Kip recombinante ledematen test om morfogenese, patroonvorming en vroege stappen in celdifferentiatie te begrijpen

Samenvatting

Recombinante ledematen zijn een krachtig experimenteel model dat het mogelijk maakt om het proces van celdifferentiatie en het genereren van patronen onder invloed van embryonale signalen te bestuderen. Dit protocol presenteert een gedetailleerde methode voor het genereren van recombinante ledematen met kippen ledemaat-mesodermale cellen, aanpasbaar aan andere celtypen verkregen uit verschillende organismen.

Samenvatting

Celdifferentiatie is het verfijnde proces van celverbintenis dat leidt tot de vorming van verschillende gespecialiseerde celtypen tijdens de oprichting van zich ontwikkelende weefsels en organen. Dit proces wordt actief in stand gehouden op volwassen leeftijd. Celdifferentiatie is een continu proces tijdens de ontwikkeling en homeostase van organen. Het begrijpen van de vroege stappen van celdifferentiatie is essentieel om andere complexe processen zoals morfogenese te kennen. Recombinante kippenledematen zijn dus een experimenteel model dat de studie van celdifferentiatie en patroongeneratie onder embryonale patroonsignalen mogelijk maakt. Dit experimentele model imiteert een in vivo omgeving; het assembleert gereaggregateerde cellen tot een ectodermale bedekking verkregen uit een vroege ledemaatknop. Later worden ectodermen overgebracht en geïmplanteerd in een kuikenembryoreceptor om de ontwikkeling ervan mogelijk te maken. Deze test werd voornamelijk gebruikt om mesodermale ledemaatknopcellen te evalueren; het kan echter worden toegepast op andere stam- of voorlopercellen van andere organismen.

Inleiding

De gewervelde ledemaat is een formidabel model voor het bestuderen van celdifferentiatie, celproliferatie, celdood, patroonvorming en morfogenese ^1,2. Tijdens de ontwikkeling komen ledematen tevoorschijn als uitstulpingen van de cellen die zijn afgeleid van lateraal plaat mesoderm¹. Ledemaatknoppen bestaan uit een centrale kern van mesodermale cellen bedekt met een ectoderm. Uit deze vroege structuur komt een geheel en goed gevormd ledemaat tevoorschijn. Nadat de ledemaatknop ontstaat, worden drie assen herkend: (1) de proximo-distale as ([PD] schouder tot vingers), (2) de dorso-ventrale as ([DV] van de rug van de hand naar de handpalm) en (3) de voorste-achterste ([AP] duim naar vinger). De proximaal-distale as hangt af van de apicale ectodermale richel (AER), gespecialiseerd ectoderm aan de distale punt van de ledemaatknop. De AER is nodig voor uitgroei, overlevingsonderhoud, proliferatie en de ongedifferentieerde toestand van cellen die signalen ontvangen ^2,3. Aan de andere kant regelt de zone van polariserende activiteit (ZPA) anteroposteriorpatroon⁴, terwijl het dorsale en ectoderm dorsoventrale patronen ^7,8 regelen. Integratie van driedimensionale patronen impliceert complexe overspraak tussen deze drie assen⁵. Ondanks het begrijpen van de moleculaire route tijdens de ontwikkeling van ledematen, blijven open vragen over de mechanismen die patronen en de juiste uitgroei regelen om een hele ledemaat te vormen onbeantwoord.

Edgar Zwilling ontwikkelde het recombinante ledemaat (RL) systeem in 1964 om de interacties tussen mesenchymale cellen van ledematen en het ectoderm bij het ontwikkelen van ledematen te bestuderen⁶. Het RL-systeem assembleert het gedissocieerde-gereaggregateerde mesoderm van de ledemaatknop in het embryonale ledemaat-ectoderm om het te transplanteren in het dorsale deel van een donorkuikenembryo. De signalen van het ectoderm induceren de expressie van differentiatiegenen en patroongenen op een spatio-temporele manier, waardoor de vorming van een ledemaatachtige structuur wordt geïnduceerd die de celprogramma's kan samenvatten die optreden tijdens de ontwikkeling van ledematen ^7,8,9.

Het RL-model is waardevol voor het begrijpen van de eigenschappen van ledemaatcomponenten en de interactie tussen mesodermale en ectodermale cellen⁶. Een RL kan worden gedefinieerd als een ledemaatachtige structuur die wordt gecreëerd door de experimenteel assemblerende of recombinerende mesodermale cellen van ledemaatknopen in een ectodermale dekking⁶. De morfogenese van de RL hangt af van de kenmerken van de mesodermale cellen (of andere typen) die zullen reageren op de ectodermale patroonsignalen. Een van de voordelen van dit experimentele systeem is de veelzijdigheid. Deze eigenschap maakt het mogelijk om meerdere combinaties te maken door de bron van mesodermale cellen, zoals cellen uit verschillende ontwikkelingsstadia, te variëren vanuit verschillende posities langs de ledemaat, of hele (niet-gesoctroeerde) of gereaggregateerde cellen 7,8,9,10. Een ander voorbeeld is het vermogen om het embryonale ectoderm te verkrijgen van andere soorten dan kip, bijvoorbeeld schildpad¹¹, kwartel of muis¹².

In die zin helpt de RL-techniek bij het bestuderen van de ontwikkeling van ledematen en de interacties tussen mesenchymale en ectodermale cellen van ledematen vanuit een evolutionair oogpunt. Deze techniek heeft ook een groot potentieel voor het analyseren van het vermogen van verschillende bronnen van voorlopercellen om te differentiëren in een ledemaatachtige structuur door gebruik te maken van de signalen van het embryonale ectoderm 12,13,14. In tegenstelling tot in vitro culturen maakt de RL het mogelijk om de differentiatie en het morfogenetische potentieel van een celpopulatie te evalueren door embryonale signalen van een zich ontwikkelende ledemaat^{te interpreteren 9,15}.

In dit protocol wordt een stapsgewijze handleiding gegeven voor het uitvoeren van succesvolle RL met gereaggregateerde mesodermale ledemaatknopcellen, waardoor de mogelijkheid wordt geopend om dit protocol aan te passen met verschillende bronnen van gereaggregateerde cellen of zelfs verschillende ectodermbronnen.

Protocol

Dit onderzoek werd beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Review Board for the Care and Use of Laboratory Animals van het Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Mexico City, Mexico). Een schematisch stroomdiagram van de algemene stappen van dit protocol is weergegeven in figuur 1A.

1. Embryo-incubatie en bepaling van de levensvatbaarheid

1. Broed bevruchte kippeneieren uit bij 38 °C en 60% relatieve vochtigheid gedurende ongeveer drie en een halve dag totdat ze het 22 HH-stadium bereiken (volgens Hamilton en Hamburger, 1951)¹⁶.
   OPMERKING: Vers bevruchte kippeneieren kunnen maximaal een week bij 15 °C worden bewaard.
   1. Om de bevruchte eieren uit te broeden, plaatst u de eieren verticaal met de puntige kant naar beneden in de bevochtigde incubator. Draai de eieren tijdens de incubatie omdat het nodig is om te voorkomen dat het zich ontwikkelende embryo zich aan het schaalmembraan hecht.
      OPMERKING: Bevruchte kippeneieren kunnen worden verkregen van lokale boerderijen. Bevruchte White Leghorn kippeneieren worden over het algemeen gebruikt om pigmentatie van de veren in late embryo's te voorkomen. Overweeg om voldoende eieren afzonderlijk te broeden om drie structuren te verkrijgen: (1) mesodermale cellen van ledematen, (2) ectodermen van ledematen en (3) donorembryo's om de RL te transplanteren.
2. Na drie en een halve dag incubatie, verwijder eieren uit de broedmachine, wattenstaafje met 70% ethanol en laat aan de lucht drogen.
3. Identificeer ontwikkelende embryo's die het ei kandellen om de bloedvaten te observeren en het embryo te lokaliseren. Gooi eieren weg die geen embryo hebben.
   OPMERKING: Verdeel op dit punt de eieren om mesodermale cellen, ectodermen en de gastheren voor de RL te verkrijgen.

2. Het verkrijgen van mesodermale cellen van ledematen om ectodermen te vullen

OPMERKING: Voordat u de manipulaties start, wordt het ten zeerste aanbevolen om het werkgebied, de microscopen en alle instrumentele te desinfecteren door te vegen met 70% ethanoloplossing.

1. Tik op het stompe uiteinde van de eierschaal met het uiteinde van een stompe tang om een raam te openen en verwijder ongeveer 1 cm x 1 cm van de schaal met behulp van de tang.
2. Breng de eieren over op een plastic of kartonnen houder en plaats ze één voor één onder de stereomicroscoop. Identificeer het luchtmembraan en verwijder het vervolgens door een klein gaatje te kiezen waar geen vaten worden gevonden. Trek dit gebied met behulp van een fijne chirurgische tang.
   OPMERKING: Het luchtmembraan kan worden geïdentificeerd als het witte en ondoorzichtige membraan dat onmiddellijk na het venster van het ei wordt waargenomen.
   1. Verwijder elk klein stukje eierschaal dat in contact kan komen met het embryo.
      OPMERKING: Controleer of de embryo's zich in de 22 HH-fase bevinden voordat u het protocol start. Embryo's in eerdere stadia kunnen worden teruggebracht naar de incubator na het afdichten van het eierschaalvenster met tape.
3. Open de vruchtzak volledig door het amnion open te scheuren met behulp van de fijne chirurgische tang (zie Tabel met materialen).
   OPMERKING: Amnion kan worden geïdentificeerd als een transparant membraan dat het embryo nauw bedekt en gevuld is met vruchtwater.
4. Verwijder het embryo voorzichtig uit het ei met behulp van een stompe tang en breng het vervolgens over in een steriele petrischaal met ijskoude fosfaat-gebufferde zoutoplossing (1x PBS). Herhaal deze stap voor de resterende eieren. Bedenk dat slechts ~ 8-10 embryo's voldoende zijn om de mesodermale cellen te verkrijgen.
5. Was de embryo's eenmaal in ijskoude 1x PBS en trek met behulp van een stereomicroscoop (zie Materiaaltabel) eventueel resterende membranen terug. Zoek de achterpoten.
   OPMERKING: Ledemaatknoppen zijn afgeronde structuren langs de voorste-achterste as van het embryo als uitsteeksels van de flank. De achterpoten bevinden zich meer naar achteren dan de voorpoten.
6. Houd de embryo's in schone 1x PBS en knip met behulp van een fijne chirurgische tang elke achterste knop in de lengterichting. Snijd de knop heel dicht bij de flank van het embryo om de hele achterste knoppen te ontleden. Herhaal deze stap met de resterende embryo's.
7. Gebruik een plastic transferpipet om de ledemaatknoppen over te brengen in een lege microcentrifugebuis van 1,5 ml.
8. Gebruik een pipetpunt om overtollige 1x PBS te verwijderen en vervang PBS door 500 μL 0,5% trypsine-oplossing (zie Materiaaltabel). Incubeer ledemaatknoppen in een thermoblock gedurende 7 min bij 37 °C.
9. Verwijder de trypsine-oplossing en vervang deze door 500 μL collagenase type IV bij 2 mg/ml in Hanks Balanced Salt Solution (zie Materiaaltabel) en incubeer deze vervolgens in een thermoblok bij 37 °C gedurende 8 minuten.
   OPMERKING: Trypsine-incubatie maakt de ectodermen enigszins los, terwijl collagenase mesodermale cellen afbreekt.
10. Verwijder na incubatie zoveel mogelijk collagenase en vervang het door 1 ml koud Dulbecco's Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM-HG) medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) om de enzymen te inactiveren. Pipetteer het mengsel voorzichtig ~ 10 keer.
11. Filtreer de suspensie met de cellen met een celzeef van 70 μm om de ectodermen achter te laten.
    OPMERKING: Filtratie verwijdert ook onverteerde ledemaatknoppen, waardoor een suspensie van afzonderlijke cellen achterblijft.
12. Pipetteer na het filteren de suspensie opnieuw 5-10 keer en centrifugeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur bij 200 x g en gooi het supernatant weg.
13. Gebruik 1 ml DMEM-HG aangevuld met 10% FBS om het overtollige collagenase te wassen. Centrifugeer de suspensie bij 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
14. Gooi het medium voorzichtig weg door te pipetteren en vervang het vervolgens door 1 ml verse DMEM-HG aangevuld met 10% FBS zonder de cellen in de bodem van de buis te verstoren.
15. Laat de cellen een compacte pellet vormen (reaggregateren) na ze 1-1,5 uur bij 37 °C in een thermoblok te hebben geïncubeerd.
    OPMERKING: Terwijl mesodermale cellen de pellet vormen, is het handig om de ledemaat ectodermen te verkrijgen.

3. Het verkrijgen van de ledemaat ectodermen

1. Herhaal stap 1-6 uit sectie 2 afzonderlijk met de andere 22 HH-kippenembryo's die zijn gekozen om de ectodermen te verkrijgen.
   OPMERKING: Het aantal embryo's voor dit doel is evenredig met het uiteindelijke aantal van de gewenste RL. Een verhouding van 2:1 ectoderms-RL is geschikt.
2. Gebruik na het verkrijgen van de achterpoten een plastic pipet om ze over te brengen in een lege microcentrifugebuis. Verwijder overtollige 1x PBS en vervang deze door 500 μL 0,5% trypsine in steriele 1x PBS. Incubeer het mengsel gedurende 30 min bij 37 °C in een thermoblok.
3. Breng na de enzymatische vertering de trypsine-oplossing met de ledemaatknoppen over in een steriel petrischaaltje.
4. Verwijder het teveel aan trypsine zoveel mogelijk met behulp van een micropipette; overspoel de petrischaal met ijskoude 1x PBS aangevuld met 10% FBS totdat alle ledemaatknoppen bedekt zijn.
   OPMERKING: FBS kan worden vervangen door paardenserum.
5. Identificeer de ledemaatknoppen onder de stereomicroscoop; identificeer het ectoderm als een enigszins loskomend transparant membraan van de mesodermale cellen van de ledematen (figuur 1B).
6. Houd het meest proximale uiteinde van de ledemaatknop vast met behulp van een fijne chirurgische tang terwijl u de ectodermlaag voorzichtig losmaakt en scheidt met behulp van de andere tang.
   OPMERKING: Het verkrijgen van de ectodermen kan moeilijk zijn vanwege mesodermale celklontering en hechting aan ectodermen, waardoor ze kleverig worden. Het wordt aanbevolen om de mesodermale cellen constant weg te gooien om alleen de ectodermen in de petrischaal te behouden.
7. Onderhoud de ectoders in ijskoude 1x PBS-10% FBS oplossing.
   OPMERKING: Ectoderms kunnen worden bewaard bij 4 °C voor het geval het gereaggregateerde mesoderm niet klaar is. Het verdient echter de voorkeur om de incubatietijd van de pellet te coördineren met de ectodermale verkrijging.

4. Mesodermale cellen assembleren in de ectodermale hoes

OPMERKING: Hiervoor is het noodzakelijk om de lege ectodermen in een petrischaaltje te hebben met steriele 1x PBS-10% FBS-oplossing die een gevormde pellet van mesodermale cellen bevat.

1. Nadat de pellet is gevormd (zie rubriek 2), gooit u ~600 μL van het medium uit de buis door te pipetteren.
2. Maak de pellet voorzichtig los van de bodem met behulp van een pipetpunt en zonder deze te breken of te vernietigen.
3. Wanneer de pellet volledig is losgemaakt van de bodem van de buis, draait u de buis ondersteboven om de pellet over te brengen in de petrischaal met de lege ectodermen (figuur 1C).
4. Snijd een klein stukje van de pellet met behulp van een fijne chirurgische tang en plaats deze zo dicht mogelijk bij het ectoderm.
5. Alsof het een zak is, opent u het ectoderm met de chirurgische tang en plaatst u het stuk pellet zo strak mogelijk in het ectodermale deksel. Herhaal deze stap voor zoveel DLL's als gewenst (afbeelding 1D).
   OPMERKING: Snijd de stukjes van de pellet één voor één en vul de ectodermen om de 1x PBS-10% FBS-oplossing schoon te houden. De grootte van de pellet moet overeenkomen met elk ectoderm.
6. Laat het ectoderm en het mesoderm samen genezen gedurende ~ 30 minuten bij kamertemperatuur en engrafeer ze vervolgens in de embryonale gastheer. Gooi het ongebruikte ectoderm en mesoderm weg.

5. Transplantatie van het gevulde ectoderm in een gastheerembryo
 

OPMERKING: Voordat u de ectodermen transplanteert, plaatst u twee stereomicroscopen naast elkaar op een tafelblad, één voor embryomanipulatie en RL-enting. De andere is voor het behoud van de gevulde ectodermen die klaar zijn om in het embryo te worden overgebracht.

1. Selecteer het aantal gewenste eieren om de gevulde ectodermen te enten.
2. Tik met behulp van het uiteinde van een stompe tang op de eierschaal van de 22 HH-gastheerembryo's om een venster te openen. Identificeer het luchtmembraan en verwijder het met behulp van een fijne chirurgische tang volledig.
3. Open de vruchtzak bij de voorpoot om de rechterflank van het embryo bloot te leggen. Open alleen het bedrag dat nodig is om de procedure uit te voeren.
4. Geleid door de voorpootpositie, voer wondkrabben uit met een wolfraamnaald (zie Tabel met materialen) tot de lengte van 2-3 somites, waarbij het mesoderm enigszins wordt beschadigd totdat het bloedt.
5. Breng individueel een gevuld ectoderm (RL) over in het kuikenembryo en plaats de basis van de recombinante ledemaat over de somietwond.
   OPMERKING: RL-overdracht kan worden gedaan met een plastic pipet of met een schuin spleetmes.
6. Bevestig de RL correct met twee stukken palladiumdraad met een diameter van 0,025 mm en een lengte van 0,5-1 mm (zie Tabel met materialen). Lijn de basis van de RL uit met de wond om ervoor te zorgen dat deze aan de flank van het gastheerembryo wordt bevestigd en gevasculariseerd (figuur 1E).
7. Sluit het raam af met tape en breng het ei terug naar de broedmachine. Verzamel de embryo's op de gewenste tijdstippen voor analyse.

Resultaten

Het herkennen van een goed uitgevoerde recombinante ledemaat
Na het enten werden de gemanipuleerde embryo's teruggebracht naar de couveuse om de RL te laten ontwikkelen. De incubatietijd correleerde met de vereisten van het experiment. Niettemin kan de RL gemakkelijk worden onderscheiden na 12 uur implantatie. Om te bepalen of de implantatie adequaat was, werd de RL waargenomen als een uitstulping die stevig was bevestigd aan de mesodermale wand van het donorsembryo (figuur 2A

Discussie

Over het algemeen kan het RL-protocol worden onderverdeeld in vijf stappen: (1) embryo-incubatie, (2) het verkrijgen van mesodermale cellen van ledematen om de ectodermen te vullen, (3) het verkrijgen van de ectodermen, (4) het assembleren van mesodermale cellen in de ectodermale dekens en (5) transplantatie van de gevulde ectodermen in de gastheerembryo's. De belangrijkste beperking van de RL-techniek is het lange, gedetailleerde protocol, dat veel kritieke punten heeft die geduld vereisen om correct te presteren. Om he...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Alcian Blue 8GX	Sigma	A5268
Angled slit knife	Alcon	2.75mm DB
Blunt forceps	Fine Science Tools	11052-10
Collagenase type IV	Gibco	1704-019
DMEM-HG	Sigma	D5796
Egg incubator	Incumatic de Mexico	Incumatic 1000
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000069
Fine surgical forceps	Fine Science Tools	9115-10
Hanks Balanced Salt Solution	Sigma	H6648
Microcentrifuge	Eppendorf	5417R
Micropipet	NA	NA
Palladium wire	GoodFellow	7440 05-3
Petri dish	Nest	705001
Pippette	crmglobe	PF1016
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi DV4
Tape	NA	NA
Trypsin porcine	Merck	9002 07-7
Tungsten needle	GoodFellow	E74-15096/01