Orgaankweeksysteem voor de beoordeling van de toxiciteit van hulpstoffen en geneesmiddelen voor intraoculaire behandeling

Samenvatting

Het doel van dit protocol is het evalueren van veranderingen in metabole activiteit en brekingsfunctie van de lens als reactie op experimentele behandeling.

Samenvatting

Als de belangrijkste oorzaak van blindheid is staar een aanzienlijke last voor de tientallen miljoenen mensen die wereldwijd door deze aandoening worden getroffen. Blootstelling aan chemicaliën, naast andere omgevingsfactoren, is een gevestigde oorzaak van staar. Oculaire toxiciteitstesten kunnen beoordelen of geneesmiddelen en hun componenten kunnen bijdragen aan lensbeschadiging die kan leiden tot staar of kunnen helpen bij de behandeling van staar.

In-vitrostudies en in-vivodierproeven kunnen worden gebruikt om de veiligheid van chemische stoffen te beoordelen voorafgaand aan klinische studies. De Draize-test - de huidige in vivo standaard voor het testen van oculaire toxiciteit en irritatie - is bekritiseerd vanwege een gebrek aan gevoeligheid en objectieve metingen voor het bepalen van oculaire toxiciteit. In vitro celgebaseerde assays zijn beperkt omdat celculturen een intacte functionele lens niet op de juiste manier kunnen modelleren.

De hier beschreven methode is een gevoelig in vitro alternatief voor dierproeven, ontworpen om de respons van de intacte runderlens op behandeling te evalueren, zowel op cellulair activiteitsniveau als op de algehele brekingsprestaties. Het niet-toxische reagens resazurine wordt gemetaboliseerd in verhouding tot het niveau van celactiviteit. De laserscannertest van de lens meet het vermogen van de lens om invallende lichtbundels met minimale fouten naar één punt te breken, wat direct relevant is voor de natuurlijke functie ervan. De methode kan worden gebruikt om zowel acute als vertraagde veranderingen in de lens te bepalen, evenals het herstel van de lens van chemische of omgevingsblootstellingen.

Inleiding

Staar treft meer dan 20 miljoen mensen en is wereldwijd de meest voorkomende oorzaak van blindheid ^1,2. Staar is meestal te wijten aan leeftijdsgebonden veranderingen in de lens, maar wordt ook veroorzaakt door trauma, genetische aandoeningen, ziekte of toxische blootstelling². Momenteel omvat de behandeling een chirurgische ingreep om de lens te vervangen, een dure en invasieve procedure die vooral toegankelijk is voor mensen in ontwikkelde landen. De uitgebreide last van cataract heeft tientallen jaren van onderzoek gericht op staarpreventie en de ont....

Protocol

Alle experimentele protocollen werden uitgevoerd in overeenstemming met het ethische beleid van de Universiteit van Waterloo voor onderzoek met dierlijk weefsel. De runderogen voor de huidige studie werden door een slachthuis verstrekt, verkregen van niet-melkkoeien binnen een paar uur na de dood, en werden onmiddellijk ontleed, een proces dat tot 8 uur duurt vanaf het verkrijgen van de ogen. Ogen moeten onmiddellijk worden ontleed om de steriliteit en dissectiekwaliteit te behouden. Het kweekmedium wordt bereid tot een pH van 7,4 en steriel gefilterd voorafgaand aan suppletie met FBS²¹. Alle procedures worden ....

Resultaten

Figuur 2 en figuur 3 (n = 6) tonen de resultaten van een onderzoek naar het effect van een chemische behandeling (lanosterol) op de runderlens. Lanosterol is een van nature voorkomende sterol in de lens die ooit veelbelovende resultaten liet zien als een mogelijke farmaceutische interventie voor cataract²⁵, hoewel dit nog moet worden bewezen²⁶. De onderzoeksopzet omvatte een medium.......

Discussie

Het doel van dit protocol is om de effecten van chemicaliën of blootstelling aan het milieu op de lens in primaire weefselkweek direct te evalueren. Eerst worden lenzen ontleed en gescand op optische kwaliteit. Het voorkomen van besmetting en het waarborgen van de kwaliteit van de dissectie zijn van cruciaal belang. Lenzen worden met periodieke tussenpozen gescand om continu veranderingen in de brekingsfunctie te controleren met betrekking tot de controlegroep of de toestand vóór de bloo.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
(2-Hydroxypropyl)-β-cyclodextrin	Sigma-Aldrich	H107	Poeder
1 L bottle-top filtratiesysteem	VWR	97066-204	Volledige montage, bovenkant fles, 0,2 μm
100 mm Petri-schaal	VWR	89022-320	Slipbaar, mediabesparende stijl, steriel
12 welplaat	Corning	353043	Steriel, heldere bodem
35 mm petrischaal	VWR	25373-041	Falcon wegwerp-petrischalen, steriele, Corning
96 welplaat	VWR	29442-072	Steriel, heldere bodem
Alamar blue (resazurin)	Fischer Scientific	DAL1100	Molecuul sondevitabiliteitsreagens
Benzalkoniumchloride-oplossing	Sigma-Aldrich	63249	50% in H20
Bioveiligheidskast
Cytation 5 plaatlezer	BioTek	CYT5MPV	Multi-moduscelbeeldlezer
Foetaal runderserum	ThermoFischer Scientific	12484028	Gekwalificeerd, hitte-geïnactiveerd, Canada
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Voor celcultuur, poeder
Incubator
Lanosterol	Sigma-Aldrich	L5768	≥93%, poeder
L-glutamine	Sigma-Aldrich		Voor celcultuur, poeder
Medium (M-199)	Sigma-Aldrich	M3769	Gemodificeerd, met Earle′s zouten, zonder L-glutamine, natriumbicarbonaat en fenolrood, poeder, geschikt voor celcultuur
Pasteurpipetten			5 3/4'', met en zonder katoen
Penicilline-Streptomycine	ThermoFischer Scientific	15140122	Vloeibaar (10.000 U/mL)
Fosfaatbufferoplossing (PBS)			Vloeibaar, sterieel, geschikt voor celcultuur
Pipetpunten (100 µL, 1.000 µL, 5.000 µL)	VWR		Sterieel
ScanTox (lens laser-scanner)	Speciaal ontwikkeld in eigen beheer	N/A	Scant lens met een laser om de optische kwaliteit van de lens te bepalen
ScanTox cultuurkamer	Speciaal ontwikkeld in eigen beheer	N/A	Houdt runderlens op zijn plaats tijdens testen en cultiveren
Natriumbicarbonaat	Sigma-Aldrich	S5761	Voor celcultuur, poeder
Natriumhydroxide	Sigma-Aldrich	S2770	1,0 N, BioReagent, geschikt voor celcultuur