het monster in een vriezer (-20 °C) tot gebruik of ga onmiddellijk verder met het uitvoeren van ELISA.
3. Sporozoiet-ELISA
- Vul het werkblad met sporozoiet-ELISA in (zie Aanvullend materiaal 1). Bereid één ELISA-plaat voor voor elke CSP (Pf, Pv-210 of Pv-247).
- Bereid de capture mAb-werkoplossing voor door het antilichaam op te lossen in PBS: 4 μg/ml Pf; 2 μg/ml Pv-210; 2 μg/ml Pv-247. Bereken de benodigde volumes op basis van de toevoeging van 5 ml per plaat. Draai de oplossing voorzichtig rond.
- Pipetteer 50 μl van elke werkende mAb-oplossing uit stap 3.2 in elk putje van de ELISA-plaat. Dek de plaat af met een plastic deksel en incubeer gedurende 30 minuten of een nacht bij kamertemperatuur.
- Zuig de inhoud van het putje op en tik de plaat minstens 5 keer ondersteboven op keukenpapier om alle vloeistof te verwijderen.
OPMERKING: Als er geen aspiratiesysteem (meerkanaals vacuümzuiging aangesloten op schone tips) beschikbaar is, gooi dan de antilichamen in de gootsteen en tik vervolgens met de plaat op keukenpapier. - Voeg 200 μL BB toe om alle kuiltjes in de plaat te vullen. Dek de plaat af met een plastic deksel. Incubeer de plaat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Zuig de inhoud van de put op of gooi deze weg. Tik 5 keer ondersteboven op keukenpapier om alle vloeistof te verwijderen.
- Laad het mughomogenaat en de controle op de plaat als volgt.
- Voeg 50 μl van de positieve controle toe aan de putjes H1 en H2.
- Voeg 50 μL BB toe aan de putjes in de kolommen 1 en 2 van rij C tot en met G. Voeg vervolgens 50 μl van de positieve controle toe aan de putjes G1 en G2. Maak een seriële verdunning van de positieve controle, beginnend bij G1 en G2, gevolgd door F1 en F2 tot C1 en C2.
OPMERKING: Alle buisjes voor positieve controle moeten 50 μl bevatten. - Voeg 50 μL BB (negatieve controle) toe aan de putjes A1, A2, B1 en B2.
- Voeg 50 μL van elk homogenaatmonster toe aan een onbekend (Unk) putje.
- Dek de plaat af en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
- Begin na ongeveer 2 uur met het voorbereiden van de substraten. Voor de ABTS substraat 2-componenten kit meng je substraat A en substraat B in een verhouding van 1:1.
OPMERKING: Voor een volledige plaat met 96 putjes is 5 ml substraat A en 5 ml substraat B nodig. - Bereid de werkoplossingen van peroxidase-gelabelde mAbs voor Pf, Pv-210 en Pv-247 voor door BB toe te voegen aan het gereconstitueerde geconjugeerde mAb om een werkconcentratie van 1 μg/ml te verkrijgen.
- Bereken de benodigde volumes op basis van de toevoeging van 5 ml werkgeconjugeerde mAb-oplossing per plaat.
- Test de peroxidase-activiteit door 5 μl van de peroxidase-gelabelde mAb gemaakt in stap 3.8 te mengen met 100 μl van het substraat gemaakt in stap 3.7 in een aparte buis van 1,5 ml. Draai voorzichtig.
OPMERKING: Er moet een snelle kleurverandering zijn van helder naar groen, wat aangeeft dat het peroxidase-enzym en de substraten werken.
- Zuig de inhoud van het putje op of gooi het weg en tik 5 keer met de plaat ondersteboven op keukenpapier om alle vloeistof te verwijderen.
- Was de putjes twee keer met 200 μL PBS-Tween, zuig de putinhoud op en tik elk 5 keer op de plaat.
- Voeg 50 μl peroxidase-gelabelde mAb gemaakt in stap 3.8 toe aan elk putje. Dek de plaat af en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker. Zuig de inhoud van het putje op of gooi het weg en tik 5 keer ondersteboven op keukenpapier op het bord.
- Was de putjes 3 keer met 200 μL PBS-Tween, zuig de inhoud van het putje op en tik elk 5 keer op de plaat.
- Voeg 100 μl van de in stap 3.7 bereide substraatoplossing toe aan elk putje. Dek de plaat af en incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- Lees na 30 minuten de absorptie af bij 405-414 nm met behulp van een ELISA-plaatlezer.
OPMERKING: Volg de specifieke instructies voor de gebruikte ELISA-plaatlezer. Voor meer informatie over de instructies voor de software die voor dit protocol wordt gebruikt, zie Aanvullend materiaal S2. Er moet een merkbare kleurverandering zijn van helder naar groen in de positieve controleputjes.
4. Beoordeling
- Detecteren van positieve monsters.
- Label monsters met extinctiewaarden boven de cut-off (tweemaal de gemiddelde extinctiewaarde van de negatieve monsters) als positief.
- Kwantificeren van CSP
- Schat de CSP-concentratie in het monster aan de hand van de standaardcurve die als volgt is samengesteld op basis van de controleverdunningsreeks.
- Maak de standaardcurve door de extinctiewaarden (y-as) van de serieel verdunde controles uit te zetten tegen hun concentraties (x-as).
- Voer lineaire regressie uit om de beste pasvorm te bepalen met behulp van y = A + Bx, waarbij A en B vrije parameters zijn.
- Bepaal de CSP-concentratie voor elk positief monster door de vergelijking voor een gegeven absorptiewaarde op te lossen.
- Schat de CSP-concentratie in het monster aan de hand van de standaardcurve die als volgt is samengesteld op basis van de controleverdunningsreeks.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Representatieve ELISA-resultaten zijn weergegeven in figuur 2. In dit experiment detecteerde de P. falciparum ELISA sporozoietinfectie in put A7. De positieve put kon visueel worden gedetecteerd door zijn vage groene kleur (Figuur 2A). De extinctiewaarde van deze put lag boven de cut-off drempel (tweemaal de gemiddelde waarde van de vier negatieve controleputjes) (Figuur 2B). De verdeling van de absorptiewaarden van alle 80...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De CSP-ELISA biedt een zeer specifieke en kosteneffectieve methode om Plasmodium CSP te detecteren. Het maakt onderscheid mogelijk tussen P. falciparum en P. vivax sporozoïtes en tussen de twee subtypes, VK210 en VK247, van P vivax11,13,14,15. Bepaalde kritieke punten moeten in overweging worden genomen om betrouwbare en reproduceerbare resultaten te verkrijg...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Dankbetuigingen
Wij danken de heer Kirakorn Kiatibutr, MVRU, voor de training en begeleiding. We danken ook mevrouw Pinyapat Kongngen, MVRU, voor haar technische assistentie bij het opstellen van figuur 2. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van het National Institute for Allergy and Infectious Diseases en het National Institute of Health (U19 AI089672).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| ELISA plate reader | BioTek Instrument, Inc. | Synergy H1 | Absorbance wordt gemeten met behulp van de UV-VIS absorptiedetectiemodus |
| Grinder stamper | Axygen | PES-15-B-SI | Voor het homogeniseren van het kop/thoraxgedeelte van de mug |
| Reagentia | |||
| ABTS substraat 2-component | KPL | 50-62-00 | Voor door peroxidase aangedreven detectie |
| Blocking buffer (BB) | Opmerking: oplossing | ||
| Capture- en peroxidase-geconjugeerde monoklonale antilichamen (mAbs) | Opmerking: mAbs kunnen worden verkregen in de gelyofiliseerd vorm als onderdeel van de Sporozoite ELISA Reagent Kits (MRA-890 voor P. falciparum en MRA-1028K voor P. vivax) van BEI Resources (https://www.beiresources.org.) | ||
| Caseïne | Sigma Aldrich | 9000-71-9 | Voor de bereiding van blocking buffer |
| Grinding buffer (GB) | Opmerking: oplossing | ||
| Igepal CA-630 | Sigma Aldrich | 9002-93-1 | Voor de bereiding van grinding buffer |
| KCl | Sigma Aldrich | 7447-40-7 | Voor de bereiding van fosfaatbufferzoutoplossing |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | 7778-77-0 | Voor de bereiding van fosfaatbufferzoutoplossing |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | 7558-79-4 | Voor de bereiding van fosfaatbufferzoutoplossing |
| NaCl | Sigma Aldrich | 7647-14-5 | Voor de bereiding van fosfaatbufferzoutoplossing |
| NaOH | Sigma Aldrich | 1310-73-2 | Voor de bereiding van blocking buffer |
| PBS-Tween | |||
| Pf capture mAb | CDC | Pf-CAP | Voor het vastleggen van Pf circumsporozoïet eiwit |
| Pf peroxidase mAb | CDC | Pf-HRP | Voor het detecteren van Pf circumsporozoïet eiwit |
| Pf positieve controle | CDC | Pf-PC | Pf positieve controle |
| Fenol rood | Sigma Aldrich | 143-74-8 | Voor de bereiding van blocking buffer |
| Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) | Opmerking: oplossing | ||
| Positieve controles | Opmerking: oplossing | ||
| Pv210 capture mAb | CDC | Pv210-CAP | Voor het vastleggen van Pv210 circumsporozoïet eiwit |
| Pv210 peroxidase mAb | CDC | Pv210-HRP | Voor het detecteren van Pv210 circumsporozoïet eiwit |
| Pv210 positieve controle | CDC | Pv210-PC | Pv210 positieve controle |
| Pv247 capture mAb | CDC | Pv247-CAP | Voor het vastleggen van Pv247 circumsporozoïet eiwit |
| Pv247 peroxidase mAb | CDC | Pv247-HRP | Voor het detecteren van Pv247 circumsporozoïet eiwit |
| Pv247 positieve controle | CDC | Pv247-PC | Pv247 positieve controle |
| Tween20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | Voor de bereiding van PBS-Tween |
| Consumables | |||
| Weggeef pipetten reservoirs | Generic | Voor werkreagentia | |
| ELISA platen: 96 wel duidelijke ronde bodem PVS | Corning Life Science | 2797 | Voor ELISA |
| Handschoenen: wegwerp handschoenen en vrieshandschoenen | Generic | Voor persoonlijke bescherming | |
| Labjas | Generic | Voor persoonlijke bescherming | |
| Multikanaals Pipet P30-300 | Generic | Voor overdracht van oplossing | |
| Pipetset, P2, P20, P200 en P1000 | Generic | Voor overdracht van oplossing | |
| Pipettips 10 µL, 200 µL en 1000 µL | Generic | Voor overdracht van oplossing | |
| Serologische pipetten 5 mL, 10 mL | Generic | Voor overdracht van oplossing | |
| Transfer pipetten | Generic | Voor overdracht van oplossing |
Referenties
- Bray, R. S., Garnham, P. C. The life-cycle of primate malaria parasites. British Medical Bulletin. 38 (2), 117-122 (1982).
- Held, J. R. Primate malaria. Annals of the New York Academy of Sciences. 162 (1), 587-593 (1969).
- World Health Organization. Division of Malaria and Other Parasitic Diseases. Manual on practical entomology in Malaria, Part I and Part II. World Health Organization. , Geneva. (1975).
- Robert, V., et al. Study of the distribution of circumsporozoite antigen in Anopheles gambiae infected with Plasmodium falciparum, using the enzyme-linked immunosorbent assay. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 82 (3), 389-391 (1988).
- Fontenille, D., Meunier, J. Y., Nkondjio, C. A., Tchuinkam, T. Use of circumsporozoite protein enzyme-linked immunosorbent assay compared with microscopic examination of salivary glands for calculation of malaria infectivity rates in mosquitoes (Diptera: Culicidae) from Cameroon. Journal of Medical Entomology. 38 (3), 451-454 (2001).
- Echeverry, D. F., et al. Fast and robust single PCR for Plasmodium sporozoite detection in mosquitoes using the cytochrome oxidase I gene. Malaria Journal. 16 (1), 230(2017).
- Singh, B., et al. A genus- and species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 60 (4), 687-692 (1999).
- Snounou, G. Genotyping of Plasmodium spp. Nested PCR. Methods in Molecular Medicine. 72, 103-116 (2002).
- Snounou, G., Singh, B. Nested PCR analysis of Plasmodium parasites. Methods in Molecular Medicine. 72, 189-203 (2002).
- Snounou, G., Viriyakosol, S., Jarra, W., Thaithong, S., Brown, K. N. Identification of the four human malaria parasite species in field samples by the polymerase chain reaction and detection of a high prevalence of mixed infections. Molecular and Biochemical Parasitology. 58 (2), 283-292 (1993).
- Wirtz, R. A., et al. Identification of Plasmodium vivax sporozoites in mosquitoes using an enzyme-linked immunosorbent assay. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 34 (6), 1048-1054 (1985).
- Wirtz, R. A., Burkot, T. R., Graves, P. M., Andre, R. G. Field evaluation of enzyme-linked immunosorbent assays for Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax sporozoites in mosquitoes (Diptera: Culicidae) from Papua New Guinea. Journal of Medical Entomology. 24 (4), 433-437 (1987).
- Wirtz, R. A., Sattabongkot, J., Hall, T., Burkot, T. R., Rosenberg, R. Development and evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay for Plasmodium vivax-VK247 sporozoites. Journal of Medical Entomology. 29 (5), 854-857 (1992).
- Burkot, T. R., Williams, J. L., Schneider, I. Identification of Plasmodium falciparum-infected mosquitoes by a double antibody enzyme-linked immunosorbent assay. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 33 (5), 783-788 (1984).
- Rosenberg, R., et al. Circumsporozoite protein heterogeneity in the human malaria parasite Plasmodium vivax. Science. 245 (4921), 973-976 (1989).
- Marie, A., et al. Evaluation of a real-time quantitative PCR to measure the wild Plasmodium falciparum infectivity rate in salivary glands of Anopheles gambiae. Malaria Journal. 12, 224(2013).
- Arevalo-Herrera, M., et al. Immunoreactivity of sera from low to moderate malaria-eEndemic areas against Plasmodium vivax rPvs48/45 proteins produced in Escherichia coli and chinese hamster ovary systems. Frontiers in Immunology. 12, 634738(2021).
- Balkew, M., et al. An update on the distribution, bionomics, and insecticide susceptibility of Anopheles stephensi in Ethiopia, 2018-2020. Malaria Journal. 20 (1), 263(2021).
- Wirtz, R. A., Avery, M., Benedict, M., Sutcliffe, A. Plasmodium sporozoite ELISA. Methods in Anopheles Research. , 333-343 (2016).
- Durnez, L., et al. False positive circumsporozoite protein ELISA: a challenge for the estimation of the entomological inoculation rate of malaria and for vector incrimination. Malaria Journal. 10, 195(2011).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
