Methodenartikel

Microdissectie en dissociatie van de murine-eileider: individuele segmentidentificatie en eencellige isolatie

DOI:

10.3791/63168

⸱

4 november 2021

 ,  ,  , 
1Division of Biomedical Sciences, School of Medicine, University of California, Riverside, 2Microscopy and Imaging Core Facility, University of California, Riverside

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een methode voor microdissectie van de eileider van de muis die het mogelijk maakt om de afzonderlijke segmenten te verzamelen met behoud van RNA-integriteit wordt gepresenteerd. Bovendien wordt een niet-enzymatische ovductale celdissociatieprocedure beschreven. De methoden zijn geschikt voor latere gen- en eiwitanalyse van de functioneel verschillende eileidersegmenten en gedissocieerde eileidercellen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Muismodelsystemen zijn ongeëvenaard voor de analyse van ziekteprocessen vanwege hun genetische manipuleerbaarheid en de lage kosten van experimentele behandelingen. Vanwege hun kleine lichaamsgrootte zijn sommige structuren, zoals de eileider met een diameter van 200-400 μm, echter relatief moeilijk te bestuderen gebleken, behalve door immunohistochemie. Onlangs hebben immunohistochemische studies complexere verschillen in eileidersegmenten blootgelegd dan eerder werd erkend; de eileider is dus verdeeld in vier functionele segmenten met verschillende verhoudingen van zeven verschillende epitheelceltypen. De verschillende embryologische oorsprong en verhoudingen van de epitheelceltypen maken de vier functionele regio's waarschijnlijk differentieel vatbaar voor ziekten. Voorloperlaesies van sereuze intra-epitheliale carcinomen ontstaan bijvoorbeeld uit het infundibulum in muismodellen en uit het overeenkomstige fimboriale gebied in de menselijke eileider. Het hier beschreven protocol beschrijft een methode voor microdissectie om de eileider zodanig te verdelen dat er voldoende hoeveelheid en zuiverheid van RNA ontstaat die nodig is voor downstream-analyse, zoals reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR) en RNA sequencing (RNAseq). Ook wordt een meestal niet-enzymatische weefseldissociatiemethode beschreven die geschikt is voor flowcytometrie of eencellige RNAseq-analyse van volledig gedifferentieerde eileidercellen. De beschreven methoden zullen verder onderzoek met behulp van de muizenne eileider op het gebied van voortplanting, vruchtbaarheid, kanker en immunologie vergemakkelijken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De eileider van de muriene lijn is qua functie en morfologie vergelijkbaar met de menselijke eileider1. Beide bestaan uit een pseudostraïstisch trilhaarepitheel, bestaande uit twee historisch beschreven epitheelbewonende cellen: trilhaarcellen en secretoire cellen1,2. De eileider heeft drie klassiek erkende segmenten: het infundibulum, de ampulla en de landengte. In een recente studie, Harwalkar et al. 3 onderzocht ovöcusmorfologie en genexpressie die leidden tot de uitbreiding van de categorisatie van residente epitheelcellen tot zeven verschillende populaties. Bovendien stelden ze de ampullaire-landengte-overgang vast als een apart segment van de eileider3. De hierin beschreven methode, die zich richt op het infundibulum, ampulla en landengte, kan gemakkelijk worden uitgebreid met de ampullaire-isthmische overgang2,3. Het infundibulaire gebied bevat het ostium, of de opening van de eileider, en omvat het fimbriale gebied en de proximale stengel. Als je naar de baarmoeder gaat, is de volgende het ampulla en dan de landengte. Trilhaarcellen zijn het meest prominent in het distale uiteinde van het gebied, proximaal aan de eierstok of infundibulum, terwijl secretoire cellen het meest prominent zijn in het proximale uiteinde of landengtesegment1. In tegenstelling tot de menselijke eileider is de eileider een opgerolde structuur die wordt ondersteund door de mesosalpinx, een uitbreiding van het brede ligament peritoneum1,4. Bovendien is de eileider van de muis ingepakt in een bursale zak die de kans op oöcytoverdracht in de eileider verhoogt4. De ampulla wordt geïdentificeerd als de locatie van bevruchting, van waaruit zich ontwikkelende embryo's in de landengte overgaan voordat ze de baarmoeder binnengaan5. Tubale segmenten hebben een diameter van 200-400 μm en de langere ampullen- en landengtegebieden zijn ongeveer 0,5-1,0 cm lang4. De eileider zwelt op tijdens de oestruscyclus en de ampulla en infundibulum zijn uitzetbaarder dan de landengte1.

Over proliferatie van cellen, vooral secretoire cellen, karakteriseren voorloperlaesies van sereuze tumoren in de bekkenholte6. Deze voorloper sereuze intra-epitheliale laesies ontstaan in het eileiderepitheel uitsluitend in het fimboriale gebied; het is onbekend waarom de vorming van laesies beperkt is tot dit gebied waar normaal gesproken het overheersende celtype wordt geciliteerd, niet secretoir2,7,8. De regionaliteit in termen van normale fysiologische functie, evenals verhoogde interesse in de eileideroorsprong van eierstokkanker9,10,11,12,13, onderstreept het belang van afzonderlijke evaluatie van de eileidersegmenten.

De hier beschreven methode beschrijft de verzameling van afzonderlijke eileidersegmenten voor daaropvolgende downstream-analyses van segmentspecifieke genexpressie en functie van gedissocieerde cellen. Traditioneel worden veel weefsels verwerkt voor hele RNA-extractie volgens de fenol: chloroform-methode of een volledige extractiemethode op de kolom; we vonden echter dat de RNA-kwaliteit behouden bleef terwijl er voldoende opbrengst werd geproduceerd met de beschreven combinatiemethode. Met behulp van deze methode kunnen zeer kleine functionele segmenten van de eileider worden verwerkt voor stroomafwaartse analyses in plaats van de eileider als geheel te onderzoeken, wat resultaten kan maskeren die representatief zijn voor de verschillende segmenten14.

Gedissocieerde muriene eileidercellen zijn zelden onderzocht door flowcytometrie, hoogstwaarschijnlijk vanwege de beperkende celopbrengst van dit weefsel. Een benadering om dit probleem te overwinnen was om cellen te dissociëren, ze in cultuur te laten groeien en vervolgens re-differentiatie in vitro te stimuleren om geschikte celnummers te verkrijgen voor downstream celanalyse15,16,17,18. Een beperking van deze benadering is de tijd ex vivo en veranderde micro-omgeving in cultuur, die beide waarschijnlijk de genexpressie veranderen. Er is ook een aanname dat morfologische redifferentiatie dezelfde transcriptionele en proteomische signatuur heeft als bij het intacte dier. De huidige dissociatiemethode is ontworpen om het hoogste aantal epitheelcellen in een heterogene eileidercelpopulatie te bereiken met behoud van eencellige differentiatie. Verder beperkt de meestal niet-enzymatische benadering waarschijnlijk het verlies van celoppervlakeiwitten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierbehandeling en -procedures werden goedgekeurd door de University of California, Riverside institutional animal care and use committee en waren in overeenstemming met de richtlijnen van de American Association for Laboratory Animal Care, het Amerikaanse ministerie van Landbouw en de National Institutes of Health. De beschreven methode maakte gebruik van C57BL/6 volwassen, vrouwelijke muizen. Alle dieren werden geëuthanaseerd door onthoofding voorafgaand aan het oogsten van weefsel.

OPMERKING: Een overzicht van het protocol, dat een blauwe kleurstof gebruikt om te helpen bij efficiënte dissectie en ontkoppeling van de eileider, wordt weergegeven in de eerste figuur (figuur 1).

figure-protocol-1
Figuur 1: Overzicht van de microdissectiemethode. (A) Linkerpaneel toont de intacte structuur waaruit het grootste deel van het ovariële vetkussen en restanten van bindweefsel rond de eileider zijn verwijderd. Hierna helpt de toevoeging van toluidineblauw de spoelen van de eileider (middelste paneel) te onderscheiden. Rechterpaneel toont structuren na het verwijderen van de eierstok. (B) Een ongecoileerde eileider met inwendige bochten om te bepalen waar elk segment begint en eindigt. (C) Cartoon van de gebruikte segmentatie (niet op schaal getekend). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Voorbereiding van het dissectieoppervlak

  1. Bevestig met lijm een stuk tandwas op een petrischaaltje en laat het drogen (figuur 2A). Ontsmet het gerecht met 70% ethanol. Het oppervlak is klaar voor dissectie.

2. Macrodissectie van de eierstok, eileider en baarmoeder

  1. Immobiliseer de petrischaal met de tandwas op een koud platform naar keuze (bijvoorbeeld een ijspakking die vóór gebruik op -20 °C wordt gehouden) onder een dissectiemicroscoop wanneer deze klaar is voor dissectie (figuur 2A).
  2. Desinfecteer het ventrale oppervlak van het dier met 70% ethanol. Open de buik- en bekkenholte met een steriele dissectieschaar en verplaats het maagdarmkanaal naar één kant om de dorsale bihornale baarmoeder te lokaliseren. Volg elke baarmoederhoorn rostrally om elke eileider en eierstok te lokaliseren die zijn gehuld in het baarmoedervetkussen, net onder de nier (figuur 2B, C).
  3. Snijd beide laterale eileiders met de eierstokken en een deel van de distale baarmoederhoorn nog bevestigd met behulp van een dissectieschaar. Snijd elke laterale baarmoederhoorn af met ongeveer 1-2 cm van de hoorn nog bevestigd aan de opgerolde eileider en eierstok (figuur 2D). Dompel het weefsel onmiddellijk onder in 2 ml koud dissectiemedium (zie Materiaaltabel).

figure-protocol-2
Figuur 2: Macrodissectie van de eierstok en de dissectie-opstelling. De eileider bevindt zich dorsaal in de bekkenholte aan de basis van de nier in het ovariële vetkussen (B). Lokaliseer de baarmoedersplitsing in de bekkenholte (C) en volg de laterale baarmoederhoorn om het baarmoeder-eileider-eierstokcontinuüm (B) te lokaliseren. Verwijder deze structuren door één baarmoederhoorn en grove dissectie door te snijden. Plaats op het ontleedplatform (A) en bevestig het baarmoedergedeelte met een naald (A en D) op tandwas. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

OPMERKING: Laat voldoende baarmoederhoorn intact en bevestigd aan de eileider om bevestiging aan het dissectieplatform mogelijk te maken (figuur 2D).

  1. Breng het baarmoederweefsel aan op de tandwas met een steriele naald van 25 G om weefsel vast te zetten voor dissectie (figuur 2A, D en figuur 3A). Werk onder de dissectiemicroscoop en reinig en ontleed het vetkussen en bindweefsel van de eierstokken om een duidelijke visualisatie van de eileider mogelijk te maken (figuur 3B).

figure-protocol-3
Figuur 3: Stap voor stap eileider microdissectie. Na verwijdering van restvet en bindweefsel (A, B), voeg toluidineblauw toe aan het weefsel (C) en spoel vervolgens weg om visualisatie en daaropvolgende verwijdering van de eierstok en ontkoppeling van de buis (D-H) te vergemakkelijken. Het infundibulum is te vinden naast de proximale landengte en baarmoeder-tubale overgang (UTJ). Trek lichtjes aan het distale uiteinde tijdens het snijden bij de mesosalpinx om te ontkoppelen en onthul de endogene wendingen van de eileider (H) om te oriënteren voor de juiste segmentatie. Figuur A-C schaalbalk = 500 μm, D-H schaalbalk = 400 μm (I) Cartoon van de verschillende segmenten (niet getekend op schaal). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Gebruik een spuit van 1 ml, doseer en incubeer de eileider die op de baarmoeder is aangebracht in 1-2 druppels steriele 1% toluidineblauwe kleurstofoplossing gedurende 30 s-1 min. Spoel af met de fosfaatgebuufferde zoutoplossing (DPBS) van Dulbecco en verwijder alle vloeistof (figuur 3C).
  2. Trek de eierstok lichtjes uit de opgerolde eileider en snijd het bursale membraan en de brede ligament weg om de eierstok uit de eileider te verwijderen zonder het tubale weefsel in gevaar te brengen (figuur 3D, E).
    OPMERKING: De eierstok is niet bevestigd aan de eileider, maar ingekapseld in het bursale membraan met de eileider (figuur 2D) en verbonden met de laterale kant van de baarmoeder via de brede ligament.

3. Microdissectie en segmentatie van de eileider

  1. Lokaliseer het distale, fimboriale uiteinde van de eileider die lateraal naar de baarmoeder-tubale overgang (UTJ) wordt gevonden. De eileider spoelt terug op zichzelf; vandaar dat het fimbriale uiteinde zich zijdelings naar het proximale uiteinde kan bevinden en een geschikt startpunt is om te oriënteren voor het loskoppelen van de eileider (figuur 3F,I).
    1. Terwijl u voorzichtig aan de buis trekt, snijdt u de mesosalpinx (figuur 3I) weg met een microschaar in veervorm om de eileider los te maken (figuur 3G).
  2. Eenmaal losgesneden, snijdt u de buis om de infundibulaire, ampullaire en istmische gebieden te produceren (figuur 3H).
    1. Na excisie van het infundibulum (fimbriaal uiteinde en proximale stengel), snijdt u het ampullaire gebied weg door te snijden na de tweede prominente draai van de buis (snede tussen bocht twee en drie, ongeveer 1 cm lang). Snijd ten slotte het resterende deel naar de UTJ, het istmische gebied (figuur 3H).
      OPMERKING: De eileider zal niet volledig loskomen in een rechte structuur. De buis behoudt zijn draai (figuur 3H)3. Op basis van de volgende bochten na het ampullaire gebied kan men de resterende buis verder segmenteren in de ampullaire-isthmische overgang en de landengte3. Na ampulla-excisie, snijd tussen bocht vijf en zes om de ampullaire-isthmische overgang te verkrijgen; de resterende buis (draai zes naar het begin van de UTJ) is de landengte3.
  3. Onmiddellijk vastgesneden weefselsegmenten in vloeibare stikstof voor RNA-isolatie of fixeren en verwerken elk segment voor georiënteerde inbedding en immunohistologische analyse.
    1. Voeg 200 μL koud RNA-extractiereagens en 1:1 homogenisatieparelmengsel (zie Materiaaltabel) toe aan het weefsel als u overgaat tot RNA-extractie (zie stap 5.1).

4. Eileiderdissociatie

  1. Vervolg van stap 3.1.1 hierboven) Voor een optimale dissociatie van het epitheel, spleet de eileider open in de gebieden waar mogelijk (d.w.z. infundibulum en ampulla) om het luminale epitheel bloot te leggen (figuur 4A).

figure-protocol-4
Figuur 4: Eileiderceldissociatie, deel 1. Cartoon die laat zien hoe het distale epitheel te belichten voor optimale celdissociatie (A) en een afbeelding die de gemakkelijkste manier toont om het 1 mm2-gaas (B) te gebruiken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Beginnend bij het fimboriale gebied, met behulp van een tang als hefboom, snijdt u de buis in de lengterichting door met een veervormige schaar.
  1. Hak de opengespleet delen en de resterende eileider in segmenten (~ 1-2 mm groot) en voeg 5 ml warme, niet-enzymatische dissociatiebuffer toe (zie Tabel met materialen) en incubeer bij 37 °C.
    1. Resuspend de weefselstukken en gedissocieerde cellen met een bulb pipettor elke 3 minuten gedurende 9-10 minuten. Verdun de dissociatiebuffer 1:1 met koud dissectiemedium.
  2. Verzamel de cellen door centrifugeren (350 x g, 3 min, 4 °C). Resuspend de cellen in 2 ml RBC-lysisbuffer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur en verdun vervolgens 1:1 met koud dissectiemedium.
  3. Verzamel de cellen door centrifugering (350 x g, 3 min, 4 °C) en resuspend in 5 ml koude pronase-oplossing.
    1. Incubeer in pronase-verteringsmedium en resuspend de celklonten met een bolpipettor elke 3-5 min totdat een enkele celsuspensie is bereikt (~ 25-30 min).
      OPMERKING: Deze stap kan het beste worden uitgevoerd in een weefselkweekplaat of -kolf om constante observatie mogelijk te maken en onnodige overmatige blootstelling aan pronase te voorkomen.
  4. Leid de cellen door een steriel macrogaas (1 mm x 1 mm maassel dat met een elastiekje op een conische buis is aangebracht (figuur 4B)) om eventuele resterende niet-gesuscieerde weefselstukken te verwijderen. Verzamel de cellen door centrifugering (350 x g, 3 min, 4 °C) en resuspend in een koud medium dat geschikt is voor downstream-analyse (bijv. FACS-buffer als u doorgaat met kleuring voor flowcytometrie).

5. RNA-extractie van eileidersegmenten

  1. Homogeniseer vastgevroren monsters in 200 μL RNA-extractiereagens in een kralenvelblenderweefselhomogenisator op niveau 12 gedurende twee intervallen (elk 3 min) bij 4 °C met behulp van het roestvrijstalen kralenmengsel.
    OPMERKING: Om de RNA-integriteit te behouden, moeten monsters onmiddellijk van de vastgevroren toestand naar RNA-extractiereagens worden verplaatst en niet worden gewogen.
  2. Centrifugeer homogenaat bij 100-200 x g kort in een tafelcentrifuge gedurende ongeveer 5 s bij kamertemperatuur om de vloeistof van de kralen te scheiden. Breng het supernatant over in een verse buis.
  3. Voeg nog eens 200 μL RNA-extractiereagens toe aan de kralen om meer monsters te herstellen, gevolgd door centrifugering (100-200 x g, 5 s, kamertemperatuur). Combineer de supernatanten.
    OPMERKING: Gebruik een kleine pipetpunt (de meeste p200-tips zijn geschikt) om te voorkomen dat de kraal wordt overgedragen bij het verwijderen van het supernatant.
  4. Volg de richtlijnen van de fabrikant om RNA geleidelijk te scheiden en neer te slaan. Representatieve monsters werden 's nachts neergeslagen bij -20 °C met 100% isopropanol (ongeveer 2:1 volume, isopropanol: teruggewonnen waterige fase).
  5. Breng het volledige RNA-neerslag samen met de oplossing over naar een RNA-bindende spinkolom en centrifuge gedurende 30 s bij 9.500 x g. Zuiver het RNA op de kolom volgens de richtlijnen van de fabrikant en elueer het RNA vervolgens in 20 μL nucleasevrij water. Beoordeel de kwaliteit/kwantiteit op een microvolumespectrofotometer en/of bioanalysator.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het beschreven dissociatieprotocol levert 100.000-120.000 cellen per muis op met pooling van beide eileiders. De methode is zacht genoeg om multi-ciliated celgrenzen intact te laten, waardoor een onderscheid mogelijk is tussen multi-ciliated cellen en secretoire cellen, en wordt gecontroleerd of de verteringsmethode zacht genoeg is om de-differentiatie te voorkomen. Representatieve immunofluorescentiebeelden in figuur 5 tonen kleincellige klonten na stap 4.2.1, gedurende 3 minuten gefixeerd ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De drie segmenten van de eileider zijn histologisch, morfologisch en functioneel verschillend1,2,3. Het epitheel varieert sterk van het ene uiteinde van de eileider naar het andere. Trilhaarcellen domineren aan het fimbardale/infundibulaire uiteinde, terwijl secretoire cellen domineren in het istmische gebied1. Hoewel deze algemene gradiënt al enige tijd wordt erkend, heeft recent werk meer verschillen tu...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een DoD Breakthrough Award aan AMW (BCRP W81XWH-14-1-0425). KCR werd gedeeltelijk ondersteund door intramurale beurzen: de Pease Cancer Pre-Doctoral Fellowship en de Mary Galvin Burden Pre-Doctoral Fellowship in Biomedical Sciences en University of California, Riverside, intramurale prijzen: de Graduate Council Fellowship Committee Dissertation Research Grant en de Graduate Division Dissertation Year Program Award. De auteurs bedanken Gillian M. Wright en Alyssa M. Kumari voor hulp bij het vroegtijdig oplossen van problemen met deze methode.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.5 mm Stainless steel bead mixNext AdvanceSSB05Mix 1:1 met 1.4 mm SSB14B, gesteriliseerd
1.4 mm Stainless steel bead mixNext AdvanceSSB14BMix 1:1 met 0.5 mm SSB05, gesteriliseerd
1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS)Gibco21600-010Koud, steriel
25G naaldBD305122
60 mm steriele petrischalenCorning430166
70 μm cel gaasFisherbrand22-636-548
Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kitAgilent 2100 Bioanalyzer5067-1513
Bead Bullet Blender Tissue HomogenizerNext AdvanceBBY24M
BioanlyzerAgilent 2100 Bioanalyzer
Bovine serum albumineSigma AldrichA7906
Koude plaat/pack/oppervlak naar keuzeN/AN/ABij -20 °C bewaard voor dissectie
Tandheelkundige wasPolysciences Inc.403
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)/ Ham’s F12Corning10-090-CVBereidt dissectiemedium: DMEM/ Ham’s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep
Fetal Bovine SerumCorning35-015CV
Fijne punt forceps naar keuzeN/AN/A
GlycineSigma AldrichG712bImmunocytochemische validatie beelden
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555InvitrogenA-21422Immunocytochemische validatie beelden
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488InvitrogenA-11001Immunocytochemische validatie beelden
HepesSigma AldrichH-3784
Hoescht 33342Cell Signaling Technologies4082SImmunocytochemische validatie beelden
Omgekeerde samengestelde microscoopKeyence BZ-X700
Mouse anti-mouse OccludinInvitrogen33-1500Immunocytochemische validatie beelden
Non-enzymatische dissociatie bufferN/A5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS
Nylon macro-gaas 1 mm x 1 mmThomas Scientific1210U04
ParaformaldehydeSigma AldrichP-6148Immunocytochemische validatie beelden
Pen-StrepMP Biomedicals10220-718
Prolong Gold Antifade ReagentCell Signaling Technologies9071SImmunocytochemische validatie beelden: antifade montagemedium
PronaseSigma Aldrich10165921001Bereid pronase spijsverteringsmedium: 0,15% pronase in DMEM/Ham's F12, sterieel
Propidium JodideRoche11 348 639 001Viabiliteitsvalidatie beelden
Rabbit anti-mouse Acetylated-TubulinAbcamab179484Immunocytochemische validatie beelden
RBC lyseringsbufferBD Biosciences555899
RNeasy Mini KitQiagen74134Gebruikt voor on-column zuivering in tekst
Microdissectie schaar met veerRoboz SurgicalRS-5610
Steriele 3 mL bulb pipettenGlobe Scientific137135
Toluidine blauwAlfa AesarJ66015Bereid toluidine blauw oplossing: 1% in 1X DPBS, sterieel
Tris-Buffered Saline-Tween (TBST)N/AN/AImmunocytochemische validatie beelden; 0,1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7,5, 1% Tween 20
Triton-X-100Mallinckrodt Inc.3555Immunocytochemische validatie beelden
Trizol RNA Extractie ReagensInvitrogen15596026Verwezen als RNA extractiereagens. Nuclease-vrij water, chloroform en isoproponal zijn vereist als aanvulling bij het uitvoeren van Trizol extractie volgens de richtlijnen van de fabrikant

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stewart, C. A., et al. Mouse oviduct developmemt in Mouse Development: From Oocyte to Stem Cells. Kubiak, J. Z., et al. , Springer. Berlin Heidelberg. 247-262 (2012).
  2. Ford, M. J., et al. Oviduct epithelial cells constitute two developmentally distinct lineages that are spatially separated along the distal-proximal axis. Cell Reports. 36 (10), 109677(2021).
  3. Harwalkar, K., et al. Anatomical and cellular heterogeneity in the mouse oviduct-its potential roles in reproduction and preimplantation development. Biology of Reproduction. 104 (6), 1249-1261 (2021).
  4. Agduhr, E. Studies on the structure and development of the bursa ovarica and the tuba uterina in the mouse. Acta Zoologica. 8 (1), 1(1927).
  5. Pulkkinen, M. O. Oviductal function is critical for very early human life. Annals of Medicine. 27 (3), 307-310 (1995).
  6. Kindelberger, D. W., et al. Intraepithelial carcinoma of the fimbria and pelvic serous carcinoma: Evidence for a causal relationship. American Journal of Surgical Pathology. 31 (2), 161-169 (2007).
  7. Ghosh, A., Syed, S. M., Tanwar, P. S. In vivo genetic cell lineage tracing reveals that oviductal secretory cells self-renew and give rise to ciliated cells. Development. 144 (17), 3031-3041 (2017).
  8. Lee, Y., et al. A candidate precursor to serous carcinoma that originates in the distal fallopian tube. Journal of Pathology. 211 (1), 26-35 (2007).
  9. Kim, J., et al. High-grade serous ovarian cancer arises from fallopian tube in a mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (10), 3921-3926 (2012).
  10. Perets, R., et al. Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models. Cancer Cell. 24 (6), 751-765 (2013).
  11. Sherman-Baust, C. A., et al. A genetically engineered ovarian cancer mouse model based on fallopian tube transformation mimics human high-grade serous carcinoma development. Journal of Pathology. 233 (3), 228-237 (2014).
  12. Zhai, Y. L., et al. High-grade serous carcinomas arise in the mouse oviduct via defects linked to the human disease. Journal of Pathology. 243 (1), 16-25 (2017).
  13. Karthikeyan, S., et al. Prolactin signaling drives tumorigenesis in human high grade serous ovarian cancer cells and in a spontaneous fallopian tube derived model. Cancer Letters. 433, 221-231 (2018).
  14. Shao, R., et al. Differences in prolactin receptor (PRLR) in mouse and human fallopian tubes: Evidence for multiple regulatory mechanisms controlling PRLR isoform expression in mice. Biology of Reproduction. 79 (4), 748-757 (2008).
  15. Alwosaibai, K., et al. PAX2 maintains the differentiation of mouse oviductal epithelium and inhibits the transition to a stem cell-like state. Oncotarget. 8 (44), 76881-76897 (2017).
  16. Peri, L. E., et al. A novel class of interstitial cells in the mouse and monkey female reproductive tracts. Biology of Reproduction. 92 (4), 102(2015).
  17. Lõhmussaar, K., et al. Assessing the origin of high-grade serous ovarian cancer using CRISPR-modification of mouse organoids. Nature Communications. 11 (1), 2660(2020).
  18. Chen, S., et al. An air-liquid interphase approach for modeling the early embryo-maternal contact zone. Scientific Reports. 7, 42298(2017).
  19. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2565(2010).
  20. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3(2006).
  21. McGlade, E. A., et al. Cell-type specific analysis of physiological action of estrogen in mouse oviducts. The FASEB Journal. 35 (5), 21563(2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Microdissectie van de eileiderweefseldissociatieflowcytometrieRNA sequencingepithelcelleneileidersegmentenreverse transcriptie PCR

Gerelateerde artikelen