Methodenartikel

Visualisatie van inflammatoire caspasen geïnduceerde nabijheid in menselijke monocyt-afgeleide macrofagen

DOI:

10.3791/63162

⸱

6 april 2022

 , 
1Department of Pediatrics, Division of Hematology-Oncology, Department of Molecular and Cellular Biology, Texas Children’s Hospital William T. Shearer Center for Human Immunobiology, Baylor College of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de workflow om monocyten-afgeleide macrofagen (MDM) te verkrijgen uit menselijke bloedmonsters, een eenvoudige methode om inflammatoire caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) -verslaggevers efficiënt in menselijke MDM te introduceren zonder de levensvatbaarheid en het gedrag van cellen in gevaar te brengen, en een op beeldvorming gebaseerde benadering om inflammatoire caspase-activering in levende cellen te meten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inflammatoire caspasen omvatten caspase-1, -4, -5, -11 en -12 en behoren tot de subgroep van initiator caspasen. Caspase-1 is vereist om een correcte regulatie van inflammatoire signalering te garanderen en wordt geactiveerd door nabijheidsgeïnduceerde dimerisatie na rekrutering voor inflammasomen. Caspase-1 is overvloedig aanwezig in de monocytische cellijn en induceert rijping van de pro-inflammatoire cytokines interleukine (IL)-1β en IL-18 tot actieve uitgescheiden moleculen. De andere inflammatoire caspasen, caspase-4 en -5 (en hun murine homolog caspase-11) bevorderen il-1β afgifte door pyroptose te induceren. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is een hulpmiddel dat wordt gebruikt om inflammatoire caspase geïnduceerde nabijheid te meten als een uitlezing van caspase-activering. Het caspase-1, -4 of -5 prodomein, dat het gebied bevat dat zich bindt aan het inflammasoom, is gefuseerd met niet-fluorescerende fragmenten van het gele fluorescerende eiwit Venus (Venus-N [VN] of Venus-C [VC]) die zich associëren om het fluorescerende Venus-complex te hervormen wanneer de caspasen geïnduceerde nabijheid ondergaan. Dit protocol beschrijft hoe deze verslaggevers kunnen worden geïntroduceerd in primaire menselijke monocyt-afgeleide macrofagen (MDM) met behulp van nucleofection, de cellen kunnen worden behandeld om inflammatoire caspase-activering te induceren en caspase-activering te meten met behulp van fluorescentie en confocale microscopie. Het voordeel van deze aanpak is dat het kan worden gebruikt om de componenten, vereisten en lokalisatie van het inflammatoire caspase-activeringscomplex in levende cellen te identificeren. Er moeten echter zorgvuldige controles worden overwogen om te voorkomen dat de levensvatbaarheid en het gedrag van cellen in gevaar komen. Deze techniek is een krachtig hulpmiddel voor de analyse van dynamische caspase-interacties op inflammasoomniveau en voor de ondervraging van de inflammatoire signaalcascades in levende MDM en monocyten afgeleid van menselijke bloedmonsters.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De caspasen zijn een familie van cysteïne aspartaat proteasen die kunnen worden gegroepeerd in initiator caspasen en beul caspasen. Beul caspasen bestaan uit caspase-3, -6 en -7. Ze komen van nature voor in cellen als dimeren en worden door de initiator caspasen gesplitst om apoptose1 uit te voeren. Initiator caspasen omvatten human caspase-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 en -12. Ze worden gevonden als inactieve zymogenen (pro-caspasen) die worden geactiveerd door nabijheidsgeïnduceerde dimerisatie en gestabiliseerd door auto-proteolytische splitsing 2,3. De inflammatoire caspasen zijn een subset van de initiator caspasen2 en omvatten caspase-1, -4, -5 en -12 bij mensen, en caspase-1, -11 en -12 bij muis 4,5. In plaats van een apoptotische rol, spelen ze een centrale rol bij ontstekingen. Ze bemiddelen proteolytische verwerking en secretie van pro-interleukine (IL)-1β en pro-IL-18 6,7, de eerste cytokines die vrijkomen als reactie op pathogene indringers 8,9. Caspase-1 wordt geactiveerd bij werving op zijn activeringsplatform; een eiwitcomplex met een groot molecuulgewicht dat het inflammasoom wordt genoemd (figuur 1A)10. Dimerisatie van caspase-4, -5 en -11 vindt onafhankelijk van deze platforms plaats via een niet-canonieke inflammasoomroute11,12.

Canonieke inflammasomen zijn cytosolische multimere eiwitcomplexen die bestaan uit een inflammasoomsensoreiwit, het adaptoreiwit ASC (apoptose-geassocieerd speck-achtig eiwit dat een CARD bevat) en het effectoreiwit caspase-110. De best bestudeerde canonieke inflammasomen zijn de NOD-achtige receptorfamilie met een pyrinedomein (NLRP), NLRP1 en NLRP3, de NLR-familie met een CARD (NLRC), NLRC4 en de afwezige in melanoom 2 (AIM2). Ze bevatten elk een pyrinedomein, een CARD of beide domeinen. Het CARD-domein bemiddelt de interactie tussen CARD-bevattende caspasen en hun upstream activators. Daarom is het steigermolecuul ASC, dat bestaat uit een N-terminal pyrinedomein (PYD) en een C-terminal CARD-motief13,14, vereist voor de rekrutering van caspase-1 voor deNLRP1 10, NLRP315 en AIM216 inflammasomen.

Elk inflammasoom is vernoemd naar zijn unieke sensoreiwit dat verschillende pro-inflammatoire stimuli herkent (figuur 1B). Activatoren van deze route worden canonieke stimuli genoemd. Inflammasomen dienen als sensoren voor microbiële componenten en weefselstress en assembleren om een robuuste ontstekingsreactie te veroorzaken door activering van de inflammatoire caspasen17. Inflammasoomassemblage initieert caspase-1-activering om rijping en secretie van de belangrijkste substraten pro-IL-1β en pro-IL-18 te bemiddelen. Dit proces verloopt via een mechanisme in twee stappen. Ten eerste upreguleert een priming stimulus de expressie van bepaalde inflammasoomeiwitten en pro-IL-1β door activering van de NF-κB-route. Ten tweede induceert een intracellulaire (canonieke) stimulus inflammasoomassemblage en rekrutering van procaspase-1 6,7.

Caspase-4 en caspase-5 zijn de menselijke orthologen van murine caspase-1111. Ze worden op een inflammasoomonafhankelijke manier geactiveerd door intracellulair lipopolysaccharide (LPS), een molecuul dat wordt aangetroffen in het buitenmembraan van Gram-negatieve bacteriën 18,19,20, en door extracellulair heem, een product van hemolyse van rode bloedcellen 21. Er is voorgesteld dat LPS zich rechtstreeks bindt aan het CARD-motief van deze eiwitten en hun oligomerisatie induceert20. Activering van caspase-4 of caspase-5 bevordert de afgifte van IL-1β door het induceren van een inflammatoire vorm van celdood die pyroptose wordt genoemd door splitsing van het porievormende eiwit gasdermin D (GSDMD)18,19. Bovendien induceert de efflux van kaliumionen als gevolg van caspase-4 en GSDMD-gemedieerde pyroptotische dood activering van het NLRP3-inflammasoom en daaropvolgende activering van caspase-1 22,23. Daarom worden caspase-4, -5 en -11 beschouwd als intracellulaire sensoren voor LPS die pyroptose en caspase-1-activering kunnen induceren als reactie op specifieke stimuli11,24.

figure-introduction-1
Figuur 1: Inflammatoire caspasen en caspase-bimoleculaire fluorescentiecomplementatie (BiFC) assay. (A) Diagram met het caspase-BiFC-systeem, waarbij twee caspase-1 prodomeinen (C1-pro) gekoppeld aan elk niet-fluorescerend fragment van Venus (Venus-C of Venus-N) worden gerekruteerd naar het NLRP3-activeringsplatform, waardoor Venus wordt gedwongen om opnieuw te vouwen en te fluoresceren. Dit complex verschijnt als een groene vlek onder de microscoop en dient als een uitlezing voor inflammatoire caspase-geïnduceerde nabijheid, wat de eerste stap is in initiator caspase-activering. (B) Schema dat de domeinorganisatie van inflammasoomcomponenten en inflammatoire caspasen weergeeft. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het meten van specifieke initiator caspases activering is moeilijk, en er zijn niet veel methoden beschikbaar om dit te doen door middel van imaging benaderingen. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) kan worden gebruikt om inflammatoire caspase-activering direct in levende cellen te visualiseren (figuur 1A)25. Deze techniek is onlangs aangepast voor gebruik in menselijke monocyten-afgeleide macrofagen (MDM)21. Caspase BiFC meet de eerste stap in inflammatoire caspase-activering, geïnduceerde nabijheid om dimerisatie te vergemakkelijken. Expressie van plasmiden die coderen voor het CARD-bevattende caspase-prodomein gefuseerd tot niet-fluorescerende fragmenten van het fotostabiele gele fluorescerende eiwit Venus (Venus-C [VC]) en Venus-N [VN]) worden gebruikt. Wanneer de twee caspase-prodomeinen worden gerekruteerd naar hun activeringsplatform of geïnduceerde nabijheid ondergaan, worden de twee helften van Venus in de nabijheid gebracht en gedwongen om opnieuw te vouwen en te fluoresceren (zie figuur 1A,B). Dit biedt een real-time uitlezing van specifieke inflammatoire caspase-activering.

Menselijke MDM brengt overvloedig inflammasoomgenen en patroonherkenningsreceptoren tot expressie die gevaarsignalen en pathogene producten identificeren. Dit biedt een ideaal celtype voor de ondervraging van inflammatoire caspase-routes. Bovendien kunnen ze worden afgeleid uit perifeer bloed en zelfs uit patiëntmonsters om inflammatoire caspase-activering in een specifieke ziektetoestand te beoordelen. Dit protocol beschrijft hoe de BiFC caspase-verslaggevers in MDM kunnen worden geïntroduceerd met behulp van nucleofection, een op elektroporatie gebaseerde transfectiemethode, hoe de cellen moeten worden behandeld om inflammatoire caspase-activering te induceren en hoe de actieve caspase-complexen kunnen worden gevisualiseerd met behulp van microscopiebenaderingen. Bovendien kan deze methodologie worden aangepast om de moleculaire samenstelling van deze complexen, subcellulaire lokalisatie, kinetiek en grootte van deze zeer geordende structuren te bepalen 25,26,27.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol volgt de richtlijnen van de ethische commissie voor menselijk onderzoek van Baylor College of Medicine voor de manipulatie van menselijke monsters. Bloedmonsters worden behandeld volgens de institutionele veiligheidsrichtlijnen voor menselijke monsters. Bloedmonsters worden verkregen bij een regionale bloedbank, waar ze worden verzameld met citraatfosfaat dextrose (CPD) oplossing. Bloed verzameld met andere anticoagulantia zoals natriumheparine, lithiumheparine of EDTA kan echter ook worden gebruikt voor dit protocol28,29.

1. Isolatie van menselijke monocyten en differentiatie in macrofagen

  1. Verkrijg antistollingsbloed van niet-geïdentificeerde gezonde personen bij een regionale bloedbank en isoleer perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) zoals hieronder aangegeven.
    OPMERKING: Voer alle stappen uit in een weefselkweek laminaire flow hood. Gebruik alleen steriele buizen en draag handschoenen. Voeg 10% bleekmiddel toe aan alle bloedgerelateerde producten bij het weggooien. Steriel PBS (1x) of DPBS (zonder Ca2+ en Mg2+) kan door elkaar worden gebruikt.
    1. Bereid de verdunningsbuffer voor: Vul 1x steriel PBS aan met 2% FBS en 0,5 mM EDTA.
    2. Bereid het kweekmedium voor: Supplement RPMI-1640 medium met FBS (10% (v/v)), glutamax (2 mM) en Penicilline/Streptomycine (50 I.U./50 μg/ml)
    3. Onderkoel de lopende buffer (Tabel met materialen) volgens het protocol van de fabrikant.
    4. Verdun volbloed met twee volumes verdunningsbuffer. Breng met behulp van een serologische pipet 15 ml van het antistollingsbloed over naar een buis van 50 ml met 30 ml verdunningsbuffer. Meng zachtjes door inversie.
    5. Voeg voor elke 10 ml volbloed of 30 ml verdund bloed 15 ml van het dichtheidsgradiëntmedium toe aan een lege buis van 50 ml.
    6. Breng het medium van de dichtheidsgradiënt uit stap 1.1.5 langzaam en gestaag aan met 30 ml verdund bloed met behulp van een serologische pipet van 25 ml. Houd de punt van de pipet tegen de wand van de buis en de buis in een schuine hoek.
    7. Breng de buizen voorzichtig over in een centrifuge met zwenkbak. Vermijd het verstoren van de twee fasen. Centrifugeer de buizen bij 400 x g bij kamertemperatuur (RT) gedurende 25 minuten met versnelling en vertraging ingesteld op de minimumwaarde.
    8. Verwijder voorzichtig de bovenste (heldere) plasmalaag met een pipet van 10 ml en gooi deze weg in een container met bleekmiddel (10%).
    9. Verzamel de interfase (witte) laag van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's, figuur 2) met een pipet van 10 ml en breng over naar een verse buis van 50 ml. Combineer de witte laag van verschillende buizen van dezelfde donor in een buis van 50 ml tot 30 ml.
    10. Breng elke buis met de verdunningsbuffer uit stap 1.1.1 tot een totaal volume van 50 ml en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 x g en 4 °C. Verwijder het supernatant met een pipet van 10 ml en gooi het weg in een container met bleekmiddel (10%).
    11. Resuspend elke celkorrel in 1 ml van de voorgekoelde lopende buffer uit stap 1.1.3 met behulp van een p1000 micropipette. Combineer celsuspensies van dezelfde donor in een nieuwe buis van 15 ml. Breng het volume van elke buis op 15 ml met voorgekoelde loopbuffer en meng goed door inversie.
    12. Neem een aliquot van 20 μL van de celsuspensie uit stap 1.1.11 en bereid een verdunning van 1:100 met behulp van 1x steriel PBS. Bepaal het celgetal met behulp van een hemocytometer.
    13. Centrifugeer de celsuspensie vanaf stap 1.1.11 bij 300 x g en 4 °C gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant met een pipet van 10 ml. Gebruik indien nodig een p200 micropipette om het supernatant volledig te verwijderen.
    14. Resuspend de geïsoleerde PBMC's in 80 μL voorgekoelde MACS-lopende buffer voor elke 1 x 107 cellen, wat neerkomt op maximaal 800 μL van de buffer.
    15. Voeg 20 μL anti-humane CD14 MicroBeads toe per elk 1 x 107 cellen of tot 100 μL per bloedmonster (~ 100 ml onverdund bloed). Meng goed door inversie en plaats op een buisrotator gedurende 20 minuten met continu mengen bij 4 °C.
    16. Verwijder de monsters van de buisrotator, voeg 10 ml voorgekoelde loopbuffer toe aan elke buis en centrifugeer bij 300 x g (versnelling = 5, vertraging = 5) en 4 °C gedurende 10 minuten.
    17. Verwijder het supernatant met een pipet van 10 ml en resuspend tot 1 x 108 cellen in 500 μL voorgekoelde lopende buffer (2 x 108/ml).
    18. Voer de isolatie van CD14-positieve cellen uit door magnetische celsortering met behulp van een handmatig of geautomatiseerd systeem (Tabel met materialen) volgens de instructies van de fabrikant.
    19. Neem een aliquot van 20 μL van de celsuspensie uit stap 1.1.18 na CD14-positieve selectie en bereid een verdunning van 1:100 met 1x steriel PBS. Bepaal het celnummer door de cellen op een hemocytometer te tellen.
    20. Centrifugeer de CD14-positieve cellen bij 300 x g en RT gedurende 10 minuten. Verwijder het supernatant met een pipet van 10 ml of een vacuümsysteem.
    21. Resuspend de celkorrel van stap 1.1.20 in voorverwarmd kweekmedium van stap 1.1.2 tot een uiteindelijke celdichtheid van 1 x 107 cellen/ml.
  2. Zaai de geïsoleerde CD14-positieve monocyten bij een celdichtheid van 5 x 106 cellen.
    1. Voeg op een 10 cm weefselkweekschaal 10 ml kweekmedium uit stap 1.1.2 toe, aangevuld met 50 ng / ml granulocyt-macrofaagkoloniestimulerende factor (GM-CSF).
    2. Voeg 0,5 ml van de celsuspensie uit stap 1.1.21 druppelsgewijs toe aan het kweekmedium en draai de plaat voorzichtig rond. Incubateer cellen in een bevochtigde weefselkweekincubator (37 °C, 5% CO2) gedurende de nacht.
    3. Zuig de volgende dag het medium op met behulp van een vacuümsysteem om cellen te verwijderen die zich 's nachts niet hechten. Voeg 10 ml vers kweekmedium aangevuld met GM-CSF (50 ng /ml) toe en incubate cellen in een bevochtigde weefselkweekincubator (37 °C, 5% CO2) gedurende 7 dagen om volledige differentiatie mogelijk te maken (zie figuur 3A voor het verschijnen van CD14+ monocyten in verschillende stadia van differentiatie in GM-CSF ). Wissel het kweekmedium om de 2-3 dagen uit en vul het aan met verse GM-CSF (50 ng/ml) elke keer.

figure-protocol-1
Figuur 2: Schematisch overzicht van de experimentele workflow. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Bereiding van elektroporatiecomponenten

OPMERKING: Dit protocol is ontworpen voor een 10 μL-Neon tip (Table of Materials). Gebruik voor elke transfectie 1-2 x 105 cellen. Het wordt aanbevolen om getransfecteerde cellen te zaaien op een 48-well plaat of 8-well chambered dish (10 μL-getransfecteerde cellen per put). 1x steriele DPBS (zonder Ca2+ en Mg2+) kan worden gebruikt in plaats van PBS.

  1. Bereid op dag 7 een antibioticavrij medium door rpmi-1640 medium aan te vullen met FBS (10% (v/v)) en glutamax (2 mM).
  2. Breng serumvrij RPMI-1640 medium, trypsine-EDTA (0,25%) oplossing, 1x steriel PBS (zonder Ca2+ en Mg2+) en volledig kweekmedium vanaf stap 1.1.2 in een waterbad van 37 °C.
  3. Als u schotels met glazen bodem gebruikt (voor confocale microscopie), bedekt u de gerechten met poly-D-lysinehydrobromide.
    1. Bestrijk een 8 goed kamervormige schaal met 200 μL poly-D-lysine hydrobromide (0,1 mg / ml in 1x steriel PBS) en incubeer gedurende 5 minuten bij RT.
    2. Zuig de poly-D-lysine-oplossing op en was het glas eenmaal met 1x steriel PBS. Zuig de PBS op en ga verder met stap 2.4.
  4. Voeg 200 μL antibioticavrij medium toe per put van de 48 putplaat of 8 goed gekamerde schaal en incubeer in een bevochtigde weefselkweekincubator (37 °C, 5% CO2) totdat u klaar bent om de getransfecteerde cellen te vergulden.

3. Voorbereiding van cellen voor elektroporatie

OPMERKING: De opbrengst van MDM uit een schaal van 10 cm aan het einde van de differentiatieperiode van 7 dagen is ongeveer 1,5 x 106 cellen. 1x steriele DPBS (zonder Ca2+ en Mg2+) kan worden gebruikt in plaats van PBS. Dit protocol is geoptimaliseerd zodat de meeste macrofagen van de plaat worden losgemaakt met behoud van de levensvatbaarheid en integriteit van cellen. MDM is moeilijk los te maken van celkweekplaten. Daarom kan het nodig zijn om stap 3.2 en 3.3 tweemaal uit te voeren om de cellen te dissociëren. Zorg ervoor dat elke incubatietijd met trypsine-EDTA (0,25%) niet langer is dan 5 minuten.

  1. Zuig de media op uit volledig gedifferentieerde macrofagen op 10 cm vaat en was de celmonolaag met warm serumvrij RPMI-1640 medium. Zorg ervoor dat u het medium volledig verwijdert.
  2. Oogst de cellen door 2 ml warme trypsine-EDTA (0,25%) oplossing per schaal van 10 cm toe te voegen en incubeer gedurende 5 minuten in een bevochtigde weefselkweekincubator (37 °C, 5% CO2).
  3. Voltooi de celloslating door de trypsine-EDTA (0,25%) oplossing voorzichtig op en neer te pipetteren over het hele schaalgebied met behulp van een p1000 micropipette. Breng de celsuspensie over in een conische buis van 15 ml met 5 ml warm volledig kweekmedium uit stap 1.1.2.
  4. Breng de schotel naar een heldere veldmicroscoop en controleer op celloslating in verschillende gezichtsvelden. Als er nog een aanzienlijke hoeveelheid cellen is bevestigd, herhaalt u stap 3.2-3.3.
  5. Centrifugeer de celsuspensie bij 250 x g gedurende 5 minuten bij RT.
  6. Zuig het medium op en resuspend de cellen in 10 ml 1x steriel PBS voorverwarmd tot 37 °C. Neem een aliquot van 20 μL om het celgetal te bepalen met behulp van een hemocytometer.
  7. Neem 1-2 x 105 cellen per beoogde transfectie en plaats in een buis van 15 ml. Breng tot een eindvolume van 15 ml met voorverwarmde 1x steriele PBS. Centrifugeer bij 250 x g gedurende 5 min bij RT.
  8. Zuig de PBS aan en centrifugeer nog één keer gedurende 1 minuut bij 250 x g. Verwijder eventuele resterende PBS uit de celkorrel met behulp van een p200 micropipette.

4. Nucleofection van caspase BiFC-componenten in van menselijke monocyten afgeleide macrofagen

OPMERKING: Dit gedeelte van het protocol wordt uitgevoerd met behulp van het Neon Transfection System (Tabel met Materialen). Dit protocol schetst de stappen om 1-2 x 105 cellen te transfecteren met behulp van een 10 μL Neon tip (Table of Materials). Als u een Neon-tip van 100 μL gebruikt, schaal dan dienovereenkomstig op. Vermijd het blootstellen van cellen aan resuspensiebuffer R gedurende meer dan 15 minuten, omdat dit de levensvatbaarheid van de cel en de transfectie-efficiëntie kan verminderen.

  1. Verdun het reporter plasmide (d.w.z. mCherry of dsRedmito bij 100 ng/μL) in nucleasevrij water of 0,5x TE buffer om de getransfecteerde cellen te visualiseren.
  2. Verdun de caspase BiFC-plasmiden tot een geschikte concentratie in nucleasevrij water of 0,5x TE-buffer, zodat het totale volume plasmiden niet groter is dan 30% van het totale transfectievolume van 10 μL (d.w.z. 300 ng/μL C1 Pro-VC en 300 ng/μL C1 Pro-VN).
  3. Bereid een steriel microbuisje van 1,5 ml per beoogde transfectie en voeg de juiste hoeveelheid reporterplasmide (d.w.z. 50 ng of 0,5 μL) en caspase BiFC-plasmiden (d.w.z. 300 ng of 1 μL C1 Pro-VC en 300 ng of 1 μL C1 Pro-VN-fragment) toe. Houd de microbuisjes te allen tijde in de kap.
  4. Plaats het pipetstation, apparaat, tips, elektroporatiebuizen en pipet in een steriele laminaire stroomkap.
    OPMERKING: Het pipetstation, het apparaat, de tips, de elektroporatiebuizen en de pipet zijn inbegrepen in het Neon Transfection System.
  5. Sluit de hoogspannings- en sensorconnector op het pipetstation aan op de achterste poorten van het apparaat volgens de instructies van de fabrikant. Houd het pipetstation dicht bij het apparaat.
  6. Sluit het netsnoer aan op de achterste ac-inlaat en sluit het apparaat aan op het stopcontact. Druk op de aan/uit-schakelaar om het apparaat in te schakelen.
  7. Voer de transfectieparameters in het opstartscherm in dat wordt weergegeven wanneer het apparaat is ingeschakeld en op de juiste manier is aangesloten. Druk op Voltage, voer 1000 in en druk op Gereed om de spanning in te stellen op 1000 V. Druk op Breedte, voer 40 in en druk op Gereed om de pulsduur in te stellen op 40 ms. Druk ten slotte op # Pulsen, voer 2 in en druk op Gereed om het aantal elektrische pulsen in te stellen op 2.
  8. Neem een van de elektroporatiebuizen (meegeleverd in de kit) en vul deze met 3 ml elektrolytische buffer E (voor 10 μL tips en meegeleverd in de kit) bij RT. Steek de elektroporatiebuis in de pipethouder op het pipetstation. Zorg ervoor dat de elektrode aan de zijkant van de buis naar binnen is gericht en dat er een klikgeluid te horen is wanneer de buis wordt ingebracht.
  9. Neem de celkorrel uit stap 3.8 en voeg 10 μL voorverwarmde resuspensie R-buffer (meegeleverd in de kit) toe voor elke 1-2 x 105 cellen. Meng voorzichtig met een p20 micropipette. Voeg 10 μL van de celsuspensie toe aan elke buis die in stap 4.3 is ingesteld en meng voorzichtig met een p20 micropipette.
  10. Neem de pipet en plaats een punt door op de drukknop naar de tweede stop te drukken. Zorg ervoor dat de klem de bevestigingssteel van de zuiger in de punt volledig oppakt en dat er geen opening wordt waargenomen in de bovenkop van de pipet.
  11. Om het monster op te zuigen, drukt u op de drukknop op de pipet tot de eerste stop en dompelt u in de eerste buis met cel/plasmide DNA-mengsel. Zuig het mengsel langzaam op in de pipetpunt.
    OPMERKING: Vermijd luchtbellen omdat ze tijdens elektroporatie boogvorming kunnen veroorzaken en, indien gedetecteerd door het apparaat, de afgifte van de elektrische puls kunnen voorkomen. Als er luchtbellen worden waargenomen, laat u de inhoud los in de buis en probeert u opnieuw te aspirateren.
  12. Steek de pipet met het monster heel voorzichtig in de pipethouder. Zorg ervoor dat de pipet klikt en dat deze goed geplaatst is.
  13. Druk op Start op het touchscreen en wacht tot de elektrische pulsen worden geleverd. Een bericht op het scherm geeft de voltooiing aan.
  14. Verwijder de pipet langzaam uit het station en voeg onmiddellijk de getransfecteerde celsuspensie toe aan de overeenkomstige put met voorverwarmd antibioticumvrij medium uit stap 2.4 door langzaam op de drukknop tot de eerste stop te drukken.
    OPMERKING: Deze tip kan tot drie keer worden hergebruikt voor hetzelfde plasmide; Gooi het anders weg in een biorisico afvalcontainer door op de drukknop tot de tweede stop te drukken.
  15. Herhaal stap 4.10-4.14 voor elke buis die een cel/plasmide-DNA-mengsel bevat.
  16. Laat de plaat voorzichtig schommelen met getransfecteerde cellen en incubeer gedurende 1-3 uur in een bevochtigde weefselkweekincubator (37 °C, 5% CO2).
  17. Voeg aan elke put 200 μL voorverwarmd kweekmedium (volledig medium) toe vanaf stap 1.1.2. Plaats de schaal opnieuw in de bevochtigde weefselkweekincubator (37 °C, 5% CO2). Houd rekening met ten minste 24 uur voor genexpressie.
  18. Inspecteer de volgende dag de levensvatbaarheid van de cel en de transfectie-efficiëntie met behulp van een epifluorescentiemicroscoop.
    1. Schakel de epifluorescentiemicroscoop en de fluorescerende lichtbrondoos in volgens de instructies van de fabrikant en plaats de kweekschaal op het microscooppodium.
    2. Selecteer het 10x- of 20x-objectief en het 568 nm (RFP)-filter.
    3. Als u de levensvatbaarheid van cellen wilt schatten, drukt u op de TL-knop (Transmitted Light LED) om alle cellen in het geselecteerde veld te visualiseren. Terwijl u in het oculair van de microscoop kijkt, draait u aan de focusknop totdat cellen worden waargenomen en controleert u op celaanhechting in het geselecteerde veld.
      OPMERKING: Volledig gehechte cellen vertegenwoordigen de levensvatbare cellen, terwijl zwevende cellen niet-levensvatbare cellen vertegenwoordigen. Als de samenvloeiing van de put hoog is, kan de aanwezigheid van niet-gehechte cellen het gevolg zijn van een overschatting van het celaantal en niet het gevolg van een lage levensvatbaarheid. Een lage confluïteit vergezeld van een hoog gehalte aan zwevende cellen betekent echter een lage levensvatbaarheid die het gevolg kan zijn van boogvorming tijdens elektroporatie, plasmidetoxiciteit of overmatige blootstelling aan resuspensie R-buffer. Gebruik geen putten die het laatste gedrag vertonen.
    4. Om de transfectie-efficiëntie te schatten, richt u zich op cellen in het geselecteerde veld onder doorgelaten licht zoals hierboven beschreven. Tel het totale aantal cellen in het geselecteerde veld. Terwijl de LED (TL) is uitgeschakeld, drukt u op de LED-knop (RL) voor gereflecteerd licht om in te schakelen.
    5. Fijne focus op de reporter gen fluorescentie (rode bloedcellen) en tel het totale aantal rode fluorescerende cellen. Herhaal deze stappen (4.18.4-4.18.5) voor nog minstens twee velden per put.

5. Behandeling van getransfecteerde MDM en caspase BiFC data acquisitie

OPMERKING: Als u van plan bent om de cellen in beeld te brengen met behulp van een epifluorescentie of confocale microscoop, wordt behandeling met qVD-OPh (20 μM) gedurende 1 uur voorafgaand aan de gekozen stimulus geadviseerd om caspase-afhankelijke celdood (voornamelijk apoptose) te voorkomen. Dit wordt gebruikt in beeldvorming om te voorkomen dat cellen opstijgen als gevolg van apoptose, waardoor ze erg moeilijk in beeld te brengen zijn als ze uit het brandpuntsvlak bewegen. Merk op dat caspase-rekrutering naar het activeringsplatform en de bijbehorende caspase BiFC niet afhankelijk is van de katalytische activiteit van de caspase, en bijgevolg zal caspase-remming deze stap niet beïnvloeden.

  1. Behandel met gekozen stimulus ongeveer 24 uur na transfectie en incubeer zo lang als nodig is voor elk medicijn.
    1. Bereid het beeldvormingsmedium voor door het kweekmedium uit stap 1.1.2 aan te vullen met Hepes (20 mM, pH 7,2-7,5) en 2-mercaptoethanol (55 μM).
    2. Voeg de gewenste stimulusconcentratie toe aan het voorverwarmde beeldmedium en meng voorzichtig.
    3. Verwijder de media voorzichtig uit de cellen met een p1000 micropipette en voeg 500 μL van de stimulusoplossing uit stap 5.1.2 toe aan de zijkant van de put.
    4. Om onbehandelde controleputten uit te voeren, voegt u beeldvormend medium toe zonder de stimulus.
    5. Incubeer de cellen in een bevochtigde weefselkweekincubator (37 °C, 5% CO2) zolang als voor elke behandeling is aangegeven.
  2. Visualiseer de cellen met behulp van een epifluorescentie of confocale microscoop.
    1. Schakel de microscoop en de fluorescerende lichtbron in volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Selecteer het 10x of 20x objectief en plaats de kweekschaal op het microscooppodium.
    3. Zoek met behulp van het microscoop-oculair cellen onder het 568 nm-filter en concentreer je op de cellen die de dsRedmito / mCherry-reporter (rode bloedcellen) tot expressie brengen.
    4. Tel alle rode bloedcellen in het gezichtsveld en noteer het nummer.
    5. Terwijl u zich in hetzelfde gezichtsveld bevindt, schakelt u over naar het 488- of 512-filter (GFP of YFP), gaat u verder met het tellen van het aantal rode bloedcellen dat ook groen is (Venus-positief of BiFC-positief) en registreert u het aantal.
    6. Tel ten minste 100 dsRedmito/mCherry-positieve cellen uit minimaal drie afzonderlijke gezichtsvelden.
    7. Bereken het percentage Venus-positieve getransfecteerde cellen per gezichtsveld en gemiddelde de resulterende percentages voor elke behandeling (put) om de standaarddeviatie te krijgen.
  3. Stel de cellen voor met behulp van een epifluorescentie of confocale microscoop
    OPMERKING: Om confocale beelden te verkrijgen met behulp van een 20x-objectief of een grotere vergroting, moeten cellen op glazen schalen worden geplaatst, tenzij de microscoop is uitgerust met een long pass-objectief.
    1. Volg de stappen 5.2.1-5.2.3. Als u een confocale microscoop gebruikt met het 40x, 60x of 63x olieobjectief, plaats dan een druppel olie op het objectief.
    2. Visualiseer het live beeld van de cellen op het computerscherm zoals verkregen door de camera. Gebruik de epifluorescentielichtbron voor fluorescerende beelden of schakel de lichtbron over naar de lasers voor confocale beelden.
    3. Pas de focus en positie van de cellen af met behulp van de joystickbediening en het scherpstelwiel.
    4. Stel het percentage laservermogen en belichtingstijd in voor de lasers van 512 nm of 488 nm (YFP of GFP) en 568 nm (RFP), zodat het signaal in het beeld er goed uitziet en geen verzadiging bereikt.
    5. Schakel de live-opname in en bekijk de resulterende afbeelding. Zorg ervoor dat er voor elke fluor een duidelijke piek wordt gezien in de histogrammen van het display voor beide kanalen.
    6. Pas het laservermogen en de belichtingstijd indien nodig aan. Houd deze waarden zo laag mogelijk terwijl u beide fluorescerende signalen (RFP en GFP/YFP) kunt detecteren.
    7. Terwijl u het livebeeld van de cellen visualiseert, neemt u meerdere representatieve afbeeldingen van een veld dat een of meer cellen bevat die de mCherry / dsRedmito-reporter voor elke put van de plaat tot expressie brengen en slaat u de gegevens op.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het schema in figuur 2 geeft een overzicht van hoe menselijke MDM kan worden verkregen, getransfecteerd en in beeld gebracht. Na incubatie van de geselecteerde CD14+ monocyten met GM-CSF gedurende 7 dagen, verandert de celmorfologie in de loop van de differentiatieperiode (figuur 3A), gaande van bolvormige suspensiecellen tot spichtig en volledig gehecht (dag 3 en 4), en ten slotte naar meer verspreide cellen wanneer volledig gedifferentieerd (dag 7). Volledig ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de workflow om macrofagen te verkrijgen uit monocyten geïsoleerd uit menselijke bloedmonsters en een methode om de inflammatoire caspase BiFC-verslaggevers efficiënt in menselijke MDM te introduceren zonder de levensvatbaarheid en het gedrag van cellen in gevaar te brengen.

Dit protocol maakt gebruik van de BiFC-techniek35 om de inflammatoire caspasen op het caspase recruitment domein (CARD) te taggen met niet-fluorescerende fragmenten van het ge...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We bedanken de leden van LBH's lab uit heden en verleden die hebben bijgedragen aan de ontwikkeling van deze techniek. Dit lab wordt ondersteund door NIH/NIDDK T32DK060445 (BEB), NIH/NIDDK F32DK121479 (BEB), NIH/NIGMS R01GM121389 (LBH). Figuur 2 is getekend met behulp van Biorender software.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
48 well tissue culture2:34 platesGenesee Scientific25-108
10 cm Tissue Culture DishesVWR25382-166
2 Mercaptoethanol 1000xThermo Fisher Scientific21985023
8 well chambered coverglass with 1.5 HP coverglassCellvisc8-1.5H-N
AutoMACS columnsMiltenyi (Biotec)130-021-101Alleen voor geautomatiseerde scheiding met AutoMACS Pro Separator
AutoMACS Pro SeparatorMiltenyi (Biotec)130-092-545Alleen voor geautomatiseerde scheiding met AutoMACS Pro Separator
AutoMACS Pro Washing SolutionMiltenyi (Biotec)130-092-987Alleen voor geautomatiseerde scheiding met AutoMACS Pro Separator
AutoMACS Rinsing SolutionMiltenyi (Biotec)130-091-222Alleen voor geautomatiseerde scheiding met AutoMACS Pro Separator
AutoMacs running bufferMiltenyi (Biotec)130-091-221Voor handmatige of geautomatiseerde scheiding met QuadroMACS of AutoMACS pro Separator
Axio Observer Z1 motorized inverted microscope equipped with a CSU-X1A 5000 spinning disk unitZeissElke confocale microscoop uitgerust met een lasermodule voorzien van laserlijnen van 568 nm (RFP) en 488 of 512 nm (GFP of YFP) golflengten kan worden gebruikt
AxioObserver A1, Research Grade Inverted MicroscopeZeissElke epifluorescentiemicroscoop met fluorescentiefilters die in staat zijn om 568 nm (RFP) en 488 of 512 nm (GFP of YFP) golflengten op te wekken, kan worden gebruikt
CD14+ MICROBEADSMiltenyi (Biotec)130-050-201Voor handmatige of geautomatiseerde scheiding met QuadroMACS of AutoMACS pro Separator
DPBS without calcium chloride and magnesium chlorideSigmaD8537-6x500ML
DsRed mito plasmidClontech632421Vergelijkbare plasmiden die als fluorescente reporters kunnen worden gebruikt, zijn te vinden op Addgene
Fetal Bovine SerumThermo Fisher Scientific10437028
Ficoll-Paque PLUS 6 x 100 mLSigmaGE17-1440-02
GlutaMAX Supplement (100x)Thermo Fisher Scientific35050079
GM-CSFThermo Fisher ScientificPHC2011
Hemin BioXtra, from Porcine, ≥96.0% (HPLC)Sigma51280-1G
HEPESThermo Fisher Scientific15630106
Inflammatory caspase BiFC plasmidsBeschikbaar op aanvraag bij LBH lab
LPS-EB UltrapureInvivogenTLRL-3PELPS
LS ColumnsMiltenyi (Biotec)130-042-401Alleen voor handmatige scheiding met QuadroMACS Separator
MACS 15 mL Tube RackMiltenyi (Biotec)130-091-052Alleen voor handmatige scheiding met QuadroMACS Separator
MACS MultiStandMiltenyi (Biotec)130-042-303Alleen voor handmatige scheiding met QuadroMACS Separator
mCherry plasmidYungpeng Wang LabVergelijkbare plasmiden die als fluorescente reporters kunnen worden gebruikt, zijn te vinden op Addgene
Neon Transfection SystemThermo Fisher ScientificMPK5000Inclusief Neon elektroporeratieapparaat, pipette en pipette station
Neon Transfection System 10 µL KitThermo Fisher ScientificMPK1096Inclusief resuspendtiebuffer R, resuspendtiebuffer T, elektrolytische buffer E, 96 x 10 µL Neon tips en Neon elektroporeratiebuizen
Nigericin sodium salt, ready made solutionSigmaSML1779-1ML
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
Poly-D-Lysine HydrobromideSigmaP7280-5mg
QuadroMACS SeparatorMiltenyi (Biotec)130-090-976Alleen voor handmatige scheiding met QuadroMACS Separator
qVD-OPhFisher (ApexBio)50-101-3172
RPMI 1640 MediumThermo Fisher Scientific11875119
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redThermo Fisher Scientific25200072
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0Thermo Fisher Scientific15575020
Zeiss Zen 2.6 (blue edition) softwareZeissElke software die wordt gebruikt om de gekozen confocale microscoop te bedienen

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Boatright, K. M., et al. A unified model for apical caspase activation. Molecular Cell. 11 (2), 529-541 (2003).
  2. Pop, C., Salvesen, G. S. Human caspases: activation, specificity, and regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2009).
  3. Boice, A., Bouchier-Hayes, L. Targeting apoptotic caspases in cancer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1867 (6), 118688(2020).
  4. Bolívar, B. E., Vogel, T. P., Bouchier-Hayes, L. Inflammatory caspase regulation: maintaining balance between inflammation and cell death in health and disease. The FEBS Journal. 286 (14), 2628-2644 (2019).
  5. Martinon, F., Tschopp, J. Inflammatory caspases: linking an intracellular innate immune system to autoinflammatory diseases. Cell. 117 (5), 561-574 (2004).
  6. Lamkanfi, M., Vishva, M. D. Mechanisms and functions of inflammasomes. Cell. 157 (5), 1013-1022 (2014).
  7. Viganò, E., et al. Human caspase-4 and caspase-5 regulate the one-step noncanonical inflammasome activation in monocytes. Nature Communications. 6, 8761(2015).
  8. Cerretti, D. P., et al. Molecular cloning of the interleukin-1 beta converting enzyme. Science. 256 (5053), 97(1992).
  9. van de Veerdonk, F. L., Netea, M. G., Dinarello, C. A., Joosten, L. A. Inflammasome activation and IL-1β and IL-18 processing during infection. Trends in Immunology. 32 (3), 110-116 (2011).
  10. Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Molecular Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
  11. Kayagaki, N., et al. Noncanonical inflammasome activation targets caspase-11. Nature. 479 (7371), 117-121 (2011).
  12. Kayagaki, N., et al. Noncanonical inflammasome activation by intracellular LPS independent of TLR4. Science. 341 (6151), 1246-1249 (2013).
  13. Masumoto, J., et al. ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells. The Journal of Biological Chemistry. 274 (48), 33835-33838 (1999).
  14. Bertin, J., DiStefano, P. S. The PYRIN domain: a novel motif found in apoptosis and inflammation proteins. Cell Death and Differentiation. 7 (12), 1273-1274 (2000).
  15. Agostini, L., et al. NALP3 forms an IL-1beta-processing inflammasome with increased activity in Muckle-Wells autoinflammatory disorder. Immunity. 20 (3), 319-325 (2004).
  16. Bürckstümmer, T., et al. An orthogonal proteomic-genomic screen identifies AIM2 as a cytoplasmic DNA sensor for the inflammasome. Nature Immunology. 10 (3), 266-272 (2009).
  17. Latz, E., Xiao, T. S., Stutz, A. Activation and regulation of the inflammasomes. Nature Reviews Immunology. 13 (6), 397-411 (2013).
  18. Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves gasdermin D for noncanonical inflammasome signalling. Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).
  19. Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
  20. Shi, J., et al. Inflammatory caspases are innate immune receptors for intracellular LPS. Nature. 514 (7521), 187-192 (2014).
  21. Bolívar, B. E., et al. Noncanonical Roles of Caspase-4 and Caspase-5 in Heme-Driven IL-1β Release and Cell Death. The Journal of Immunology. 206 (8), 1878-1889 (2021).
  22. Schmid-Burgk, J. L., et al. Caspase-4 mediates noncanonical activation of the NLRP3 inflammasome in human myeloid cells. European Journal of Immunology. 45 (10), 2911-2917 (2015).
  23. Baker, P. J., et al. NLRP3 inflammasome activation downstream of cytoplasmic LPS recognition by both caspase-4 and caspase-5. European Journal of Immunology. 45 (10), 2918-2926 (2015).
  24. Cullen, S. P., Kearney, C. J., Clancy, D. M., Martin, S. J. Diverse activators of the NLRP3 inflammasome promote IL-1β secretion by triggering necrosis. Cell Reports. 11 (10), 1535-1548 (2015).
  25. Sanders, M. G., et al. Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes. Cell Death & Disease. 6, 1813(2015).
  26. Charendoff, C. I., Bouchier-Hayes, L. Lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), e57316(2018).
  27. Bouchier-Hayes, L., et al. Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity. Molecular Cell. 35 (6), 830-840 (2009).
  28. Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. Peripheral blood mononuclear cells: Isolation, Freezing, thawing, and culture. Methods in Molecular Biology. 1304, 53-61 (2016).
  29. Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications. Current Pathobiology Reports. 7 (2), 17-27 (2019).
  30. Perregaux, D., et al. IL-1 beta maturation: evidence that mature cytokine formation can be induced specifically by nigericin. The Journal of Immunology. 149 (4), 1294-1303 (1992).
  31. Cheneval, D., et al. Increased mature interleukin-1β (IL-1β) secretion from THP-1 cells induced by nigericin is a result of activation of p45 IL-1β-converting enzyme processing. Journal of Biological Chemistry. 273 (28), 17846-17851 (1998).
  32. Fernandes-Alnemri, T., et al. The pyroptosome: a supramolecular assembly of ASC dimers mediating inflammatory cell death via caspase-1 activation. Cell Death and Differentiation. 14 (9), 1590-1604 (2007).
  33. Lu, A., et al. Unified polymerization mechanism for the assembly of ASC-dependent inflammasomes. Cell. 156 (6), 1193-1206 (2014).
  34. Muller-Eberhard, U., Javid, J., Liem, H. H., Hanstein, A., Hanna, M. Brief report: Plasma concentrations of hemopexin, haptoglobin and heme in patients with various hemolytic diseases. Blood. 32 (5), 811-815 (1968).
  35. Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions. Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).
  36. Thornberry, N. A., et al. A novel heterodimeric cysteine protease is required for interleukin-1βprocessing in monocytes. Nature. 356 (6372), 768-774 (1992).
  37. Jensen, K., Anderson, J. A., Glass, E. J. Comparison of small interfering RNA (siRNA) delivery into bovine monocyte-derived macrophages by transfection and electroporation. Veterinary Immunology and Immunopathology. 158 (3-4), 224-232 (2014).
  38. Tada, Y., Sakamoto, M., Fujimura, T. Efficient gene introduction into rice by electroporation and analysis of transgenic plants: use of electroporation buffer lacking chloride ions. Theoretical and Applied Genetics. 80 (4), 475-480 (1990).
  39. Bhowmik, P., et al. Targeted mutagenesis in wheat microspores using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 8 (1), 6502(2018).
  40. Sansom, D. M., Manzotti, C. N., Zheng, Y. What's the difference between CD80 and CD86. Trends in Immunology. 24 (6), 314-319 (2003).
  41. Kurokawa, M., Kornbluth, S. Caspases and kinases in a death grip. Cell. 138 (5), 838-854 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Caspase activatieCaspase BiFCVisualisatie van het inflammasoomNucleofectietechniekConfocale microscopieInductie van pyroptoseCytokinerijpingFluorescentiemicroscopie

Gerelateerde artikelen