Dit protocol beschrijft de workflow om monocyten-afgeleide macrofagen (MDM) te verkrijgen uit menselijke bloedmonsters, een eenvoudige methode om inflammatoire caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) -verslaggevers efficiënt in menselijke MDM te introduceren zonder de levensvatbaarheid en het gedrag van cellen in gevaar te brengen, en een op beeldvorming gebaseerde benadering om inflammatoire caspase-activering in levende cellen te meten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Visualisatie van inflammatoire caspasen geïnduceerde nabijheid in menselijke monocyt-afgeleide macrofagen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Inflammatoire caspasen omvatten caspase-1, -4, -5, -11 en -12 en behoren tot de subgroep van initiator caspasen. Caspase-1 is vereist om een correcte regulatie van inflammatoire signalering te garanderen en wordt geactiveerd door nabijheidsgeïnduceerde dimerisatie na rekrutering voor inflammasomen. Caspase-1 is overvloedig aanwezig in de monocytische cellijn en induceert rijping van de pro-inflammatoire cytokines interleukine (IL)-1β en IL-18 tot actieve uitgescheiden moleculen. De andere inflammatoire caspasen, caspase-4 en -5 (en hun murine homolog caspase-11) bevorderen il-1β afgifte door pyroptose te induceren. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is een hulpmiddel dat wordt gebruikt om inflammatoire caspase geïnduceerde nabijheid te meten als een uitlezing van caspase-activering. Het caspase-1, -4 of -5 prodomein, dat het gebied bevat dat zich bindt aan het inflammasoom, is gefuseerd met niet-fluorescerende fragmenten van het gele fluorescerende eiwit Venus (Venus-N [VN] of Venus-C [VC]) die zich associëren om het fluorescerende Venus-complex te hervormen wanneer de caspasen geïnduceerde nabijheid ondergaan. Dit protocol beschrijft hoe deze verslaggevers kunnen worden geïntroduceerd in primaire menselijke monocyt-afgeleide macrofagen (MDM) met behulp van nucleofection, de cellen kunnen worden behandeld om inflammatoire caspase-activering te induceren en caspase-activering te meten met behulp van fluorescentie en confocale microscopie. Het voordeel van deze aanpak is dat het kan worden gebruikt om de componenten, vereisten en lokalisatie van het inflammatoire caspase-activeringscomplex in levende cellen te identificeren. Er moeten echter zorgvuldige controles worden overwogen om te voorkomen dat de levensvatbaarheid en het gedrag van cellen in gevaar komen. Deze techniek is een krachtig hulpmiddel voor de analyse van dynamische caspase-interacties op inflammasoomniveau en voor de ondervraging van de inflammatoire signaalcascades in levende MDM en monocyten afgeleid van menselijke bloedmonsters.
Inleiding
De caspasen zijn een familie van cysteïne aspartaat proteasen die kunnen worden gegroepeerd in initiator caspasen en beul caspasen. Beul caspasen bestaan uit caspase-3, -6 en -7. Ze komen van nature voor in cellen als dimeren en worden door de initiator caspasen gesplitst om apoptose1 uit te voeren. Initiator caspasen omvatten human caspase-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 en -12. Ze worden gevonden als inactieve zymogenen (pro-caspasen) die worden geactiveerd door nabijheidsgeïnduceerde dimerisatie en gestabiliseerd door auto-proteolytische splitsing 2,3. De inflammatoire caspasen zijn een s....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dit protocol volgt de richtlijnen van de ethische commissie voor menselijk onderzoek van Baylor College of Medicine voor de manipulatie van menselijke monsters. Bloedmonsters worden behandeld volgens de institutionele veiligheidsrichtlijnen voor menselijke monsters. Bloedmonsters worden verkregen bij een regionale bloedbank, waar ze worden verzameld met citraatfosfaat dextrose (CPD) oplossing. Bloed verzameld met andere anticoagulantia zoals natriumheparine, lithiumheparine of EDTA kan echter ook worden gebruikt voor dit protocol28,29.
1. Isolatie van menselijke monocyten en d....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het schema in figuur 2 geeft een overzicht van hoe menselijke MDM kan worden verkregen, getransfecteerd en in beeld gebracht. Na incubatie van de geselecteerde CD14+ monocyten met GM-CSF gedurende 7 dagen, verandert de celmorfologie in de loop van de differentiatieperiode (figuur 3A), gaande van bolvormige suspensiecellen tot spichtig en volledig gehecht (dag 3 en 4), en ten slotte naar meer verspreide cellen wanneer volledig gedifferentieerd (dag 7). Volledig .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol beschrijft de workflow om macrofagen te verkrijgen uit monocyten geïsoleerd uit menselijke bloedmonsters en een methode om de inflammatoire caspase BiFC-verslaggevers efficiënt in menselijke MDM te introduceren zonder de levensvatbaarheid en het gedrag van cellen in gevaar te brengen.
Dit protocol maakt gebruik van de BiFC-techniek35 om de inflammatoire caspasen op het caspase recruitment domein (CARD) te taggen met niet-fluorescerende fragmenten van het ge.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
We bedanken de leden van LBH's lab uit heden en verleden die hebben bijgedragen aan de ontwikkeling van deze techniek. Dit lab wordt ondersteund door NIH/NIDDK T32DK060445 (BEB), NIH/NIDDK F32DK121479 (BEB), NIH/NIGMS R01GM121389 (LBH). Figuur 2 is getekend met behulp van Biorender software.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 48 well tissue culture2:34 plates | Genesee Scientific | 25-108 | |
| 10 cm Tissue Culture Dishes | VWR | 25382-166 | |
| 2 Mercaptoethanol 1000x | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| 8 well chambered coverglass with 1.5 HP coverglass | Cellvis | c8-1.5H-N | |
| AutoMACS columns | Miltenyi (Biotec) | 130-021-101 | Alleen voor geautomatiseerde scheiding met AutoMACS Pro Separator |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi (Biotec) | 130-092-545 | Alleen voor geautomatiseerde scheiding met AutoMACS Pro Separator |
| AutoMACS Pro Washing Solution | Miltenyi (Biotec) | 130-092-987 | Alleen voor geautomatiseerde scheiding met AutoMACS Pro Separator |
| AutoMACS Rinsing Solution | Miltenyi (Biotec) | 130-091-222 | Alleen voor geautomatiseerde scheiding met AutoMACS Pro Separator |
| AutoMacs running buffer | Miltenyi (Biotec) | 130-091-221 | Voor handmatige of geautomatiseerde scheiding met QuadroMACS of AutoMACS pro Separator |
| Axio Observer Z1 motorized inverted microscope equipped with a CSU-X1A 5000 spinning disk unit | Zeiss | Elke confocale microscoop uitgerust met een lasermodule voorzien van laserlijnen van 568 nm (RFP) en 488 of 512 nm (GFP of YFP) golflengten kan worden gebruikt | |
| AxioObserver A1, Research Grade Inverted Microscope | Zeiss | Elke epifluorescentiemicroscoop met fluorescentiefilters die in staat zijn om 568 nm (RFP) en 488 of 512 nm (GFP of YFP) golflengten op te wekken, kan worden gebruikt | |
| CD14+ MICROBEADS | Miltenyi (Biotec) | 130-050-201 | Voor handmatige of geautomatiseerde scheiding met QuadroMACS of AutoMACS pro Separator |
| DPBS without calcium chloride and magnesium chloride | Sigma | D8537-6x500ML | |
| DsRed mito plasmid | Clontech | 632421 | Vergelijkbare plasmiden die als fluorescente reporters kunnen worden gebruikt, zijn te vinden op Addgene |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10437028 | |
| Ficoll-Paque PLUS 6 x 100 mL | Sigma | GE17-1440-02 | |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 35050079 | |
| GM-CSF | Thermo Fisher Scientific | PHC2011 | |
| Hemin BioXtra, from Porcine, ≥96.0% (HPLC) | Sigma | 51280-1G | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
| Inflammatory caspase BiFC plasmids | Beschikbaar op aanvraag bij LBH lab | ||
| LPS-EB Ultrapure | Invivogen | TLRL-3PELPS | |
| LS Columns | Miltenyi (Biotec) | 130-042-401 | Alleen voor handmatige scheiding met QuadroMACS Separator |
| MACS 15 mL Tube Rack | Miltenyi (Biotec) | 130-091-052 | Alleen voor handmatige scheiding met QuadroMACS Separator |
| MACS MultiStand | Miltenyi (Biotec) | 130-042-303 | Alleen voor handmatige scheiding met QuadroMACS Separator |
| mCherry plasmid | Yungpeng Wang Lab | Vergelijkbare plasmiden die als fluorescente reporters kunnen worden gebruikt, zijn te vinden op Addgene | |
| Neon Transfection System | Thermo Fisher Scientific | MPK5000 | Inclusief Neon elektroporeratieapparaat, pipette en pipette station |
| Neon Transfection System 10 µL Kit | Thermo Fisher Scientific | MPK1096 | Inclusief resuspendtiebuffer R, resuspendtiebuffer T, elektrolytische buffer E, 96 x 10 µL Neon tips en Neon elektroporeratiebuizen |
| Nigericin sodium salt, ready made solution | Sigma | SML1779-1ML | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Poly-D-Lysine Hydrobromide | Sigma | P7280-5mg | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi (Biotec) | 130-090-976 | Alleen voor handmatige scheiding met QuadroMACS Separator |
| qVD-OPh | Fisher (ApexBio) | 50-101-3172 | |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875119 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
| Zeiss Zen 2.6 (blue edition) software | Zeiss | Elke software die wordt gebruikt om de gekozen confocale microscoop te bedienen |
Referenties
- Boatright, K. M., et al. A unified model for apical caspase activation. Molecular Cell. 11 (2), 529-541 (2003).
- Pop, C., Salvesen, G. S. Human caspases: activation, specificity, and regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
