De geweekte kraaltest omvat gerichte toediening van testreagens op elk ontwikkelingstijdpunt om de regulatie van celdifferentiatie en morfogenese te bestuderen. Een gedetailleerd protocol, toepasbaar op elk proefdiermodel, voor het bereiden van drie verschillende soorten geweekte kralen en het implanteren hiervan in de interdigit van een kippenembryo wordt gepresenteerd.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Analyse van celdifferentiatie, morfogenese en patronen tijdens kippenembrogenese met behulp van de soaked-bead assay
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Een veelheid aan genetische programma's wordt geactiveerd tijdens de embryonale ontwikkeling die celdifferentiatie orkestreert om een verbazingwekkende diversiteit aan somatische cellen, weefsels en organen te genereren. De precieze activering van deze genetische programma's wordt gereguleerd door morfogenen, diffuusibele moleculen die het lot van cellen op verschillende drempels sturen. Begrijpen hoe genetische activering morfogenese coördineert, vereist de studie van lokale interacties die tijdens de ontwikkeling door morfogenen worden geactiveerd. Het gebruik van kralen gedrenkt in eiwitten of geneesmiddelen die in verschillende regio's van het embryo zijn geïmplanteerd, maakt het mogelijk om de rol van specifieke moleculen bij het vaststellen van cijfers en andere ontwikkelingsprocessen te bestuderen. Deze experimentele techniek geeft informatie over de controle van celinductie, cel lot en patroonvorming. Deze geweekte kraaltest is dus een uiterst krachtig en waardevol experimenteel hulpmiddel dat van toepassing is op andere embryonale modellen.
Inleiding
Doorbraken in de moleculaire mechanismen die genexpressie tijdens de embryonale ontwikkeling regelen, hebben ons in staat gesteld te begrijpen hoe het lot van cellen wordt bepaald. Toewijding aan verschillende cellijnen vindt plaats zodra cellen beginnen met de moleculaire expressie van transcriptiefactoren1. Dit expressiepatroon is sterk gecoördineerd in ruimte en tijd en stuurt daardoor de vorming, positionering en patroonvorming van cellen, weefsels en organen 1,2,3,4,5. Embryonale inductie is het proces waarbij cellen worden toegewijd aan specifieke afstammingslijnen door hiërarchieën vast te stellen die de potentialiteit van cellen beperken, waaronder zelfs het genereren van het basislichaamsplan zoals gebeurt met de Spemann-organisator 6,7. De blastopore dorsale lip induceert een tweede embryonale as in een gastheerembryo 8,9. Tegenwoordig is het, met behulp van enten en andere klassieke experimenten in combinatie met moleculaire benaderingen, bekend dat verschillende transcriptiefactoren en groeifactoren functioneren om embryonale inductie in de Spemann-organisator10 te sturen. Experimentele manipulatie is dus een belangrijk hulpmiddel om celdifferentiatie, morfogenese en patroonprocessen tijdens embryogenese te begrijpen.
Interessant is dat in embryonale systemen waar weefseltransplantatie moeilijk is of wanneer de inductoren al bekend zijn, dragers worden gebruikt om moleculen af te leveren (bijv. Eiwitten, chemicaliën, toxines, enz.) om celdifferentiatie, morfogenese en zelfs patronen te reguleren. Een dergelijk dragersysteem omvat het implanteren van kralen gedrenkt in een specifiek molecuul in een experimenteel modelorganisme op elk ontwikkelingstijdpunt om het effect van het genoemde reagens te bepalen of de differentiatie van het genoemde model te sturen. Bijvoorbeeld, door retinoïnezuur (RA) -gedrenkte kralen in de knop van de kippenvleugel ledemaat te implanteren, toonden Cheryl Tickle et al. (1985) aan dat RA de expressie van sonische egel induceert in de zone van polariserende activiteit (ZPA) 11,12. Dezelfde experimentele strategie werd gebruikt om te ontdekken dat RA de asymmetrie van somites en celdood in de ledemaatknop regelt tijdens de ontwikkeling van cijfers en in andere embryonale ledemaatgebieden 13,14,15. Andere factoren, voornamelijk eiwitten (bijv. Fibroblastgroeifactoren [FGF], transformerende groeifactor-bèta [TGF-ß]) zijn gebruikt om ledematen in de flanken van vroege embryo's en nieuwe cijfers in het interdigitale gebied te induceren, respectievelijk 16,17,18,19,20,21 . Deze experimenten bewijzen de kracht en het nut van deze techniek voor het bepalen van het stadium van toewijding of competentie van weefsels of groepen cellen die aan de moleculen worden blootgesteld.
In dit protocol diende de kuikenpoot in het stadium van cijfervorming als het experimentele model om stap voor stap te presenteren hoe de geweekte kralen moeten worden voorbereid en geïmplanteerd. Deze experimentele tool is echter niet beperkt tot deze toepassing, maar kan worden gebruikt in elk experimenteel diermodel en elk tijdspunt in vitro en in vivo om inductie, differentiatie, celdood en patroonvorming te bestuderen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dit onderzoek werd beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Review Board for the Care and Use of Laboratory Animals van het Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Mexico City, Mexico).
1. Ei-incubatie en embryostadiëring
OPMERKING: Bevruchte kippeneieren kunnen worden verkregen van lokale boerderijen. Bevruchte White Leghorn kippeneieren worden het meest gebruikt. Bewaar de vers bevruchte kippeneieren bij 15 °C gedurende maximaal 1 week voorafgaand aan de incubatie.
- Broed de bevruchte kippeneieren verticaal uit met de puntige kant naar beneden in een bevochtigde incubator bij 38 °C en 70% relatieve vochtigheid totdat ze het stadium van 28 HH bereiken (ongeveer 5,5 dagen volgens Hamilton en Hamburger, 1951)22. Draai de eieren tijdens de incubatie om te voorkomen dat het embryo zich aan het schaalmembraan hecht.
OPMERKING: De keuze van de ontwikkelingsfase wordt bepaald door de experimentele doelstellingen. In dit geval is de 28 HH-fase optimaal voor interdigit-kraalimplantatie om een ectopisch cijfer te induceren of celdood te bevorderen. - Haal de eieren uit de broedmachine, veeg ze uit met 70% ethanol en laat ze aan de lucht drogen. Desinfecteer het werkgebied, microscopen en instrumenten met 70% ethanol.
- Kaars het ei om bloedvaten te identificeren en het embryo te lokaliseren. Gooi eieren weg die geen embryo hebben.
- Gebruik het uiteinde van een niet-getande tang, open een raam in ongeveer vijf eieren door op het stompe uiteinde van een ei te tikken en verwijder een 1 cm2-gedeelte van de schaal met de tang.
- Breng het ei over in een doos of plastic houder en plaats het onder de stereomicroscoop. Verwijder het luchtmembraan door het te doorboren en eruit te trekken met een fijne chirurgische tang. Verwijder elk klein stukje eierschaal dat in contact kan komen met het embryo.
OPMERKING: Het luchtmembraan is het witte, ondoorzichtige membraan dat onmiddellijk na het venster van het ei wordt waargenomen. - Observeer onder de microscoop terwijl u de vruchtzak iets opent en scheurt met behulp van de fijne chirurgische tang. Zorg ervoor dat u de vasculatuur van het chorioallantoïsche membraan niet beschadigt.
OPMERKING: Het amnion is het transparante membraan dicht rond het embryo dat het insluit in vruchtwater. - Voer de embryo's in ovo in om te bepalen of ze zich in het gewenste stadium bevinden. Embryo's in eerdere stadia kunnen worden teruggebracht naar de incubator na het afdichten van het eierschaalvenster met tape.
2. Kraalbereiding
OPMERKING: Afhankelijk van het experimentele doel en de behandeling in kwestie, kunnen alternatieve kralentypen (bijv. Affi-Gel, AG1-X2, heparine) geschikter zijn. Affi-Gel-kralen zijn optimaal voor eiwitten (bijv. TGF-ß1), terwijl heparineparineparels ideaal zijn voor groeifactoren (bijv. FGFs, WNT) en AG1-X2-kralen voor chemicaliën opgelost in organische oplosmiddelen (bijv. DMSO).
- Bereiding van Affi-Gel en heparinekralen
- Knip een vierkant parafilm om in een petrischaaltje van 45 mm te passen. Plaats de parafilm over de bodem van de petrischaal om deze af te dekken en bevestig deze aan de onderkant van de petrischaal door op elk hoekpuntje te duwen met behulp van het uiteinde van de niet-getande tang. Gereserveerd.
- Breng met een pipet of spatel de kralen over in een microcentrifugebuis en was ze tweemaal in 1x PBS door te bezinken en te pipetteren.
- Breng ~40-50 kralen met een micropipette over naar het midden van de geparafilmde petrischaal uit stap 1.
- Selecteer met behulp van de microscoop ~ 30 Affi-Gel- of heparineparel met een diameter van ~ 100 μm voor gebruik. Gebruik een microscoop oculair dradenkruis om de kralen te dimensioneren of gebruik de derde interdigit van een HH 28 embryo als referentie; de kraal moet kleiner zijn dan de interdigit.
- Verwijder voorzichtig zoveel mogelijk van de overtollige PBS rond de kralen en week ze in 2-5 μL van de behandelingsoplossing. Zorg ervoor dat de oplossing de kralen volledig dekt.
- Bereid tegelijkertijd controleparels door te weken in een oplossing die dezelfde hoeveelheid vehikel bevat als gebruikt in de experimentele behandelingsoplossing.
OPMERKING: Concentraties moeten voor elke behandeling worden berekend volgens het experiment. Gebruik de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen bij het hanteren van potentieel schadelijke reagentia. - Incubeer de kralen in de oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Om te voorkomen dat de kralen tijdens de incubatie uitdrogen, pipetteer je een paar druppels 1x PBS of water rond de kralen om de lokale atmosfeer te bevochtigen en bedek je de schaal met parafilm om de verdamping te vertragen.
- Plaats de petrischaal op ijs en implanteer de kralen binnen dezelfde dag.
- AG 1-X2 kraalbereiding
- Knip een vierkant parafilm om in een petrischaaltje van 45 mm te passen. Bedek de bodem van de petrischaal met parafilm en bevestig door op elk hoekpuntje te duwen met behulp van het uiteinde van een niet-getande tang. Gereserveerd.
- Gebruik een spatel om de AG 1-X2 kralen over te brengen in een microcentrifugebuis. Voeg 30-50 μL van de behandelingsoplossing toe in de gewenste eindconcentratie.
- Incubateer tegelijkertijd de controleparels in een oplossing met het voertuig alleen, bereid zonder de experimentele chemische stof of het eiwit van belang.
- Incubeer de kralen gedurende 20 minuten terwijl je langzaam schudt bij kamertemperatuur. Wikkel de microcentrifugebuizen met folie om te beschermen tegen licht tijdens alle incubatie, aangezien veel van deze moleculen lichtgevoelig zijn
- Verwijder zoveel mogelijk van de oplossing met behulp van een pipet en bevlek met 2% fenolrood opgelost in water bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten met milde agitatie in een vortex.
OPMERKING: Het verven van de transparante AG 1-X2 kralen vergemakkelijkt hun implantatie in het embryo. - Verwijder de 2% fenolrood en was de kralen twee keer in 1x PBS om overtollige kleurstof te verwijderen.
- Breng met een micropipettepunt ~40-50 AG 1-X2 kralen over naar het midden van de met parafilm bedekte petrischaal die in stap 1 is bereid en week deze in 5 μL van 1x PBS. Selecteer onder de microscoop ongeveer 30 kralen met een diameter van ~ 100 μm. Gooi de ongebruikte kralen weg.
- Kralen zijn klaar om te implanteren. Zorg ervoor dat de kralen tijdens de implantatie in de PBS worden ondergedompeld door een paar druppels van 1x PBS of water rond de kralen te pipetteren om de lokale atmosfeer te bevochtigen en / of de schaal te bedekken met parafilm om de verdamping te vertragen.
3. Embryomanipulatie en interdigit-implantatie
- Voordat u de embryo's manipuleert, plaatst u twee stereomicroscopen naast elkaar op een bankje. De ene is voor embryomanipulatie en kralenimplantatie en de andere is voor het houden van de behandelde kralen die klaar zijn om in het embryo te implanteren.
- Maak met behulp van een niet-getande tang een venster in de resterende eieren zoals beschreven in de sectie ei-incubatie en embryostadiëring.
- Open onder de microscoop de vruchtzak door het vruchtwatermembraan te scheuren met een fijne chirurgische tang in de buurt van de rechterachterpoot alleen met de hoeveelheid die nodig is om de procedure te volbrengen (d.w.z. zo min mogelijk).
- Houd met behulp van een fijne tang het embryo bij het vruchtwatermembraan om de rechterachterpoot bloot te leggen. Maak met behulp van een fijne wolfraamnaald een gat gecentreerd in het distale-grootste deel van de derde interdigit van de achterpoot.
- Zonder het embryo en de blootgestelde hindlimb vrij te geven, neemt u een behandelde kraal uit de andere microscoop met behulp van een van de uiteinden van de tang. De tang moet in de open positie staan zodat één kraal zich aan de tangpunt kan hechten.
- Breng de kraal over in het kuikenembryo in de buurt van de achterpoot en plaats deze bovenop het interdigit-gat.
- Sluit de tang om druk uit te oefenen op de kraal totdat deze in het gat komt.
- Laat het embryo los en sluit het eierschaalvenster af met tape.
- Breng de eieren terug naar de broedmachine totdat ze het vereiste stadium hebben bereikt. Herhaal de procedure totdat het vereiste aantal gemanipuleerde embryo's is bereikt. Het is absoluut noodzakelijk om ervoor te zorgen dat de kralen op geen enkel moment uitdrogen.
OPMERKING: Om een volledige ectopische vinger te observeren, incubeer gedurende ~ 72 uur na de implantatie van de kraal. Daarentegen worden vroege differentiatiegenen (bijv. Sox9) ~ 30 minuten na de implantatie van een met TGF-ß1 doordrenkte kraal tot expressie gebracht.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Geweekte kralen gebruiken om het celgedrag in de embryonale kuiken ledemaat te evalueren
Om de werkzaamheid van deze test te garanderen, moet de kraal consequent en precies op de juiste locatie worden geplaatst; in dit geval het distale-grootste deel van de derde interdigit onder de apicale ectodermale richel AER (figuur 1A). Door deze positionering kan het betreffende molecuul zich gelijkmatig verspreiden over het interdigitale weefsel. Bovendien bevat de zone onder de A...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het belangrijkste voordeel van de experimentele tool die in dit protocol wordt beschreven, is de mogelijkheid om de tijd en locatie van de blootstelling aan kralen gedrenkt in een bepaald experimenteel molecuul te regelen. Het combineren van de juiste positionering met een nauwkeurige ontwikkelingstiming biedt enorme mogelijkheden om celdifferentiatieprocessen te bestuderen. Het uitvoeren van deze experimenten in ongedifferentieerd weefsel maakt het mogelijk om de eerste cruciale gebeurtenissen in cellulaire afstamming t...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [subsidienummers IN211117 en IN213314] en Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [subsidienummer 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] toegekend aan JC-M. JC M-L ontving een postdoctoraal mandaat van de Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887). De auteurs waarderen de hulp van Lic. Lucia Brito van Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM in de voorbereiding referenties van dit manuscript.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Affi-Gel Blue Gel beads | Bio-Rad | 153-7302 | |
| AG1-X2 beads | Bio-Rad | 1400123 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Heparine Sepharose beads | Abcam | ab193268 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
Referenties
- Stapornwongkul, K. S., Vincent, J. P. Generation of extracellular morphogen gradients: the case for diffusion. Nature Reviews Genetics. 22 (6), 393-411 (2021).
- Rogers, K. W., Schier, A. F. Morphogen gradients: from generation to interpretation. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 27, 377-407 (2011).
- Irizarry, J., Stathopoulos, A. Dynamic patterning by morphogens illuminated by cis-regulatory studies. Development. 148 (2), 196113(2021).
- Capek, D., Müller, P. Positional information and tissue scaling during development and regeneration. Development. 146 (24), (2019).
- Marín-Llera, J. C., Garciadiego-Cázares, D., Chimal-Monroy, J. Understanding the cellular and molecular mechanisms that control early cell fate decisions during appendicular skeletogenesis. Frontiers in Genetics. 10, 977(2019).
- Gurdon, J. B. Embryonic induction--molecular prospects. Development. 99 (3), 285-306 (1987).
- Bouwmeester, T. The Spemann-Mangold organizer: the control of fate specification and morphogenetic rearrangements during gastrulation in Xenopus. International Journal of Developmental Biology. 45 (1), 251-258 (2001).
- Piccolo, S., Sasai, Y., Lu, B., De Robertis, E. M. Dorsoventral patterning in Xenopus: inhibition of ventral signals by direct binding of chordin to BMP-4. Cell. 86 (4), 589-598 (1996).
- Cho, K. W., Blumberg, B., Steinbeisser, H., De Robertis, E. M. Molecular nature of Spemann's organizer: the role of the Xenopus homeobox gene goosecoid. Cell. 67 (6), 1111-1120 (1991).
- Thisse, B., Thisse, C. Formation of the vertebrate embryo: Moving beyond the Spemann organizer. Seminars in Cell & Development Biology. 42, 94-102 (2015).
- Eichele, G., Tickle, C., Alberts, B. M. Microcontrolled release of biologically active compounds in chick embryos: beads of 200-microns diameter for the local release of retinoids. Analytical Biochemistry. 142 (2), 542-555 (1984).
- Tickle, C., Lee, J., Eichele, G. A quantitative analysis of the effect of all-trans-retinoic acid on the pattern of chick wing development. Developmental Biology. 109 (1), 82-95 (1985).
- Vermot, J., Pourquié, O. Retinoic acid coordinates somitogenesis and left-right patterning in vertebrate embryos. Nature. 435 (7039), 215-220 (2005).
- Rodriguez-Leon, J., et al. Retinoic acid regulates programmed cell death through BMP signalling. Nature Cell Biology. 1 (2), 125-126 (1999).
- Rodriguez-Guzman, M., et al. Tendon-muscle crosstalk controls muscle bellies morphogenesis, which is mediated by cell death and retinoic acid signaling. Developmental Biology. 302 (1), 267-280 (2007).
- Cohn, M. J., Izpisúa-Belmonte, J. C., Abud, H., Heath, J. K., Tickle, C. Fibroblast growth factors induce additional limb development from the flank of chick embryos. Cell. 80 (5), 739-746 (1995).
- Ohuchi, H., et al. An additional limb can be induced from the flank of the chick embryo by FGF4. Biochemical and Biophysical Research Communications. 209 (3), 809-816 (1995).
- Abu-Elmagd, M., Goljanek Whysall, K., Wheeler, G., Münsterberg, A. Sprouty2 mediated tuning of signalling is essential for somite myogenesis. BMC Medical Genomics. 8, Suppl 1 8(2015).
- Gañan, Y., Macias, D., Duterque-Coquillaud, M., Ros, M. A., Hurle, J. M. Role of TGF beta s and BMPs as signals controlling the position of the digits and the areas of interdigital cell death in the developing chick limb autopod. Development. 122 (8), 2349-2357 (1996).
- Merino, R., et al. Morphogenesis of digits in the avian limb is controlled by FGFs, TGFbetas, and noggin through BMP signaling. Developmental Biology. 200 (1), 35-45 (1998).
- Montero, J. A., Lorda-Diez, C. I., Gañan, Y., Macias, D., Hurle, J. M. Activin/TGFbeta and BMP crosstalk determines digit chondrogenesis. Developmental Biology. 321 (2), 343-356 (2008).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Díaz-Hernández, M. E., Bustamante, M., Galván-Hernández, C. I., Chimal-Monroy, J. Irx1 and Irx2 are coordinately expressed and regulated by retinoic acid, TGFβ and FGF signaling during chick hindlimb development. PLoS One. 8 (3), 58549(2013).
- Díaz-Hernández, M. E., Rios-Flores, A. J., Abarca-Buis, R. F., Bustamante, M., Chimal-Monroy, J. Molecular control of interdigital cell death and cell differentiation by retinoic acid during digit development. Journal of Developmental Biology. 2 (2), 138-157 (2014).
- Chimal-Monroy, J., et al. Analysis of the molecular cascade responsible for mesodermal limb chondrogenesis: Sox genes and BMP signaling. Developmental Biology. 257 (2), 292-301 (2003).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
