Orgaankweeksysteem voor de beoordeling van de toxiciteit van hulpstoffen en geneesmiddelen voor intraoculaire behandeling

Samenvatting

Het doel van dit protocol is het evalueren van veranderingen in metabole activiteit en brekingsfunctie van de lens als reactie op experimentele behandeling.

Samenvatting

Als de belangrijkste oorzaak van blindheid is staar een aanzienlijke last voor de tientallen miljoenen mensen die wereldwijd door deze aandoening worden getroffen. Blootstelling aan chemicaliën, naast andere omgevingsfactoren, is een gevestigde oorzaak van staar. Oculaire toxiciteitstesten kunnen beoordelen of geneesmiddelen en hun componenten kunnen bijdragen aan lensbeschadiging die kan leiden tot staar of kunnen helpen bij de behandeling van staar.

In-vitrostudies en in-vivodierproeven kunnen worden gebruikt om de veiligheid van chemische stoffen te beoordelen voorafgaand aan klinische studies. De Draize-test - de huidige in vivo standaard voor het testen van oculaire toxiciteit en irritatie - is bekritiseerd vanwege een gebrek aan gevoeligheid en objectieve metingen voor het bepalen van oculaire toxiciteit. In vitro celgebaseerde assays zijn beperkt omdat celculturen een intacte functionele lens niet op de juiste manier kunnen modelleren.

De hier beschreven methode is een gevoelig in vitro alternatief voor dierproeven, ontworpen om de respons van de intacte runderlens op behandeling te evalueren, zowel op cellulair activiteitsniveau als op de algehele brekingsprestaties. Het niet-toxische reagens resazurine wordt gemetaboliseerd in verhouding tot het niveau van celactiviteit. De laserscannertest van de lens meet het vermogen van de lens om invallende lichtbundels met minimale fouten naar één punt te breken, wat direct relevant is voor de natuurlijke functie ervan. De methode kan worden gebruikt om zowel acute als vertraagde veranderingen in de lens te bepalen, evenals het herstel van de lens van chemische of omgevingsblootstellingen.

Inleiding

Staar treft meer dan 20 miljoen mensen en is wereldwijd de meest voorkomende oorzaak van blindheid ^1,2. Staar is meestal te wijten aan leeftijdsgebonden veranderingen in de lens, maar wordt ook veroorzaakt door trauma, genetische aandoeningen, ziekte of toxische blootstelling². Momenteel omvat de behandeling een chirurgische ingreep om de lens te vervangen, een dure en invasieve procedure die vooral toegankelijk is voor mensen in ontwikkelde landen. De uitgebreide last van cataract heeft tientallen jaren van onderzoek gericht op staarpreventie en de ontwikkeling van niet-chirurgische behandelingen. In beide gevallen is het belang van preklinische tests op toxiciteit, werkzaamheid en farmacokinetiek van oogheelkundige geneesmiddelen van het grootste belang. Dit proces van medicijnontwikkeling is sterk afhankelijk van de informatie die wordt verstrekt door onderzoeken bij dieren.

De huidige standaard voor oculaire toxiciteitstesten in vivo is de Draize-test, waarbij een teststof in de bindbindende zak van een levend dier wordt toegediend. De test is aanzienlijk bekritiseerd, met name met betrekking tot dierethiek, subjectiviteit, slechte herhaalbaarheid en variabiliteit³. Bovendien is er geen onderdeel van de Draize-test dat de effecten van teststoffen op de lens direct monitort. Er is veel energie gestoken in de ontwikkeling van alternatieve in-vitromodellen ⁴. Geen enkele is echter voldoende gevalideerd om de Draize-test⁵ te vervangen. Evenzo hebben veel van deze modellen te maken met beperkingen met betrekking tot de directe toepassing op staar en andere complexe pathologieën⁶. Methoden die de transparantie van lenzen beoordelen wanneer ze over een raster worden geplaatst, zijn bijvoorbeeld inherent subjectief⁷. Celkweekstudies zijn betrouwbaar en worden veel gebruikt, hoewel de kenmerken van de celmonolaag kunnen afwijken van die van de primaire weefselkweek⁸.

Hele lenzen kunnen uit de ogen van dieren worden ontleed en gekweekt om hun oorspronkelijke structuur en functie te behouden. Een test die nuttig is voor het beoordelen van de lensfunctie met behoud van de conditie van het orgaan, is de lenslaserscannertest met een scanner die is ontwikkeld aan de Universiteit van Waterloo in Canada. De test is een scansysteem dat een reeks laserprojecties gebruikt om de optische kwaliteit of brekingsprestaties van de lens te meten. Lenzen worden gescand in hun op maat gemaakte kweekkamers met twee segmenten, waardoor stralen van onderaf door de lens kunnen gaan (Figuur 1A). Een camera die in de scanner is bevestigd, legt het beeld vast van de laser die op verschillende punten door de lens gaat. De scannersoftware berekent de afstand achter de lens waarop deze een centrale as kruist (back vertex distance, BVD), waardoor een reeks metingen wordt geproduceerd die aangeven hoe consistent de lens het licht focust op een enkel punt (Figuur 1).

De cellulaire eigenschappen van de lens, zoals de strakke en geordende opstelling van de cellen, helpen de transparantie te behouden en verstrooiing te minimaliseren, zodat de lens licht functioneel kan focussen⁹. Deze maat kan worden gebruikt om te interpreteren hoe aanzienlijk een chemische stof de essentiële structuur van de lens verstoort, zoals de gradiëntbrekingsindex, en hoeveel functie wordt aangetast door de geïnduceerde opaciteit. Andere studies die de respons van gekweekte lenzen en lensblaasjes hebben gevolgd, suggereren dat lichtverstrooiing een product is van structurele veranderingen, in vergelijking met metabole veranderingen, en dat verstoringen van lenslipiden en -eiwitten de brekingsindex kunnen beïnvloeden en bijgevolg de verstrooiing kunnen vergroten^10,11.

De lenslaserscanner kan worden gebruikt in combinatie met metabole reagentia in tests om biochemische metingen van celtoxiciteit te bepalen. Resazurine is een niet-toxisch chemisch reagens dat door actieve cellen wordt gemetaboliseerd en een gereduceerd product (resorufin produceert) met een meetbare fluorescentie¹². De lens is grotendeels verstoken van organellen, behalve de metabolisch actieve mitochondriën geconcentreerd in het voorste epitheel en de oppervlakkige corticale vezelcellen, die voldoen aan de energiebehoeften van de lens^13,14. Schade aan de lens op cellulair niveau kan het metabolisme verstoren en gaat vaak vooraf aan het begin van pathogene structurele veranderingen en cataract¹⁵.

Het doel van deze methode is het evalueren van het effect van xenobiotische blootstelling en blootstelling aan het milieu op de lens, die kunnen bijdragen aan de ontwikkeling van staar. Het protocol omvat twee testen om het effect van een behandeling met behulp van de gekweekte runderlens te evalueren. Het voordeel van deze aanpak is dat het zowel een cellulaire als functionele evaluatie biedt van hoe de lens als primair weefsel op de behandeling reageert. Het is een gevoelige en objectieve evaluatie van de lens in vergelijking met andere gangbare methoden 16,17,18.

Het model is met succes gebruikt om de effecten van verschillende blootstellingen te evalueren, waaronder oppervlakteactieve stoffen, consumentenproducten, alcoholen en ultraviolette straling 17,19,20. Veranderingen in optische kwaliteit zijn consequent aanwezig in gekweekte lenzen als reactie op blootstelling aan giftige stoffen²¹. Het vermogen van deze methode om een lenscultuur op lange termijn te behouden, is zeer geschikt voor het monitoren van het mogelijk vertraagde effect van een verbinding en het herstel van de lens van geïnduceerde schade of cataract^22,23. De resultaten van de toepassing van dit protocol kunnen worden gebruikt om de afhankelijkheid van dierproeven bij de ontwikkeling van oogheelkundige producten te verminderen.

Protocol

Alle experimentele protocollen werden uitgevoerd in overeenstemming met het ethische beleid van de Universiteit van Waterloo voor onderzoek met dierlijk weefsel. De runderogen voor de huidige studie werden door een slachthuis verstrekt, verkregen van niet-melkkoeien binnen een paar uur na de dood, en werden onmiddellijk ontleed, een proces dat tot 8 uur duurt vanaf het verkrijgen van de ogen. Ogen moeten onmiddellijk worden ontleed om de steriliteit en dissectiekwaliteit te behouden. Het kweekmedium wordt bereid tot een pH van 7,4 en steriel gefilterd voorafgaand aan suppletie met FBS²¹. Alle procedures worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden, waarbij de materiaal- en apparatuurbronnen worden vermeld in de materiaaltabel.

1. Runderlenscultuur

1. Ontleed lenzen door extraoculaire spieren en weefsel uit de sclera te verwijderen, de achterste helft van de bol en het glasvocht te verwijderen, de iris en het ciliaire lichaam samen met de lens te verwijderen en vervolgens de zonulaire hulpstukken weg te snijden, met de uiteindelijke snede zo geplaatst dat de lens in de met medium gevulde kweekkamer valt.
2. Kweek de ontlede lenzen in op maat gemaakte kamers met een basis die is aangepast aan het laserscansysteem, met 21 ml steriel gefilterd medium, bij 37 °C en 5% CO₂ . Gebruik 3% foetaal runderserum (FBS)-aangevuld met kweekmedium met 1% penicilline-streptomycine, 9,4 g/L M-199, 0,1 g/L L-glutamine, 5,96 g/L HEPES, 2,2 g/L natriumbicarbonaat en 7 ml/L NaOH. Bewaar ongebruikt kweekmedium maximaal 7 dagen in de koelkast.
3. Vervang het kweekmedium elke 1-2 dagen. Verwarm het kweekmedium voor gebruik een uur op 37 °C. Gebruik een met afzuiging verbonden steriele pasteurpipet om het medium uit een individuele kweekkamer op te zuigen en vul het onmiddellijk aan met het gesupplementeerde medium.
4. Kweek de lenzen gedurende 48 uur na dissectie om de fysieke schade te laten manifesteren. Inspecteer en scan de lenzen op optische kwaliteit volgens sectie 4 voordat u ze in een experiment opneemt.
   OPMERKING: De lenzen zijn naar beneden gericht ter voorbereiding op de laserscannertest.

2. Controle procedure

1. Bereid een oplossing voor met de gewenste concentratie van een oplosmiddel dat compatibel is met de chemische verbinding en het kweekmedium.
2. Bereid een oplossing voor de voertuigbesturing voor door het oplosmiddel toe te voegen aan het aangevulde medium. Verwarm de controlevloeistof een uur bij 37 °C voordat u gaat experimenteren.
3. Gebruik een pasteurpipet die is aangesloten op afzuiging om het kweekmedium uit de controlelenskamers op te zuigen. Vul de kamers aan met de controlevloeistof. Voer deze stap indien nodig uit met monsters in drievoud.
   OPMERKING: Er is een minimumvolume van 7 ml nodig om de lens volledig te bedekken in de voorste positie met de voorkant naar boven. De voorwaarden voor controles in de huidige studie waren 21 ml controle van onbehandeld medium, 21 ml van een mediumcontrolemedium en 7 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
4. Kweek de lenzen gedurende 2 dagen in het controlemedium en vervang ze vervolgens door een nieuw controlemedium volgens rubriek 1. Zuig bij kortdurende blootstelling de controlevloeistof uit de kamers op en spoel ten minste driemaal met niet-aangevuld kweekmedium voordat u het lenskweekprotocol hervat zoals beschreven in rubriek 1.0.
5. Laat de lenzen in de couveuse minimaal 3,5 uur acclimatiseren bij 37 °C en 5% CO₂ voordat u de optische kwaliteit beoordeelt.

3. Procedure voor blootstelling

1. Bereid een oplossing voor met de gewenste concentratie van een oplosmiddel dat compatibel is met de chemische verbinding en het kweekmedium. Combineer de chemische stof met het oplosmiddel en laat indien nodig de juiste tijd voor interactie.
   OPMERKING: 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrine werd in de huidige studie gebruikt om de oplosbaarheid van lanosterol (0,033 g/L) in medium te verbeteren. Benzalkoniumchloride (BAK 0,0075%) oplossing werd bereid met behulp van PBS.
2. Voeg de opgeloste chemische stof toe aan het kweekmedium. Bereid een totaal volume voor dat voldoende is om 21 ml medium te leveren aan alle lensmonsters. Verwarm het experimentele medium een uur op 37 °C voordat u gaat experimenteren.
3. Gebruik een pasteurpipet die is aangesloten op afzuiging om het kweekmedium uit de lenskamers op te zuigen. Vul de kamers onmiddellijk aan met de testoplossing. Vervang na het blootstellingsinterval door aangevuld kweekmedium en spoel indien nodig eerst uit. Voer deze stap indien nodig uit met monsters in drievoud.
   OPMERKING: In de huidige studie waren de testomstandigheden 21 ml met lanosterol aangevuld medium en 7 ml van een BAK 0,0075% oplossing. Een minimum volume van 7 ml is vereist om de lens volledig te bedekken. In dit geval moeten de lenzen eerst naar voren gericht zijn. Een pasteurpipet kan worden gebruikt om een stroom in de kweekkamer te creëren met een deel van het omringende kweekmedium om de lens te herpositioneren.
4. Breng de lenzen ten minste 3,5 uur terug in de couveuse om te acclimatiseren voordat u de optische kwaliteit beoordeelt.
   OPMERKING: De lenzen zijn naar beneden gericht ter voorbereiding op de laserscannertest.

4. Optische kwaliteitstest (lenslaserscanner)

1. Zorg ervoor dat de lenzen met de voorste kant naar beneden en visueel waterpas in de kweekkamer zijn gericht, met behulp van de techniek uit stap 3.3 om de positie van de lens indien nodig aan te passen.
   OPMERKING: Deze positie zorgt ervoor dat de invallende straal door de bodem van de kamer wordt gereflecteerd en door de lens van het voorste naar het achterste oppervlak gaat.
2. Plaats een lenskweekkamer zo in de laserscanner dat de sledepen van de kamer in de gleuf in de kamerbasis past.
3. Selecteer de lens en het scanpunt waarvoor u een scan wilt uitvoeren, klik met de rechtermuisknop op de scanlens en wacht tot de scanner vraagt om de straal te vinden en uit te lijnen. Selecteer goed gelegen begin- en eindpunten voor de straal achter de lens. Zorg ervoor dat de centrale balk is uitgelijnd met behulp van de knoppen voor grove en fijne afstelling in de scannersoftware en de instelknop op de scanner. Wanneer de ligger is uitgelijnd, klikt u op kalibreren en voert u een passende selectie van radiale stappen en straalscheiding in.
   OPMERKING: Voor dit onderzoek met de runderlens werden de instellingen voor radiale stappen en straalscheiding ingesteld op respectievelijk 10 stappen en 0,5 mm. De eerste scan die de scanner uitvoert dient om de laserscanner te kalibreren. Dit is één keer nodig en alle extra lensscans kunnen direct na het uitlijnen worden uitgevoerd.
4. Nadat de scanner is gekalibreerd, klikt u op scannen. Wacht tot er waarden zijn gegenereerd voor BVD-gemiddelde, standaarddeviatie en fout langs één as nadat de lensscan is voltooid en het bereik van de straal is ingesteld. Stel de scoop in vanaf het punt waar de stralen de lens verlaten tot het gewenste eindpunt, selecteer de maximale afstand achter de lens en sluit elke schijnbare interferentie uit.
5. Gebruik de gegenereerde grafiek om de individuele afstanden van het achterste hoekpunt voor elke ligger te bekijken.
   OPMERKING: Sluit stralen uit die door lenshechtingen gaan. Als u een balk wilt uitsluiten, gebruikt u de legenda op het scherm om met de rechtermuisknop op een afzonderlijke balk te klikken en selecteert u uitsluiten.
6. Draai de positie van de basis van de kweekkamer in de scanner handmatig 90°, zodat de tweede scan langs het oppervlak van de voorste lens loodrecht op de vorige scan staat. Zorg ervoor dat de centrale straal is uitgelijnd zoals beschreven in stap 4.3 en scan vervolgens de lens.

5. Metabole activiteitstest (resazurine)

1. Bereid het medium voor zonder FBS. Verwarm het medium een uur op 37 °C. Bereid 50 ml 8% resazurinereagens in een niet-aangevuld medium.
   OPMERKING: Het is voldoende om 50 ml voor te bereiden om alle putjes in een plaat met 12 putjes te vullen. De oplossing moet steriel worden bereid onder schemerige omstandigheden in een ondoorzichtige container, aangezien resazurine lichtgevoelig is.
2. Voeg 3,8 ml 8% resazurineoplossing toe aan elk putje in een steriele plaat met 12 putjes met heldere bodem om de lens te bedekken.
3. Gebruik steriele metalen schepjes om de lenzen voorzichtig onder het achterste oppervlak vandaan te tillen en spoel met een pasteurpipet om de lens te wassen met een kleine hoeveelheid niet-aangevuld kweekmedium. Plaats de lenzen afzonderlijk in elk vakje.
4. Incubeer de putplaat gedurende 5 uur bij 37 °C en 5% CO₂ . Haal na de incubatie de lenzen met metalen schepjes uit de putjes en plaats ze in een afvalcontainer. Breng een monster van 100 μl uit elk putje over in een steriele plaat met 96 putjes met een doorzichtige bodem.
   OPMERKING: Lenzen kunnen meerdere keren worden beoordeeld met de metabolische activiteitstest. Breng in dit geval de lenzen terug naar de kweekkamers met vers medium voor incubatie. De metabole activiteitstest kan het beste worden uitgevoerd zodra alle scans zijn voltooid, omdat de kleurstof de BVD-metingen kan beïnvloeden.
5. Meet de eindpuntfluorescentie van de 100 μL-monsters met behulp van een fluorescerende plaatlezer, waarbij de excitatie- en emissiegolflengten zijn ingesteld op respectievelijk 560 nm en 590 nm.

6. Gegevensanalyse

1. Bereken voor de optische kwaliteitstest het gemiddelde van de door de software berekende waarden voor BVD-fout²⁴ op basis van de twee scans die op elk tijdstip zijn uitgevoerd. Voer deze berekening uit voor alle lenzen en alle scanpoints.
2. Verzamel voor de metabolische activiteitstest de relatieve fluorescentiewaarden van het eindpunt die door de plaatlezer worden gegenereerd. Normaliseer de gegevens door het gemiddelde van alle controlewaarden op een scanpoint in te stellen op 100%. Bereken de activiteit van elke lens als percentage van de gemiddelde controlewaarde voor dat scanpoint.
3. Voer een normaliteitstest uit voor alle experimentgroepen. Ervan uitgaande dat de gegevens normaal zijn, analyseert u de BVD-foutverschillen tussen controle- en experimentele lenzen met behulp van de tweerichtings-ANOVA. Voer bovendien Tukey's post-hoc meervoudige vergelijkingstest uit. Voer een eenrichtings-ANOVA en de post-hoctest van Dunnett uit voor de gegevens over de metabole activiteit.

Resultaten

Figuur 2 en figuur 3 (n = 6) tonen de resultaten van een onderzoek naar het effect van een chemische behandeling (lanosterol) op de runderlens. Lanosterol is een van nature voorkomende sterol in de lens die ooit veelbelovende resultaten liet zien als een mogelijke farmaceutische interventie voor cataract²⁵, hoewel dit nog moet worden bewezen²⁶. De onderzoeksopzet omvatte een medium...

Discussie

Het doel van dit protocol is om de effecten van chemicaliën of blootstelling aan het milieu op de lens in primaire weefselkweek direct te evalueren. Eerst worden lenzen ontleed en gescand op optische kwaliteit. Het voorkomen van besmetting en het waarborgen van de kwaliteit van de dissectie zijn van cruciaal belang. Lenzen worden met periodieke tussenpozen gescand om continu veranderingen in de brekingsfunctie te controleren met betrekking tot de controlegroep of de toestand vóór de bloo...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
(2-Hydroxypropyl)-β-cyclodextrin	Sigma-Aldrich	H107	Poeder
1 L bottle-top filtratiesysteem	VWR	97066-204	Volledige montage, bovenkant fles, 0,2 μm
100 mm Petri-schaal	VWR	89022-320	Slipbaar, mediabesparende stijl, steriel
12 welplaat	Corning	353043	Steriel, heldere bodem
35 mm petrischaal	VWR	25373-041	Falcon wegwerp-petrischalen, steriele, Corning
96 welplaat	VWR	29442-072	Steriel, heldere bodem
Alamar blue (resazurin)	Fischer Scientific	DAL1100	Molecuul sondevitabiliteitsreagens
Benzalkoniumchloride-oplossing	Sigma-Aldrich	63249	50% in H20
Bioveiligheidskast
Cytation 5 plaatlezer	BioTek	CYT5MPV	Multi-moduscelbeeldlezer
Foetaal runderserum	ThermoFischer Scientific	12484028	Gekwalificeerd, hitte-geïnactiveerd, Canada
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Voor celcultuur, poeder
Incubator
Lanosterol	Sigma-Aldrich	L5768	≥93%, poeder
L-glutamine	Sigma-Aldrich		Voor celcultuur, poeder
Medium (M-199)	Sigma-Aldrich	M3769	Gemodificeerd, met Earle′s zouten, zonder L-glutamine, natriumbicarbonaat en fenolrood, poeder, geschikt voor celcultuur
Pasteurpipetten			5 3/4'', met en zonder katoen
Penicilline-Streptomycine	ThermoFischer Scientific	15140122	Vloeibaar (10.000 U/mL)
Fosfaatbufferoplossing (PBS)			Vloeibaar, sterieel, geschikt voor celcultuur
Pipetpunten (100 µL, 1.000 µL, 5.000 µL)	VWR		Sterieel
ScanTox (lens laser-scanner)	Speciaal ontwikkeld in eigen beheer	N/A	Scant lens met een laser om de optische kwaliteit van de lens te bepalen
ScanTox cultuurkamer	Speciaal ontwikkeld in eigen beheer	N/A	Houdt runderlens op zijn plaats tijdens testen en cultiveren
Natriumbicarbonaat	Sigma-Aldrich	S5761	Voor celcultuur, poeder
Natriumhydroxide	Sigma-Aldrich	S2770	1,0 N, BioReagent, geschikt voor celcultuur