Methodenartikel

Microdissectie en dissociatie van de murine-eileider: individuele segmentidentificatie en eencellige isolatie

DOI:

10.3791/63168

⸱

4 november 2021

 ,  ,  , 
1Division of Biomedical Sciences, School of Medicine, University of California, Riverside, 2Microscopy and Imaging Core Facility, University of California, Riverside

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een methode voor microdissectie van de eileider van de muis die het mogelijk maakt om de afzonderlijke segmenten te verzamelen met behoud van RNA-integriteit wordt gepresenteerd. Bovendien wordt een niet-enzymatische ovductale celdissociatieprocedure beschreven. De methoden zijn geschikt voor latere gen- en eiwitanalyse van de functioneel verschillende eileidersegmenten en gedissocieerde eileidercellen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Muismodelsystemen zijn ongeëvenaard voor de analyse van ziekteprocessen vanwege hun genetische manipuleerbaarheid en de lage kosten van experimentele behandelingen. Vanwege hun kleine lichaamsgrootte zijn sommige structuren, zoals de eileider met een diameter van 200-400 μm, echter relatief moeilijk te bestuderen gebleken, behalve door immunohistochemie. Onlangs hebben immunohistochemische studies complexere verschillen in eileidersegmenten blootgelegd dan eerder werd erkend; de eileider is dus verdeeld in vier functionele segmenten met verschillende verhoudingen van zeven verschillende epitheelceltypen. De verschillende embryologische oorsprong en verhoudingen van de epitheelceltypen maken de vier functionele regio's waarschijnlijk differentieel vatbaar voor ziekten. Voorloperlaesies van sereuze intra-epitheliale carcinomen ontstaan bijvoorbeeld uit het infundibulum in muismodellen en uit het overeenkomstige fimboriale gebied in de menselijke eileider. Het hier beschreven protocol beschrijft een methode voor microdissectie om de eileider zodanig te verdelen dat er voldoende hoeveelheid en zuiverheid van RNA ontstaat die nodig is voor downstream-analyse, zoals reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR) en RNA sequencing (RNAseq). Ook wordt een meestal niet-enzymatische weefseldissociatiemethode beschreven die geschikt is voor flowcytometrie of eencellige RNAseq-analyse van volledig gedifferentieerde eileidercellen. De beschreven methoden zullen verder onderzoek met behulp van de muizenne eileider op het gebied van voortplanting, vruchtbaarheid, kanker en immunologie vergemakkelijken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De eileider van de muriene lijn is qua functie en morfologie vergelijkbaar met de menselijke eileider1. Beide bestaan uit een pseudostraïstisch trilhaarepitheel, bestaande uit twee historisch beschreven epitheelbewonende cellen: trilhaarcellen en secretoire cellen1,2. De eileider heeft drie klassiek erkende segmenten: het infundibulum, de ampulla en de landengte. In een recente studie, Harwalkar et al. 3 onderzocht ovöcusmorfologie en genexpressie die leidden tot de uitbreiding van de categorisatie van residente epitheelcellen tot zeven verschillende pop....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierbehandeling en -procedures werden goedgekeurd door de University of California, Riverside institutional animal care and use committee en waren in overeenstemming met de richtlijnen van de American Association for Laboratory Animal Care, het Amerikaanse ministerie van Landbouw en de National Institutes of Health. De beschreven methode maakte gebruik van C57BL/6 volwassen, vrouwelijke muizen. Alle dieren werden geëuthanaseerd door onthoofding voorafgaand aan het oogsten van weefsel.

OPMERKING: Een overzicht van het protocol, dat een blauwe kleurstof gebruikt om te helpen bij efficiënte dissectie en ontkoppeling van de eileider, wordt....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het beschreven dissociatieprotocol levert 100.000-120.000 cellen per muis op met pooling van beide eileiders. De methode is zacht genoeg om multi-ciliated celgrenzen intact te laten, waardoor een onderscheid mogelijk is tussen multi-ciliated cellen en secretoire cellen, en wordt gecontroleerd of de verteringsmethode zacht genoeg is om de-differentiatie te voorkomen. Representatieve immunofluorescentiebeelden in figuur 5 tonen kleincellige klonten na stap 4.2.1, gedurende 3 minuten gefixeerd .......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De drie segmenten van de eileider zijn histologisch, morfologisch en functioneel verschillend1,2,3. Het epitheel varieert sterk van het ene uiteinde van de eileider naar het andere. Trilhaarcellen domineren aan het fimbardale/infundibulaire uiteinde, terwijl secretoire cellen domineren in het istmische gebied1. Hoewel deze algemene gradiënt al enige tijd wordt erkend, heeft recent werk meer verschillen tu.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een DoD Breakthrough Award aan AMW (BCRP W81XWH-14-1-0425). KCR werd gedeeltelijk ondersteund door intramurale beurzen: de Pease Cancer Pre-Doctoral Fellowship en de Mary Galvin Burden Pre-Doctoral Fellowship in Biomedical Sciences en University of California, Riverside, intramurale prijzen: de Graduate Council Fellowship Committee Dissertation Research Grant en de Graduate Division Dissertation Year Program Award. De auteurs bedanken Gillian M. Wright en Alyssa M. Kumari voor hulp bij het vroegtijdig oplossen van problemen met deze methode.

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.5 mm Stainless steel bead mixNext AdvanceSSB05Mix 1:1 met 1.4 mm SSB14B, gesteriliseerd
1.4 mm Stainless steel bead mixNext AdvanceSSB14BMix 1:1 met 0.5 mm SSB05, gesteriliseerd
1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS)Gibco21600-010Koud, steriel
25G naaldBD305122
60 mm steriele petrischalenCorning430166
70 μm cel gaasFisherbrand22-636-548
Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kitAgilent 2100 Bioanalyzer5067-1513
Bead Bullet Blender Tissue HomogenizerNext AdvanceBBY24M
BioanlyzerAgilent 2100 Bioanalyzer
Bovine serum albumineSigma AldrichA7906
Koude plaat/pack/oppervlak naar keuzeN/AN/ABij -20 °C bewaard voor dissectie
Tandheelkundige wasPolysciences Inc.403
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)/ Ham’s F12Corning10-090-CVBereidt dissectiemedium: DMEM/ Ham’s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep
Fetal Bovine SerumCorning35-015CV
Fijne punt forceps naar keuzeN/AN/A
GlycineSigma AldrichG712bImmunocytochemische validatie beelden
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555InvitrogenA-21422Immunocytochemische validatie beelden
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488InvitrogenA-11001Immunocytochemische validatie beelden
HepesSigma AldrichH-3784
Hoescht 33342Cell Signaling Technologies4082SImmunocytochemische validatie beelden
Omgekeerde samengestelde microscoopKeyence BZ-X700
Mouse anti-mouse OccludinInvitrogen33-1500Immunocytochemische validatie beelden
Non-enzymatische dissociatie bufferN/A5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS
Nylon macro-gaas 1 mm x 1 mmThomas Scientific1210U04
ParaformaldehydeSigma AldrichP-6148Immunocytochemische validatie beelden
Pen-StrepMP Biomedicals10220-718
Prolong Gold Antifade ReagentCell Signaling Technologies9071SImmunocytochemische validatie beelden: antifade montagemedium
PronaseSigma Aldrich10165921001Bereid pronase spijsverteringsmedium: 0,15% pronase in DMEM/Ham's F12, sterieel
Propidium JodideRoche11 348 639 001Viabiliteitsvalidatie beelden
Rabbit anti-mouse Acetylated-TubulinAbcamab179484Immunocytochemische validatie beelden
RBC lyseringsbufferBD Biosciences555899
RNeasy Mini KitQiagen74134Gebruikt voor on-column zuivering in tekst
Microdissectie schaar met veerRoboz SurgicalRS-5610
Steriele 3 mL bulb pipettenGlobe Scientific137135
Toluidine blauwAlfa AesarJ66015Bereid toluidine blauw oplossing: 1% in 1X DPBS, sterieel
Tris-Buffered Saline-Tween (TBST)N/AN/AImmunocytochemische validatie beelden; 0,1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7,5, 1% Tween 20
Triton-X-100Mallinckrodt Inc.3555Immunocytochemische validatie beelden
Trizol RNA Extractie ReagensInvitrogen15596026Verwezen als RNA extractiereagens. Nuclease-vrij water, chloroform en isoproponal zijn vereist als aanvulling bij het uitvoeren van Trizol extractie volgens de richtlijnen van de fabrikant

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stewart, C. A., et al. Mouse oviduct developmemt in Mouse Development: From Oocyte to Stem Cells. Kubiak, J. Z., et al. , Springer. Berlin Heidelberg. 247-262 (2012).
  2. Ford, M. J., et al. Oviduct epithelial cell....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Microdissectie van de eileiderweefseldissociatieflowcytometrieRNA sequencingepithelcelleneileidersegmentenreverse transcriptie PCR

Gerelateerde artikelen