Methodenartikel

Stimuleren en analyseren van volwassen neurogenese in de drosophila centrale hersenen

6.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63182

⸱

8 oktober 2021

 ,  , 
1Genetics Graduate Training Program, University of Wisconsin-Madison, School of Medicine and Public Health, 2Science and Medicine Graduate Research Scholars Program, University of Wisconsin-Madison, School of Medicine and Public Health, 3Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, School of Medicine and Public Health

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel biedt gedetailleerde protocollen voor het toebrengen van penetrerend traumatisch hersenletsel (PTBI) aan volwassen Drosophila en het onderzoeken van de resulterende neurogenese.

Samenvatting

De moleculaire en cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan neurogenese als reactie op ziekte of letsel zijn niet goed begrepen. Het begrijpen van deze mechanismen is echter cruciaal voor het ontwikkelen van neurale regeneratieve therapieën. Drosophila melanogaster is een toonaangevend model voor studies van neurale ontwikkeling, maar is historisch gezien niet gebruikt om regeneratie van volwassen hersenen te onderzoeken. Dit komt voornamelijk omdat de volwassen hersenen een zeer lage mitotische activiteit vertonen. Niettemin veroorzaakt doordringend traumatisch hersenletsel (PTBI) in het centrale brein van drosophila de vorming van nieuwe neuronen en nieuwe glia. De krachtige genetische hulpmiddelen die beschikbaar zijn in Drosophila in combinatie met het eenvoudige maar rigoureuze letselprotocol dat hier wordt beschreven, maken volwassen Drosophila-hersenen nu een robuust model voor neuraal regeneratieonderzoek. Hier worden gedetailleerde instructies gegeven voor (1) penetrerende verwondingen aan de centrale hersenen van volwassenen en (2) dissectie, immunohistochemie en beeldvorming na letsel. Deze protocollen leveren zeer reproduceerbare resultaten op en zullen aanvullende studies vergemakkelijken om mechanismen te ontleden die ten grondslag liggen aan neurale regeneratie.

Inleiding

Schade aan de hersenen en het zenuwstelsel is wereldwijd een belangrijke doodsoorzaak en invaliditeit. Ongeveer 1,5 miljoen Amerikanen lijden elk jaar aan traumatisch hersenletsel (TBI)1, terwijl naar schatting 6 miljoen mensen in de Verenigde Staten alleen al lijden aan neurodegeneratieve ziekten, zoals de ziekte van Parkinson en alzheimer2. Zowel ziekte als letsel aan de hersenen kunnen neurale degeneratie veroorzaken, wat leidt tot sensorische, cognitieve en motorische defecten3. Het ontwikkelen van therapeutische strategieën voor het herstel van de menselijke hersenen is moeilijk geweest vanwege de complexe fysiologie van de hersenen. Modelorganismen zoals Drosophila melanogaster bieden een eenvoudig systeem voor het identificeren van de fundamentele mechanismen die ten grondslag liggen aan neurodegeneratie en potentiële therapeutische doelen4.

De fruitvlieg Drosophila melanogaster is al meer dan een eeuw een krachtig modelorganisme, dat de gebieden van genetica, ontwikkelingsbiologie en neurowetenschappen bevordert5,6. Het Drosophila-brein bestaat uit slechts ~ 90.000 neuronen7, een miljoen keer minder dan het gemiddelde menselijke brein8, maar ze hebben veel overeenkomsten. Zowel menselijke als vliegenhersenen maken gebruik van de neurotransmitters GABA, glutamaat, acetylcholine en de biogene aminen dopamine en serotonine9. Drosophila en menselijke neuronen functioneren ook op dezelfde manier, met een gedeelde synaptische architectuur en analoge neurale celtypen10. De kleinere hersengrootte van Drosophila en de beschikbaarheid van geavanceerde geneticatechnieken, in combinatie met het behoud van moleculaire, cellulaire en fysiologische mechanismen tussen Drosophila en zoogdieren, stelt Drosophila-onderzoekers in staat om vragen te stellen die onpraktisch of moeilijk te beantwoorden zijn in zoogdiermodellen.

Ons huidige begrip van volwassen neurogenese bij Drosophila, zowel tijdens homeostase als na letsel, blijft beperkt. Er is meer bekend over neurogenese tijdens de normale ontwikkeling. Neuronen en glia worden bijvoorbeeld tijdens de ontwikkeling gemaakt uit voorlopercellen, neuroblasten10,11 genoemd. Ten minste drie verschillende soorten neuroblasten zijn onderscheiden in de centrale hersenen. Zowel type I als type II lineage neuroblasten verlaten de celcyclus ~ 20-30 uur na pupariumvorming12. Daarentegen zijn de neuroblasten van het paddenstoellichaam de laatste die de celdeling beëindigen en doen dit via Reaper-afhankelijke apoptose ~ 85-90 h na pupariumvorming13. Na eclosie heeft het volwassen Drosophila-brein weinig delende cellen (~ 1 cel / hersenen), voornamelijk glia14. De volwassen optische kwabben bezitten langzaam fietsende neuroblasten die in staat zijn tot neurogenese15, terwijl de volwassen centrale hersenen geen bekende neuroblasten hebben. De schaarste aan neurale voorlopers en beperkte celproliferatie lijkt sterk op de situatie in het volwassen zoogdierbrein, wat de potentiële relevantie van de mechanismen van volwassen neurogenese in Drosophila voor mensen onderstreept.

De ontdekking van lage niveaus van volwassen neurogenese in de volwassen Drosophila-ooglobben na letsel15 leidde tot de hypothese dat de volwassen Drosophila centrale hersenen ook in staat zouden kunnen zijn tot volwassen neurogenese16. Dit protocol beschrijft het creëren van een rigoureus, reproduceerbaar model van centraal hersenletsel bij volwassen Drosophila dat kan worden gebruikt om neurogenese in het centrale brein van volwassenen te onderzoeken. Gezien de overeenkomsten tussen menselijke en Drosophila hersenarchitectuur en -functie, kunnen deze ontdekkingen leiden tot de identificatie van kritieke doelen voor therapeutische neurogenese in gewonde en zieke menselijke hersenen.

Protocol

Dit protocol volgt de dierenverzorgingsrichtlijnen van UW-Madison.

1. Het genereren van volwassen Drosophila voor PTBI

  1. Plaats voor het standaardkruis 20 maagdelijke y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP;; OK107-GAL417 volwassen vrouwtjes en 10 y[1] w[1]17 volwassen mannetje vliegen samen in flacons (zie Materiaaltabel) die voedsel bevatten. Om grote aantallen synchrone nakomelingen te hebben, moet u tegelijkertijd 10-20 kruisingen opzetten. Het standaardkruis geeft aanleiding tot F1-nakomelingen van het genotype: y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP/+;; OK107-GAL4/+.
    1. Plaats de injectieflacons op 25 °C voor paring en het leggen van eieren. Om het nageslacht te maximaliseren, brengt u de ouders om de 2-4 dagen over in nieuwe injectieflacons, waarbij de eerdere injectieflacons op 25 °C worden gehouden. Gooi elke injectieflacon 18 dagen nadat de ouders er voor het eerst in werden geplaatst weg om ervoor te zorgen dat er geen F2-nakomelingen zijn.
      OPMERKING: 3 sets nakomelingen ("broedsels") kunnen worden gegenereerd uit elke set ouders.
    2. Controleer na ~ 10 dagen wanneer het F1-nageslacht begint te eclose.
  2. Gebruik voor afstammingsstudies F1 perma-twin mannetjes15 van genotype: w; FRT40A, UAS-CD2-RFP, UAS-GFP-Mir/FRT40A, UAS-CD8-GFP, UAS-CD2-Mir; tub-GAL80ts/act-GAL4 UAS-flp. Voor consistentie, doe dit kruis elke keer in dezelfde richting.
    1. Om perma-tweeling mannetjes te genereren, plaats 20 maagd w; FRT40A, UAS-CD2-RFP, UAS-GFP-Mir; tub-GAL80ts/TM6B vrouwtjes en 10 w; FRT40A, UAS-CD8-GFP, UAS-CD2-Mir; act-GAL4 UAS-flp/TM6B15 volwassen mannetjes samen in injectieflacons met voedsel.
    2. Plaats de injectieflacons op 17 °C voor paring en het leggen van eieren. Breng de ouders om de 7 dagen over in injectieflacons met nieuw voedsel en houd alle injectieflacons op 17 °C. Gooi elke injectieflacon 35 dagen nadat de ouders er voor het eerst in werden geplaatst weg om ervoor te zorgen dat er geen F2-nakomelingen zijn.
    3. Controleer na ~ 21 dagen wanneer het F1-nageslacht begint te eclose.

2. Penetrerend traumatisch hersenletsel (PTBI;  Figuur 1)

  1. Sorteer nieuw gesloten F1-vliegen. Selecteer jonge mannetjes binnen 6 uur na eclosie. Plaats deze mannetjes in schone injectieflacons met voedsel, met 40 of minder vliegen per injectieflacon.
    OPMERKING: Dit wordt het gemakkelijkst bereikt in het midden van de ochtend door vliegen op het CO2-pad te verdoven en volwassen mannetjes te identificeren die nog steeds meconium (zichtbaar als een donkergroene vlek door de buikwand) in hun darmen hebben.
  2. Voorvoer met 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) (zie tabel met materialen) gedurende 6 uur vóór de verwonding als u van plan bent om delende cellen met EdU te labelen. Zie stap 3 voor meer informatie.
  3. Ontsmet Minutien-pinnen (zie Materiaaltabel) gedurende ten minste 5 minuten door ~100 pinnen in een microcentrifugebuis van 1,5 ml gevuld met 70% ethanol te plaatsen.
  4. Ontsmet het CO2-kussen en een kwast door 70% ethanol te spuiten en droog af te vegen met een schoon pluisvrij weefsel. Zodra het gereedschap schoon en droog is, breng je 40 of minder gesorteerde F1-mannetjes terug naar de schone pad.
  5. Scheid de F1-mannetjes in 2 groepen op het vliegkussen. Eén groep zal dienen als een controle, ongedeerde vliegen. De tweede experimentele groep zal worden onderworpen aan PTBI.
  6. Trek met een tang 4-5 nieuwe Minutien-pinnen uit de microcentrifugebuis en plaats ze in de buurt van de rand van de CO2-pad . Kies onder de ontleedkijker een rechte Minutien-pin met een scherpe punt.
    OPMERKING: Het gebruik van een enkele Minutien-pin voor een experiment zal de variabiliteit verminderen. Hergebruik scherpe pinnen. Plaats beschadigde of stompe pinnen in een aparte microcentrifugebuis van 1,5 ml met 70% ethanol voor veilige verwijdering.
  7. Als u met vliegen van het standaardkruis werkt, schakelt u de stereomicroscoop lichtgevende diode (LED) lamp in die is uitgerust met de juiste excitatie- en emissiefilters voor groen fluorescentie-eiwit (GFP). Dit maakt excitatie bij 440-460 nM mogelijk en maakt visualisatie van 500-560 nM mogelijk.
    OPMERKING: Met deze lamp en filterset fluoresceren de cellichamen van het paddenstoellichaam groen door de hoofdsnoeken (figuur 1C). Voor perma-tweelingvliegen of vliegen van andere genotypen kan een standaard witlichtverlichting voor de stereomicroscoop worden gebruikt om oriëntatiepunten op de hoofdschubben te visualiseren voor het richten van de verwonding aan het paddenstoellichaam (figuur 1C).
  8. Gebruik de tang om de geselecteerde Minutien-pin in de ene hand op te pakken en vast te houden (voor rechtshandigen is dit meestal de rechterhand) en de verfkwast in de andere (meestal links) hand. Kies een vlieg uit de experimentele groep en plaats de vlieg zo dat je een dorsaal zicht hebt op de hoofdcapsule met het hoofd van de vlieg naar rechts. Plaats de borstel op de voorste van de dorsale thorax en duw zachtjes naar beneden om de vlieg te stabiliseren.
  9. Richt de punt van de Minutien-speld op de cellichamen van het paddenstoellichaam aan de rechterkant van het hoofd en penetreer het hoofdkapsel. Richt bij gebruik van oriëntatiepunten de rugvormige hoofdschubben tussen de ocelli en de dorsale rand van het oog (figuur 1).
  10. Gebruik na het voltooien van de verwonding de kwast om het hoofd voorzichtig van de Minutien-speld te duwen.
  11. Als u de hersenen gebruikt voor RNA-Seq of qRT-PCR, maak dan een tweede verwonding aan de linkerkant van het hoofd.
  12. Herhaal stap 2.8-2.10 om alle vliegen in de experimentele groep te verwonden.
  13. Zodra alle vliegen gewond zijn geraakt, plaatst u de controle- en gewonde vliegen in gelabelde, afzonderlijke injectieflacons met voedsel. Leg de injectieflacons horizontaal (d.w.z. op hun zijkanten) terwijl de vliegen herstellen van de anesthesie en tijdens de daaropvolgende veroudering om te voorkomen dat vliegen in het voedsel verstrikt raken.
  14. Plaats standaard kruisvliegen op 25 °C en perma-tweelingvliegen op 30 °C om te verouderen.
  15. Voor vliegen die langer dan 24 uur oud zijn, plaats ze om de 1-2 dagen op schoon voedsel.

3. EdU-etikettering

  1. Bereid een bouillon van 10 mM 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) in dimethylsulfoxide (DMSO). Dit kan tot 12 maanden bewaard worden bij -20 °C.
  2. Bereid 200 μL van 50 μM EdU in 10% sucrose. Voer vliegen voor met EdU gedurende 6 uur vóór PTBI.
  3. Breng 200 μL van 50 μM EdU in 10% sucrose op een 23 mm rond grade 3 filterpapier (zie Tabel met materialen) in een verder lege injectieflacon.
  4. Plaats de vliegen in de injectieflacon. Sluit vervolgens de injectieflacon af met een wattenstaafje.
  5. Leg de injectieflacon horizontaal in een bevochtigde incubator bij 25 °C gedurende 6 uur.
  6. Voer PTBI uit zoals beschreven in stappen 2.3-2.10.
  7. Plaats de vliegen terug in de EdU-bevattende injectieflacon. Sluit de injectieflacon af met een wattenstaafje.
  8. Leg de injectieflacon horizontaal in een bevochtigde incubator bij 25 °C gedurende maximaal 24 uur. Volg een van de onderstaande stappen (stap 3.8.1-3.8.3).
    1. Ontleed en fixeer hersenen zoals beschreven in stap 4 met behulp van fixatieve, wasbuffer en blokkerende buffer zonder azide en met de EdU-detectiereactie uitgevoerd vóór antilichaamkleuring.
    2. Breng de vliegen over in een schone injectieflacon met een nieuw filtreerpapier en 200 μL 50 μM EdU in 10% sucrose. Leg de injectieflacon horizontaal in een incubator van 25 °C. Herhaal dit elke 24 uur tijdens de duur van de etikettering. Ontleed en fixeer vervolgens de hersenen zoals beschreven in stap 4 met behulp van buffers zonder azide met de EdU-detectiereactie die wordt uitgevoerd vóór antilichaamkleuring.
    3. Om het pulse-chase-label met EdU te pulsen, voer EdU voor de pulsperiode, breng de vliegen elke 24 uur over naar een schone injectieflacon met een nieuw filtreerpapier en 200 μL van 50 μM in 10% sucrose. Breng na de pulsperiode (bijv. 4 dagen) de vliegen over in een injectieflacon met standaard Drosophila-voedsel. Plaats de injectieflacon nog eens 3 dagen op zijn kant in een incubator van 25 °C. Ontleed en fixeer vervolgens de hersenen zoals beschreven in stap 4 met behulp van buffers zonder azide met de EdU-detectiereactie die wordt uitgevoerd vóór antilichaamkleuring.

4. Dissectie, immunohistochemie en montage

  1. Bereid 1,5 ml microcentrifugebuizen met 100 μL fixeermiddel: 4% formaldehyde in PEM (100 mM piperazine-N,N'-bis(2-ethaansulfonzuur) [PIPES], 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, pH 7,0) (zie Materialentabel) en plaats op ijs.
    OPMERKING: Maar liefst 20 hersenen van een enkel genotype en aandoening kunnen in een enkele buis worden verwerkt.
  2. Bereid een dissectieplaat voor met een klein zwembad (~ 100 μL) van 70% ethanol en drie kleine poelen fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS; 100 mM K2HPO4, 140 mM NaCl, pH 7,0).
  3. Anesthetize ~ 10 controle of experimentele vliegen op een CO2-pad dat is ontsmet met 70% ethanol.
  4. Scheid het hoofd van de romp van elke vlieg met behulp van een scalpel.
  5. Verzamel de koppen met een verfkwast bevochtigd met 70% ethanol en plaats de koppen gedurende 2-5 minuten in het ethanolbad op de dissectieplaat.
    OPMERKING: Dit droogt de hersenen enigszins uit en maakt ze gemakkelijker te ontleden van de hoofdsnoepjes.
  6. Breng de hoofden over naar een ~ 100 μL pool van PBS en ontleed de hersenen, waarbij elk brein naar een schone ~ 100 μL pool van PBS beweegt. Voer dit uit met behulp van twee paar Watchmakers-tangen om de achterkant van de hoofdschubben te openen en de nagelriem vast te houden met één paar tangen terwijl je de hersenen voorzichtig uit de cuticula wrikt met behulp van de gesloten punt van het tweede paar tangen.
  7. Breng de ontleedde hersenen over naar een microcentrifugebuis met 100 μL van de fixatieoplossing met behulp van een P200-pipettor uitgerust met een plastic punt die is gesneden en afgeschuind om toegang tot de hersenen mogelijk te maken.
  8. Fixeer gedurende 20-25 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de fix voorzichtig met een P200 of een glazen pipet.
  9. Was de vaste hersenen vier keer met 1 ml 'PT' (PBS plus 0,1% Triton X-100), waardoor de hersenen zich enkele minuten tussen elke wasbeurt kunnen nestelen.
    OPMERKING: Als de hersenen zich niet snel tussen de wasbeurten nestelen, hebben ze waarschijnlijk nog steeds vet lichaam en / of luchtpijp bevestigd.
  10. Blok monsters in 1 ml PBS plus 0,1% Triton X-100 en 2% runderserumalbumine (PBT) gedurende ~ 1 uur bij kamertemperatuur.
  11. Verwijder de blokkerende oplossing en incubeer monsters met 100 μL primaire antilichaamoplossing gedurende de nacht bij 4 °C in PBT. De primaire antilichamen die in deze studie worden gebruikt, zijn konijn anti-PH3 (1:500) en muis anti-Fasiclin II (1:20) (zie Materialen tabel).
  12. Was monsters vijf keer met 1 ml PT, waardoor de hersenen zich enkele minuten tussen elke wasbeurt kunnen nestelen.
  13. Verwijder de laatste was en incubeer in 100 μL secundaire antilichaamoplossing gedurende de nacht bij 4 °C. De secundaire antilichamen die hier worden gebruikt zijn anti-konijn 568 (1:400) en anti-muis Cy5 (1:100) (zie Tabel met materialen).
  14. Was monsters vijf keer met 1 ml PT, waardoor de hersenen zich enkele minuten tussen elke wasbeurt kunnen nestelen. Voeg tijdens de laatste wasbeurt gedurende 10 minuten 4',6-Diamidino-2-Fenylindool, Dihydrochloride (DAPI; 1:100 van een 10 μM-oplossing) toe om de kernen te bevlekken. Verwijder de was en laat 50-100 μL in elke buis.
  15. Bereid microscoopglaasjes voor door een enkel, zelfklevend versterkingslabel op het midden van elke dia te plaatsen en een druppeltje anti-fade montagemedium van 50 μL in het midden van elk etiket (zie Tabel met materialen). Het wapeningslabel houdt de coverslip iets boven de dia's en voorkomt dat de gemonteerde hersenen te plat worden.
  16. Breng de hersenen van elke microcentrifugebuis voorzichtig over naar een voorbereide dia met zo min mogelijk wasbuffer met behulp van een P200 uitgerust met een gesneden en afgeschuinde plastic punt. Maar liefst 10 hersenen kunnen op één dia worden gemonteerd.
  17. Gebruik een tang om de hersenen voorzichtig te verplaatsen voordat u een deklip op elke dia plaatst en de dia afsluit met nagellak. Oriënteer de hersenen met de achterste kant naar boven of de voorste kant naar boven, maar mag elkaar niet aanraken.
    OPMERKING: Omdat het moeilijk is om confocale beelden van hoge kwaliteit te verkrijgen via een heel brein, moeten sommige hersenen in elke oriëntatie worden gemonteerd.
  18. Bewaar voorbereide dia's plat en in het donker bij 4 °C tot de beeldvorming. Voor opslag op langere termijn (tot 1 jaar) kunnen dia's worden bewaard bij -20 °C.

5. Confocale beeldvorming

OPMERKING: Beeld hersenen met behulp van een laserscannende confocale microscoop met excitatielasers en emissiefilterkubussen die geschikt zijn voor DAPI en de fluorescerende secundaire antilichamen (d.w.z. respectievelijk 405 nm, 488 nm en 568 nm, 633 nm).

  1. Schakel de kracht van de microscoop, lasers, controller en computer in.
  2. Open de acquisitiesoftware.
  3. Selecteer in de acquisitiemodus maximaal vier kanalen en stel de parameter in voor het sequentieel scannen van de gewenste kanalen. Verhoog het laservermogen voor elk kanaal tot 5-10%.
  4. Plaats een dia op de microscoop.
  5. Kies een brein dat in beeld moet worden gebracht met behulp van de epifluorescentie-bijlage (zie Tabel met materialen).
  6. Selecteer in de acquisitiemodus 1024 x 1024 pixels als framedimensie.
  7. Selecteer in de acquisitiemodus de optie Z-stack, geef aan dat de Z-stack moet worden genomen op secties van 2 μm en stel scherp door het monster, waarbij u de bovenste en onderste brandpuntsvlakken selecteert die moeten worden afgebeeld.
  8. Verzamel Z-stack beelden van hele hersenen met behulp van een 20x objectief en specifieke hersengebieden zoals het paddenstoellichaam met behulp van een 60x objectief.

6. Data-analyse

  1. Kwantificeer de prolifererende cellen en het aantal perma-twin klonen handmatig en/of met behulp van de beeldanalysesoftware (zie Tabel met materialen). Selecteer bij het gebruik van software interessegebieden (ROI's) met gebieden van ten minste 10 μm.

Resultaten

PTBI stimuleert celproliferatie
Om de mate van neurogenese na een PTBI in de centrale hersenen te bepalen, werd de proliferatieve respons gemeten bij jongvolwassen mannen die binnen 6 uur na eclosie werden verzameld en gewond. Een significante toename van proliferatie werd 24 uur na het letsel waargenomen met behulp van antifosfohisteen 3 (PH3), een marker voor cellen die actief mitose ondergaan. Ongeveer 3 PH3+ cellen in de centrale hersenen en 11 PH3+ cellen in de gewonde centrale hersenen worden 24 uur na PTBI waargenomen (figuur 2A-D). De meerderheid van de delende cellen bevindt zich in de buurt van de plaats van het letsel. Een tweede test voor celdeling werd gebruikt om de cumulatieve celproliferatie van een enkele verwonding te kwantificeren en om te beoordelen in hoeverre de nieuw gecreëerde cellen overleefden. 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) is een thymidine-analoog dat kan worden opgenomen in nieuw gesynthetiseerd DNA en permanent cellen labelt die DNA-synthese hebben ondergaan. Vliegen kregen een 4-daagse puls van EdU, gevolgd door een 3-daagse achtervolging. Hieruit bleek dat de gelabelde cellen levensvatbaar waren en minstens 3 dagen na proliferatie overleefden. Na 7 dagen waren er gemiddeld 2 EdU+ cellen in respectievelijk de centrale hersenen en gemiddeld 11 EdU+ cellen in de gewonde centrale hersenen (figuur 2E). Dit is vergelijkbaar met de resultaten die 24 uur na het letsel worden verkregen met behulp van het PH3-antilichaam. Wanneer celproliferatie wordt gemeten na 14 dagen, hadden de niet-gewonde controles gemiddeld 1 EdU + -cel per centraal brein, terwijl de gewonde hersenen gemiddeld 29 EdU + -cellen hadden (figuur 2E), wat aantoont dat celproliferatie ten minste tot de tweede week na een PTBI doorgaat.

Celproliferatie is leeftijdsafhankelijk
De grootste proliferatieve respons in de centrale hersenen werd waargenomen binnen de eerste 24 uur na eclosie (figuur 3). Tegen 7 dagen na eclosie veroorzaakt een penetrerend letsel nog steeds een significante toename van proliferatie, met een gemiddelde van 6 PH3 + cellen per centraal brein. Toch neemt 14 dagen na eclosie het vermogen van cellen om zich te delen na PTBI aanzienlijk af tot 1 delende cel, vergelijkbaar met die van controlehersenen (figuur 3). Het potentieel voor celproliferatie na PTBI is dus leeftijdsafhankelijk.

Nieuw gecreëerde neuronen kunnen projecteren om doelgebieden te corrigeren
Om neurale regeneratie na PTBI te evalueren, werd het perma-twin labeling systeem15 gebruikt. Perma-twin lineage tracing labelt permanent delende cellen en hun nakomelingen met een groen fluorescerend eiwit (GFP) of rood fluorescerend eiwit (RFP)15. Meer perma-twin klonen werden gedetecteerd in gewonde monsters, na 2 dagen en 2 weken, dan in controles (figuur 4A-E). Met name waren er nieuwe paddenstoellichaamneuronen in ~ 50% van de PTBI-hersenen 2 weken na het letsel (figuur 4N). Deze nieuwe neuronen projecteerden hun dendrieten op de juiste manier op de kelk van het paddenstoellichaam en hun axonen op de juiste manier op de kwabben van het paddenstoellichaam (figuur 4D, F, G). Dit geeft aan dat de nieuw gecreëerde cellen functionele neuronen kunnen zijn die betrokken zijn bij het herstel van de beschadigde paddenstoellichamen. Andere gebieden van de hersenen die leken te regenereren zijn het ellipsoïde lichaam (EB) (figuur 4H, I), de antennelobben (AL) (figuur 4J, K) en de laterale hoorn (LH) (figuur 4L, M) die respectievelijk ongeveer 26%, 26% en 20% van de tijd grote klonen bezaten (figuur 4N). Deze resultaten onderstrepen het nut van dit systeem voor het onderzoek naar neurogenese bij volwassenen. Een voorgesteld model voor de opeenvolging van gebeurtenissen na PTBI en leidend tot de generatie van nieuwe neuronen is weergegeven in figuur 5.

figure-results-1
Figuur 1: Penetrerend traumatisch hersenletsel (PTBI) aan het centrale brein van drosophila bij volwassenen. (A) Schema van de buitenkant van een volwassen vliegenkop. Dit is een frontaal uitzicht. De rechterkant van het dier bevindt zich dus links van de kijker. (B) Schema van de binnenkant van een volwassen Drosophila-hoofd met het verwondingstraject aangegeven in grijs. Dit is een achteraanzicht. In dit beeld en de daaropvolgende figuren bevindt de rechterkant van de hersenen zich dus aan de rechterkant. Centrale hersenen PTBI beïnvloedt meerdere hersenstructuren, waaronder het paddenstoellichaam (groen) en weefsels buiten de hersenen, waaronder het vetlichaam (blauw) en hemocyten (rood). CB = centraal hersengebied. OL= optische kwab regio. (C) Dorsale weergave van een levend volwassen hoofd waarin paddenstoellichamen (pijlpunten) zijn gelabeld met een groen fluorescerend eiwit (GFP). Dit is het 'standaard genotype' (zie tekst voor details). Het PTBI-protocol resulteert reproduceerbaar in letsel aan de paddenstoellichamen. Deze figuur is aangepast van Referentie16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: PTBI stimuleert celproliferatie. Niet-beschadigde controle (A) en PTBI (B) schema's. De blauwe vakken in de rechterbovenhoeken geven de hersengebieden aan die bij een hogere vergroting in panelen (C) en (D) worden weergegeven. (C,D) PH3-antilichaam (rood) werd gebruikt om celproliferatie 24 uur na verwonding te testen. In controlehersenen (C) zijn er weinig PH3+ cellen en geen enkele in de buurt van de MB. In PTBI-hersenen (D) zijn er echter PH3 + -cellen in de buurt van de MB. (E) Kwantificering van prolifererende cellen. De cijfers weerspiegelen prolifererende cellen in hele hersenen, niet alleen in de buurt van het paddenstoellichaam. Na 24 uur hadden ongedeerde controlehersenen gemiddeld 3 PH3 + cellen / hersenen (n = 11 hersenen, 28 cellen), terwijl 24 uur na PTBI hersenen gemiddeld 11 PH3 + cellen / hersenen hadden (n = 17 hersenen, 181 cellen). Na 7 dagen hebben niet-gewonde controles weinig EdU + -cellen, met een gemiddelde van 2 EdU + -cellen / hersenen (n = 15 hersenen, 24 cellen), terwijl 7-daagse post-PTBI-hersenen gemiddeld 11 EdU + -cellen / hersenen hadden (n = 22 hersenen, 238 cellen). Na 14 dagen hebben niet-gewonde controles gemiddeld 1 EdU + cel / hersenen (n = 8 hersenen, 11 cellen), terwijl 14-daagse post-PTBI-hersenen gemiddeld 29 EdU + cellen / hersenen hebben (n = 14 hersenen, 400 cellen). Voor deze reeks experimenten werden jongvolwassen mannetjes binnen 6 uur na eclosie gebruikt. Ongepaarde t-tests van controle- en PTBI-monsters op de 3-tijdspunten leveren waarden op van respectievelijk p<0,0001, p<0,0001 en p<0,0002. Foutbalken geven de standaarddeviatie (SD) weer. Deze figuur is aangepast van Referentie16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: De proliferatieve respons op PTBI neemt af met de leeftijd. Om te onderzoeken of leeftijd van invloed is op de hoeveelheid celproliferatie die optreedt na letsel, werden nieuw gesloten volwassen mannetjes vergeleken met dieren van 7 dagen, 14 dagen en 28 dagen vóór PTBI, met behulp van anti-PH3 om celproliferatie 24 uur na verwonding te testen. Vliegen die binnen 6 uur na eclosie gewond raakten, hadden gemiddeld 11 PH3 + cellen / hersenen (n = 17 hersenen, 182 cellen) vergeleken met een gemiddelde van 3 PH3 + cellen / hersenen in leeftijd-gematchte controles (n = 11 hersenen, 28 cellen). Vliegen van 7 dagen oud, vervolgens onderworpen aan PTBI, hadden gemiddeld 6 PH3 + cellen / hersenen (n = 11 hersenen, 65 cellen) in vergelijking met leeftijd-gematchte controles met een gemiddelde van 2 PH3 + cellen / hersenen (n = 5 hersenen, 12 cellen). Toen vliegen ouder waren dan 14 dagen vóór PTBI en 24 uur later werden getest, was er een gemiddelde van 1 PH3 + cel / hersenen (n = 8 hersenen, 11 cellen) vergelijkbaar met leeftijd-gematchte controles, die ook gemiddeld 1 PH3 + cel / hersenen (n = 4 hersenen, 2 cellen). 28-daagse ongedeerde controle (n = 4, 1 cel) en PTBI (n = 3, 1 cel) vliegen beide gemiddeld 0 PH3 + cellen / hersenen. Ongepaarde t-tests voor PTBI om vergelijkingen op deze 4-tijdspunten te controleren zijn respectievelijk p<0,0001, p<0,04, p<0,07 en p<0,84. Deze figuur is aangepast van Referentie16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Perma-twin lineage tracing toont hersenregeneratie en geschikte targeting van axonen na PTBI. Het perma-twin lineage-tracing systeem15 werd gebruikt om neurogenese na PTBI te analyseren. Dit systeem labelt delende cellen en nakomelingen permanent met een groen fluorescerend eiwit (GFP) of rood fluorescerend eiwit (RFP). Vliegen werden gekweekt bij 17 °C om het systeem tijdens de ontwikkeling uit te houden. F1-mannetjes met perma-twin transgenen werden verzameld bij eclosie, vervolgens gewond en bij 30 °C geplaatst om gedurende 2 of 14 dagen te herstellen. (A) In 2-daagse ongedeerde controles zijn er enkele GFP + -cellen verspreid over de hersenen. (B) Na 14 dagen zijn er relatief weinig GFP+-cellen aanwezig in de controle-centrale hersenen. (C) Ter vergelijking: 2-daagse gewonde hersenen hebben meer GFP + -cellen die de neiging hebben om zich in de buurt van de verwonding (pijlpunt) te clusteren. (D) 14 dagen na het letsel zijn er grote klonen in de buurt van de plaats van verwonding. Sommige van deze klonen hebben axonen die langs de paddenstoellichamen (pijlpunt) uitsteken. Alleen het GFP-kanaal wordt hier weergegeven; er waren vergelijkbare RFP + -klonen in de PTBI-monsters. (E) Het aantal klonen neemt toe in de loop van de tijd na PTBI.Controle ongedeerde hersenen (n = 13) hebben gemiddeld 10 klonen na 2 dagen, terwijl 2-daagse PTBI-hersenen (n = 20) gemiddeld 23 klonen hebben (p<0,00002). Na 7 dagen hadden controlehersenen gemiddeld 9 klonen per hersenen (n = 18), terwijl 7-daagse PTBI-hersenen gemiddeld 39 klonen per hersenen hadden (n = 16) (p-waarde<0,00000002). Dit is aanzienlijk meer dan het aantal klonen dat 2 dagen na het letsel werd gezien (p-waarde<0,0009). In 14-daagse controlehersenen zijn er gemiddeld 10 klonen per brein, wat niet significant verschilt van de 2-daagse en 7-daagse controles. Na 14 dagen na PTBI zijn er echter gemiddeld 66 GFP + -klonen, wat aanzienlijk meer is dan leeftijdsgematchte controles (p<0,0000003) of 2-daagse post-PTBI-hersenen (p-waarde<0,0001). Foutbalken weerspiegelen SD. (F-M) PTBI stimuleert kloonvorming in meerdere regio's in de hersenen. Panelen aan de linkerkant zijn schema's van hersengebieden waar grote klonen werden gevonden 14 dagen na PTBI (A, H, J, L). Panelen aan de rechterkant tonen hoge vergrotingen van representatieve hersenen (G, I, K, M). Veel 14-daagse hersenen hadden klonen die op bepaalde doelgebieden projecteerden. Deze omvatten het paddenstoellichaam (MB) (F, G), het ellipsoïde lichaam (EB) (H, I), de antennekwab (AL) (J, K) en de laterale hoorn (LH) (L, M). (N) Zowel het aantal kloons als de kloongrootte nemen toe met de tijd na PTBI.De verhoudingen van hersengebieden met grote klonen werden berekend na 2, 7 en 14 dagen in controles en gewonde hersenen. Na 2 dagen vertoonde ~8% van de controlehersenen (n = 13) AL-klonen, terwijl er geen AL-klonen waren in 2-daagse gewonde hersenen (n = 20). In 7-daagse controlehersenen (n = 18) had 6% AL en 6% HAD EB-klonen. 7 dagen na PTBI (n = 16) had 6% van de hersenen ook AL-klonen, 6% had EB-klonen en 19% had grote MB-klonen. Na 14 dagen vertoonden controlehersenen (n = 9) geen specifieke gebieden met klonen, terwijl 47% van de PTBI-hersenen (n = 15) MB-klonen had, 20% van de PTBI-hersenen AL-klonen had en 27% van de PTBI-hersenen EB-klonen had en 27% LH-klonen. Deze figuur is aangepast van Referentie16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Samenvattend model voor regeneratie na penetrerend traumatisch hersenletsel (PTBI). Bij jongvolwassen Drosophila zijn er rustige neuroblastachtige cellen in de centrale hersenen die geen expressie van canonieke neuroblastgenen hebben. Tegen 24 uur na PTBI worden de rustige neuroblastachtige cellen geactiveerd, brengen neuroblastgenen tot expressie en zijn ze begonnen zich te vermenigvuldigen. Zowel 4 uur als 24 uur na PTBI is er een golf van celdood16. Na 7 dagen is de proliferatiesnelheid nog steeds hoog en veel van de nieuwe cellen hebben volwassen celidentiteiten aangenomen en worden neuronen of glia. 14 dagen na PTBI projecteren grote klonen van nieuwe neuronen met axonen en dendrieten correct op hun respectievelijke doelgebieden. Locomotorische defecten worden ook binnen 14 dagen hersteld, wat suggereert dat volwassen Drosophila functioneel en structureel kan regenereren. Deze figuur is aangepast van Referentie16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Hoewel penetrerende verwondingen aan de volwassen Drosophila-hersenen eerder zijn beschreven15,17,18, richtten deze verwondingen zich op de optische kwabben en niet op de centrale hersenen. Verder ontbreken gedetailleerde instructies voor het uitvoeren van de verwondingen tot nu toe. Dit protocol beschrijft een model voor penetrerend letsel aan de centrale hersenen van Drosophila dat statistisch significant bewijs voor volwassen neurogenese na PTBI reproduceert.

De reproduceerbaarheid van dit PTBI-protocol is deels te danken aan het paddenstoellichaam als het doelgebied van de verwonding. Het paddenstoellichaam is groot en bestaat uit ~2200 neuronen met complexe dendriet- en axonprieeltjes in grote en sterk stereotiepe arrays18. De cellichamen van paddenstoellichaamneuronen liggen in de buurt van het oppervlak van de hersenen en kunnen worden gevisualiseerd door de hoofdschubben met behulp van de expressie van groen fluorescerend eiwit (GFP) (figuur 1C). Paddenstoellichaamvoorlopers zijn de laatste neurale stamcellen die apoptose ondergaan tijdens de ontwikkeling13,12,19. Veel neuronen van het paddenstoellichaam zijn dus vrij jong op het moment van eclosie. Dit leidde tot de hypothese dat het paddenstoellichaam meer mitotisch potentieel zou kunnen hebben dan andere hersengebieden16. Bovendien is het paddenstoellichaam van cruciaal belang voor leren en geheugen18. Hierdoor kan men zich afvragen of PTBI-getriggerde neurogenese leidt tot functioneel herstel.

Andere factoren die bijdragen aan de reproduceerbaarheid van de resultaten zijn onder meer het gebruik van gekruiste vliegen van consistente genotypen, het uitvoeren van kruisingen in dezelfde richting elke keer, het nauwkeurig regelen van de opfok- en verouderingstemperaturen en het afzonderlijk analyseren van mannetjes en vrouwtjes. Het gebruik van F1-vliegen uit een outcross vermindert de kans op het analyseren van hersens homozygoot op spontane mutaties. Het standaardkruis van y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP;; OK107-GAL4 volwassen vrouwtjes tot y[1] w[1] volwassen mannelijke vliegen resulteert in F1-nakomelingen van het genotype y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP/+;; OK107-GAL4/+. OK107-GAL4 wordt uitgedrukt in alle intrinsieke neuronen van het paddenstoellichaam en drijft de expressie van de membraangebonden reporter UAS-mCD8-GFP aan, waardoor visualisatie van paddenstoellichamen en hun projecties mogelijk is. Voor de perma-twin kruisingen moeten kruisen te allen tijde op 17 °C blijven om het afstammingstraceringssysteem uitgeschakeld te houden. Dit zorgt ervoor dat er tijdens de ontwikkeling geen delende cellen worden gelabeld en dat alleen volwassen neuronen en glia worden gelabeld. Daartoe kan de vliegkamer ook op 17 °C worden gehouden. Hoewel de eerste beschrijving van het perma-twin-systeem15 het fokken van vliegen bij 18 °C aanbeveelt, kan dit leiden tot aanzienlijke achtergrondetikettering.

Voor de consistentie wordt ook aanbevolen om de controle ongedeerde vliegen op de CO2-pad te houden terwijl men de PTBI uitvoert. Dit zorgt ervoor dat beide sets vliegen identieke anesthetische blootstelling hebben. Bovendien is het wenselijk voor reproduceerbaarheid om het hoofd volledig te penetreren. Er moet echter voor worden gezorgd dat de punt van de pin niet tegen de pad wordt gebogen, waardoor deze onbruikbaar wordt voor toekomstige verwondingen. Voor bekwame beoefenaars is er weinig onbedoelde schade aan PTBI-vliegen. Niettemin kan te hard op de thorax drukken om de vlieg te stabiliseren tijdens een verwonding dodelijk zijn. Een manier om de omvang van het onbedoelde letsel te beoordelen, is door de mortaliteit van PTBI-vliegen 24 uur na het letsel te kwantificeren. Voor eenzijdig gewonde vliegen kan dit 50% of hoger zijn voor beginners. Daarom, om ervoor te zorgen dat de waargenomen resultaten te wijten zijn aan PTBI en niet aan onbedoeld letsel, wordt geadviseerd dat beginners oefenen met het toedienen van PTBI op ~ 20 vliegen per dag gedurende meerdere weken en de resulterende hersenen niet analyseren totdat de 24-uurssterfte consequent <10% is.

Om de hoeveelheid proliferatie te kwantificeren die wordt gestimuleerd door PTBI in de centrale hersenen, kunnen zowel antifosfohiston H3 (PH3) immunostaining als 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) integratie worden gebruikt. Anti-PH3 labelt cellen voor en door de metafase, waardoor de detectie wordt beperkt tot slechts een fractie van de actief delende cellen. Anti-PH3-kleuring biedt dus slechts een gedeeltelijke glimp van proliferatie. EdU is een thymidine-analoog dat kan worden opgenomen in nieuw gesynthetiseerd DNA. Door vliegen EdU te voeren voor en na het letsel, is het mogelijk om een completer beeld te krijgen van de cellen die zich delen of hebben gedeeld na het letsel. Het feit dat alle cellen die zich delen permanent worden gemarkeerd, is nuttig voor zowel de identificatie van langzaam fietsende cellen als voor het testen van de overleving van cellen na de eerste proliferatie. Om onduidelijke redenen, maar misschien vanwege de beperkte permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière, is EdU-etikettering inefficiënt en rapporteert het de celproliferatie in de volwassen hersenen. Dit blijkt uit de vergelijkbare aantallen PH3 + en EdU + cellen in zowel controle- als experimentele hersenen op 24 uur na PTBI en door te observeren dat slechts een subset van nieuwe cellen in perma-twin klonen EdU16 bevat. Voor maximale etikettering is het essentieel om de vliegen vooraf te voeden met EdU, omdat gewonde vliegen het voeden gedurende enkele uren na PTBI niet hervatten. Voeding werd beoordeeld door voedselkleurstof toe te voegen aan de EdU-oplossing en de hoeveelheid kleurstof in de darm via de abdominale cuticula te controleren16.

Opgemerkt moet worden dat hoewel we in stap 4 een hersendissectieprotocol hebben verstrekt, alternatieve technieken kunnen worden gebruikt. Verschillende hiervan zijn beschikbaar in eerder gepubliceerde protocollen20,21,22. Drosophila melanogaster biedt een goedkoop model met krachtige genetische en moleculaire hulpmiddelen die kunnen worden gebruikt om de mechanismen te bestuderen die ten grondslag liggen aan regeneratie van meerdere weefsels, waaronder de darm en componenten van het zenuwstelsel. Een nieuw en reproduceerbaar letselmodel dat kan worden gebruikt om de reactie op hersenletsel te bestuderen, wordt hier geschetst. Gegevens verkregen met behulp van deze protocollen ondersteunen het idee dat het volwassen Drosophila centrale brein het proliferatieve vermogen behoudt en nieuwe neuronen genereert als reactie op letsel. Deze waarnemingen rechtvaardigen verder onderzoek naar zowel de mate van volwassen neurogenese als de onderliggende moleculaire mechanismen. Zodra de componenten die betrokken zijn bij neurale regeneratie in dit systeem zijn geïdentificeerd, kunnen we onze kennis van volwassen Drosophila-neurogenese omzetten naar mensen.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

We zijn Stacey Rimkus en Becky Katzenberger dankbaar voor de technische bijstand en Eduardo Moreno voor het delen van de perma-twin aandelen. We willen Barry Ganetzky en David Wassarman bedanken voor levendige discussies die ongetwijfeld de wetenschap hebben verbeterd en Kent Mok, Cayla Guerra en Bailey Spiegelberg voor hun bijdragen aan het laboratorium. De FasII-antilichamen werden ontwikkeld door Corey Goodman en verkregen van de Developmental Studies Hybridoma Bank, gemaakt door de NICHD van de NIH en onderhouden aan de Universiteit van Iowa, Department of Biology, Iowa City, IA 52242. De meeste Drosophila-stammen die in deze studie werden gebruikt, werden verkregen van het Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC; NIH P40OD018537). Dit werk werd ondersteund door NIH T32 GM007133 (KLC); NIH NS090190 (GBF); NIH NS102698 (GBF); de University of Wisconsin Graduate School (GBF); en het UW-Madison Women in Science and Engineering Leadership Institute (WISELI) (GBF).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
#11 wegwerp scalpelsSanta Cruz Biotechnologysc-395923gebruikt voor het scheiden van Drosophila-hoofden van rompen voorafgaand aan hersendissectie
150 mm diameter zwarte Sylgard schalenDow1696157gemaakt in het laboratorium met reagentia van Dow; gebruikt voor hersendissectie
18 mm dekglasjeselkevoor het bevestigen van hersenen op microscoopglazen
4',6-Diamidino-2-Fenylindool, Dihydrochloride (DAPI)ThermoFisherD1306voor immunohistologie
70% Ethanolgemaakt van 95% ethanol verkregen uit verschillende bronnen
anti-muis Cy5Jackson ImmunoResearch715-175-151voor immunohistologie
anti-konijn 568ThermoFisherA11036voor immunohistologie
runderserumalbumine (BSA)Sigma AldrichA7030voor immunohistochemie
Klare nagellakelkevoor het verzegelen van dekglasjes
Click-It EdU labelkitInVitrogenC10640om nieuw gesynthetiseerd DNA te detecteren
CO2 bubblerGenesee Scientific59-181voor anesthesie
CO2 padGenesee Scientific59-114voor anesthesie
CO2 regulator en toevoerelkevoor anesthesie
Confocale microscoopelkevoor beeldvorming van gefixeerde, gekleurde en gemonteerde hersenen
katoenen pluggenGenesee Scientific51-101voor EdU-labeling
Drosophila-flaconsGenesee Scientific32-109voor EdU-labeling
Fixeerbuffer (Pipes, EGTA, Magnesium; PEM)componenten afkomstig van verschillende bedrijvenvoor het fixeren van volwassen hersenen; 100 mM piperazine-N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid) [PIPES], 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, pH 7,0
FormaldehydeSigma Aldrich252549voor het fixeren van volwassen hersenen, toegevoegd aan PEM
Grade 3 ronde Whatman-filters, 23 mm rondTisch Scientific1003-323voor EdU-labeling
Microfuge buizenelkevoor het fixeren en kleuren van reacties en voor het bewaren van Minutien-pins
Microscoopglazenelkevoor het bevestigen van hersenen
Minutien-pinsFine Science Tools26002-10voor hersenletsel; 12,5 µm diameter tip en 100 µm diameter staaf
muis anti-Fasiclin IIDevelopmental Studies Hybridoma Bank1D4-svoor immunohistologie
NIGHTSEA stereomicroscoopfluorescentie-adapterElectron Microscopy SciencesSFA-GRfluorescentie-opstelling voor dissectief microscoop
P20, P200 en P1000 pipettors en tipselkevoor het meten van oplossingen
fosfaatgebufferde saliine (PBS)componenten afkomstig van verschillende bedrijvenvoor het dissecteren van hersenen en het maken van immunohistologie blokkerings- en wasoplossingen; 100 mM K2HPO4, 140 mM NaCl, pH 7,0
fosfaatgebufferde zoutoplossing met 0,1% Triton X-100 (PT)componenten afkomstig van verschillende bedrijvenvoor het wassen van gedissekteerde hersenen
fosfaatgebufferde zoutoplossing met 0,1% Triton X-100 + 2% bovien serumalbumine (PBT)componenten afkomstig van verschillende bedrijvenblokkeringsoplossing voor immunohistologie en voor het verdunnen van antilichamen
konijn anti-PH3Santa Cruz Biotechnology, Incsc-8656-Rvoor immunohistologie
VersterkingslabelsAvery5721om ruimte te behouden tussen het microscoopglas en het dekglas
Grootte 0 verfkwastenelkeom volwassen Drosophila te manipuleren en te stabiliseren tijdens verwonding
Triton X-100Sigma Aldrich93443
Twee paar #5 horlogemakertangenFine Science Tools11255-20gebruikt om de Minutien-pins vast te houden en voor hersendissecties
VectashieldVector LaboratoriesH-1000montagemedium voor microscoopglazen

Referenties

  1. Thurman, D., et al. Report to Congress: Traumatic brain injury in the United States. , Available from: https://www.cdc.gov/traumaticbraininjury/pubs/tbi_report_to_congress.html (1999).
  2. NIEHS. , Available from: https://www.nih.gov/research/supported/health/neurodegenerative/index.cfm (2021).
  3. Morton, N. V., Wehman, P. Psychosocial and emotional sequelae of individuals with traumatic brain injury: A literature review and recommendations. Brain Injury. 9 (1), 81-92 (2017).
  4. Bonini, N. M., Berger, S. L. The sustained impact of model organisms-in genetics and epigenetics. Genetics. 205, 1-4 (2017).
  5. Brace, E. J., DiAntonio, A. Models of axon regeneration in Drosophila. Experimental Neurology. 287, Pt 3 310-317 (2017).
  6. Hao, Y., Collins, C. Intrinsic mechanisms for axon regeneration: insights from injured axons in Drosophila. Current Opinion in Genetics & Development. 44, 84-91 (2017).
  7. Chiang, A. S., et al. Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution. Current Biology. 21 (1), 1-11 (2011).
  8. Meinertzhagen, I. A. The organisation of invertebrate brains: cells, synapses and circuits. Acta Zoologica. 91 (1), 64-71 (2010).
  9. Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: A history lesson for the future. Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).
  10. Lessing, D., Bonini, N. M. Maintaining the brain: insight into human neurodegeneration from Drosophila melanogaster mutants. Nature Reviews Genetics. 10 (6), 359-370 (2009).
  11. Boone, J. Q., Doe, C. Q. Identification of Drosophila type II neuroblast lineages containing transit amplifying ganglion mother cells. Developmental Neurobiology. 68 (9), 1185-1195 (2008).
  12. Ito, K., Hotta, Y. Proliferation pattern of postembryonic neuroblasts in the brain of Drosophila melanogaster. Developmental Biology. 149 (1), 134-148 (1992).
  13. Siegrist, S. E., Haque, N. S., Chen, C. H., Hay, B. A., Hariharan, I. K. Inactivation of both Foxo and reaper promotes long-term adult neurogenesis in Drosophila. Current Biology. 20 (7), 643-648 (2010).
  14. von Trotha, J. W., Egger, B., Brand, A. H. Cell proliferation in the Drosophila adult brain revealed by clonal analysis and bromodeoxyuridine labelling. Neural Development. 4, 9(2009).
  15. Fernandez-Hernandez, I., Rhiner, C., Moreno, E. Adult neurogenesis in Drosophila. Cell Reports. 3 (6), 1857-1865 (2013).
  16. Crocker, K. L., et al. Neurogenesis in the adult Drosophila brain. Genetics. , (2021).
  17. Plavicki, J., Mader, S., Pueschel, E., Peebles, P., Boekhoff-Falk, G. Homeobox gene distal-less is required for neuronal differentiation and neurite outgrowth in the Drosophila olfactory system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1578-1583 (2012).
  18. Aso, Y. The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning. Elife. 3, 04577(2014).
  19. Ito, K., Awano, W., Suzuki, K., Hiromi, Y., Yamamoto, D. The Drosophila mushroom body is a quadruple structure of clonal units each of which contains a virtually identical set of neurones and glial cells. Development. 124 (4), 761-771 (1997).
  20. Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A. Simple one-step dissection protocol for whole-mount preparation of adult Drosophila brains. Journal of Visualized Experiments. (118), e55128(2016).
  21. Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. Dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult Drosophila melanogaster brains. Journal of Visualized Experiments. (129), e56174(2017).
  22. Arain, U., Valentino, P., Islam, I. M., Erclik, T. Dissection, immunohistochemistry and mounting of larval and adult Drosophila brains for optic lobe visualization. Journal of Visualized Experiments. (170), e61273(2021).

Herprints en machtigingen

Tags

Traumatisch hersenletselneurale regeneratieprotocol voor hersenletselimmunohistochemiecelproliferatieneuronen van het mushroom bodyEdU-labelingPermatwin-labeling
Stimuleren en analyseren van volwassen neurogenese in de drosophila centrale hersenen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.