Recombinante ledematen zijn een krachtig experimenteel model dat het mogelijk maakt om het proces van celdifferentiatie en het genereren van patronen onder invloed van embryonale signalen te bestuderen. Dit protocol presenteert een gedetailleerde methode voor het genereren van recombinante ledematen met kippen ledemaat-mesodermale cellen, aanpasbaar aan andere celtypen verkregen uit verschillende organismen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Kip recombinante ledematen test om morfogenese, patroonvorming en vroege stappen in celdifferentiatie te begrijpen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Celdifferentiatie is het verfijnde proces van celverbintenis dat leidt tot de vorming van verschillende gespecialiseerde celtypen tijdens de oprichting van zich ontwikkelende weefsels en organen. Dit proces wordt actief in stand gehouden op volwassen leeftijd. Celdifferentiatie is een continu proces tijdens de ontwikkeling en homeostase van organen. Het begrijpen van de vroege stappen van celdifferentiatie is essentieel om andere complexe processen zoals morfogenese te kennen. Recombinante kippenledematen zijn dus een experimenteel model dat de studie van celdifferentiatie en patroongeneratie onder embryonale patroonsignalen mogelijk maakt. Dit experimentele model imiteert een in vivo omgeving; het assembleert gereaggregateerde cellen tot een ectodermale bedekking verkregen uit een vroege ledemaatknop. Later worden ectodermen overgebracht en geïmplanteerd in een kuikenembryoreceptor om de ontwikkeling ervan mogelijk te maken. Deze test werd voornamelijk gebruikt om mesodermale ledemaatknopcellen te evalueren; het kan echter worden toegepast op andere stam- of voorlopercellen van andere organismen.
Inleiding
De gewervelde ledemaat is een formidabel model voor het bestuderen van celdifferentiatie, celproliferatie, celdood, patroonvorming en morfogenese 1,2. Tijdens de ontwikkeling komen ledematen tevoorschijn als uitstulpingen van de cellen die zijn afgeleid van lateraal plaat mesoderm1. Ledemaatknoppen bestaan uit een centrale kern van mesodermale cellen bedekt met een ectoderm. Uit deze vroege structuur komt een geheel en goed gevormd ledemaat tevoorschijn. Nadat de ledemaatknop ontstaat, worden drie assen herkend: (1) de proximo-distale as ([PD] schouder tot vingers), (2) de dorso-ventral....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dit onderzoek werd beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Review Board for the Care and Use of Laboratory Animals van het Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Mexico City, Mexico). Een schematisch stroomdiagram van de algemene stappen van dit protocol is weergegeven in figuur 1A.
1. Embryo-incubatie en bepaling van de levensvatbaarheid
- Broed bevruchte kippeneieren uit bij 38 °C en 60% relatieve vochtigheid gedurende ongeveer drie en een halve dag totdat ze het 22 HH-stadium bereiken (volgens Hamilton en Hamburger, 1951)
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het herkennen van een goed uitgevoerde recombinante ledemaat
Na het enten werden de gemanipuleerde embryo's teruggebracht naar de couveuse om de RL te laten ontwikkelen. De incubatietijd correleerde met de vereisten van het experiment. Niettemin kan de RL gemakkelijk worden onderscheiden na 12 uur implantatie. Om te bepalen of de implantatie adequaat was, werd de RL waargenomen als een uitstulping die stevig was bevestigd aan de mesodermale wand van het donorsembryo (figuur 2A
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Over het algemeen kan het RL-protocol worden onderverdeeld in vijf stappen: (1) embryo-incubatie, (2) het verkrijgen van mesodermale cellen van ledematen om de ectodermen te vullen, (3) het verkrijgen van de ectodermen, (4) het assembleren van mesodermale cellen in de ectodermale dekens en (5) transplantatie van de gevulde ectodermen in de gastheerembryo's. De belangrijkste beperking van de RL-techniek is het lange, gedetailleerde protocol, dat veel kritieke punten heeft die geduld vereisen om correct te presteren. Om he.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We danken Estefania Garay-Pacheco voor de beelden in figuur 2 en Maria Valeria Chimal-Montes de Oca voor het artwork. Dit werk werd ondersteund door de Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [subsidienummers IN211117 en IN213314] en Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [subsidienummer 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] toegekend aan JC-M. JC M-L ontving een postdoctoraal mandaat van de Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A5268 | |
| Angled slit knife | Alcon | 2.75mm DB | |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Collagenase type IV | Gibco | 1704-019 | |
| DMEM-HG | Sigma | D5796 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000069 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma | H6648 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Micropipet | NA | NA | |
| Palladium wire | GoodFellow | 7440 05-3 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Pippette | crmglobe | PF1016 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Trypsin porcine | Merck | 9002 07-7 | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
Referenties
- Malashichev, Y., Christ, B., Pröls, F. Avian pelvis originates from lateral plate mesoderm and its development requires signals from both ectoderm and paraxial mesoderm. Cell and Tissue Research. 331 (3), 595-604 (2008).
- Mahmood, R., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
