Bereiding van enkelvoudige somietexplantaten van zebravisembryo's

Samenvatting

We presenteren een protocol voor het isoleren van enkelvoudige somieten uit zebravisembryo's, waarvan de dynamiek gedurende enkele uren in kweek kan worden gevolgd door fluorescentie time-lapse-microscopie, en zo een methodologie bieden om vormveranderingen op weefselschaal te kwantificeren met een resolutie van één cel.

Samenvatting

De lichaamsas van embryo's van gewervelde dieren wordt periodiek onderverdeeld in 3D meercellige eenheden die somieten worden genoemd. Terwijl genetische oscillaties en moleculaire voorpatronen de initiële lengteschaal van somieten bepalen, zijn mechanische processen betrokken bij het bepalen van hun uiteindelijke grootte en vorm. Om de intrinsieke materiaaleigenschappen van sorieten beter te begrijpen, wordt een methode ontwikkeld om enkelvoudige somietexplantaten uit zebravisembryo's te kweken. Enkelvoudige somieten worden geïsoleerd door eerst de huid van embryo's te verwijderen, gevolgd door dooierverwijdering en sequentiële excisie van naburige weefsels. Met behulp van transgene embryo's kan de verdeling van verschillende subcellulaire structuren worden waargenomen door middel van fluorescerende time-lapse-microscopie. De dynamiek van geëxplanteerde somieten kan gedurende enkele uren worden gevolgd, waardoor een experimenteel kader wordt geboden voor het bestuderen van vormveranderingen op weefselschaal met een resolutie van één cel. Deze benadering maakt directe mechanische manipulatie van somieten mogelijk, waardoor de materiaaleigenschappen van het weefsel kunnen worden ontleed. Ten slotte kan de hier beschreven techniek gemakkelijk worden uitgebreid voor het explanten van andere weefsels, zoals het notochord, de neurale plaat en het mesoderm van de laterale plaat.

Inleiding

Een groot deel van het volwassen bewegingsapparaat van gewervelde dieren komt voort uit embryonale somieten, die zich op een periodieke en ritmische manier vormen langs de lichaamsas van embryo's ^1,2. Somieten zijn driedimensionale (3D) meercellige eenheden die doorgaans bestaan uit een binnenkern van mesenchymale cellen en een perifere epitheellaag omgeven door een fibronectinerijke extracellulaire matrix³. De morfologie van somieten, d.w.z. hun grootte en vorm, wordt gedeeltelijk bepaald door de segmentatieklok en stroomafwaartse moleculaire prepatronen. In het afgelopen decennium is echter gebleken dat mechanische signalen en krachten ook een rol spelen bij het reguleren van de segmentatieklok⁴, naast het vergemakkelijken van somietvorming ^5,6,7 en het zorgen voor een grotere precisie van somietlengtes na de initiële somietvorming⁸.

Weefselmechanica kan direct in vivo worden bestudeerd met de beschikbaarheid van nieuwe hulpmiddelen⁹, maar om een volledig beeld te krijgen dat ten grondslag ligt aan de fysische processen, moeten tegelijkertijd de intrinsieke materiaaleigenschappen van weefsels worden bestudeerd. Het hier beschreven protocol biedt een eenvoudige benadering om enkelvoudige somieten voor te bereiden, waarvan de fysische eigenschappen van cellulaire tot weefselschaal geïsoleerd van het embryo kunnen worden bestudeerd. Hoewel er verschillende protocollen bestaan voor het voorbereiden van explantaten in vergelijkbare ontwikkelingsstadia 10,11,12,13,14, is dit voor zover wij weten het eerste protocol dat de isolatie van enkelvoudige somieten beschrijft. Het protocol is eenvoudig te implementeren en vereist alleen basisapparatuur die beschikbaar is in de meeste zebravislaboratoria die met embryo's werken.

Om de rol van mechanica bij de vorming van morfologische somieten uit elkaar te halen, is een methode ontwikkeld om single-somietexplantaten uit zebravisembryo's te kweken, die kan worden gebruikt om de intrinsieke materiaaleigenschappen van solieten te onderzoeken.

Protocol

Dit protocol omvat het gebruik van levende embryo's van gewervelde dieren die jonger zijn dan 1 dag na de bevruchting. Alle experimenten werden uitgevoerd met behulp van embryo's die afkomstig waren van vrij parende volwassenen en vallen dus onder de algemene vergunning voor dierproeven van de EPFL, verleend door de Service de la Consommation et des Affaires Vétérinaires van het kanton Vaud - Zwitserland (vergunningsnummer VD-H23).

1. Voor dissectie

1. Verkrijg embryo's uit een kruising van heterozygote transgene interesselijnen. Voor het uitplanten van twee tot drie somieten zijn meestal maar een paar embryo's nodig. In dit protocol werd één embryo gebruikt voor het explanten van één somiet.
2. Bereid 1x E3-buffer voor uit twee 50x-bouillons: voorraad 1 bevat 0,458 mM Na₂HPO₄, 0,042 mM KH₂PO₄, 4,084 mM NaCl, 0,128 mM KCl en voorraad 2 bevat 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM MgSO₄. Bereid 500 ml 1x E3-buffer voor door 480 ml gedestilleerd water te mengen met elk 10 ml van de twee 50x bouillons.
3. Als de ontleed op dezelfde dag, kweek dan embryo's op in 25 ml E3-medium in een petrischaaltje bij 33 °C tot het driesomietstadium. Als u de volgende ochtend ontleedt, kweek dan de embryo's op in E3-medium bij 28 °C tot het schildstadium voordat u ze overbrengt naar 19 °C voor nachtelijke incubatie.
4. Gebruik voor het identificeren van de afschermfase of de verschillende somietstadia een standaard laboratoriumstereomicroscoop met een instelbaar vergrotingsbereik van ongeveer 0,67x tot 4,5x.
5. Verzamel gereedschappen en reagentia die nodig zijn voor dissectie.
   1. Aliquot Leibovitz's L-15 medium in tubes van 50 ml en bewaren in de koelkast. We raden aan om hetzelfde aliquot uit de koelkast maximaal twee rondes te gebruiken.
   2. Bereid 50 ml 2% agarose in L-15 medium met behulp van een magnetische roerder en houd de temperatuur op 85 °C. Eenmaal opgelost, bewaar de oplossing bij kamertemperatuur.
   3. Bereid 25 ml 2% laagsmeltende agarose in L-15-medium met behulp van een magnetische roerder en houd de temperatuur op 85 °C. Na het oplossen de oplossing in buisjes van 1,5 ml vermalen en bij 4 °C bewaren. Dit zal worden gebruikt voor het voorbereiden van de beeldkamer.
   4. Giet gesmolten 2% agarose in een petrischaaltje van 20 mm tot een derde van de diepte van de schaal is gevuld en laat de agarose-oplossing stollen. In deze petrischaaltjes worden dissecties uitgevoerd. Bereid de petrischaaltjes met agaroselaagje ruim van tevoren voor en bewaar bij 4 °C.
   5. Zet de volgende gereedschappen in elkaar: Pasteurpipet voor het terugplaatsen van embryo's, een tang voor het dechorioneren van embryo's, een fijne tang voor het verwijderen van de huid van embryo's, een micromes voor het maken van incisies in embryo's, vuurgepolijste glazen pipet voor het overbrengen van explantaten naar de beeldkamer.
   6. Steriliseer de glazen pipet gedurende 15 minuten in 100% ethanol en spoel twee keer door 5 ml L-15 medium op en neer te pipetteren.
   7. Bereid een wimpertool voor door een wimper of haar van de wenkbrauw op een glazen capillair te plakken.
6. Gebruik een fluorescerende stereoscoop met een instelbaar vergrotingsbereik van ongeveer 0,63x tot 6,3x en standaard GFP- en RFP-filters om positieve transgene embryo's te sorteren en over te brengen naar een aparte petrischaal met E3-medium.

2. Preparaat van een enkelvoudige omietexplantatie

1. Breng 2 of 3 embryo's over naar een met agarose omhulde schaal (gemaakt in stap 1.5.4) gevuld met 10 ml L-15-medium. Zorg ervoor dat het gerecht samen met L-15 medium 30 minuten wordt voorverwarmd bij 28 °C in een couveuse voordat u embryo's terugplaatst.
2. Dechorionaat (Figuur 1 A,B) een embryo voorzichtig met een tang. Houd de chorion vast met een van de tangen en gebruik de tweede tang om de chorion dicht bij de plaats van de eerste tang te knijpen en eraan te trekken.
3. Herhaal deze stap nog een keer om het chorion wijd te openen, waarna het embryo voorzichtig naar buiten kan worden geduwd. Zorg ervoor dat het embryo niet wordt beschadigd of samengedrukt tijdens het ontchorioneren.
4. Oriënteer het embryo op de zijzijde en houd de huid tussen de kop en de staart van het embryo vast met een van de fijne tangen. Gebruik de tweede fijne tang om op de huid te knijpen dicht bij de plek waar de eerste tang nog zit.
5. Beweeg de twee tangen van elkaar af, terwijl u de huid vasthoudt, waardoor er een grote opening ontstaat. Maak een van de tangen los van de huid en verplaats deze dicht bij de plaats waar de tweede tang wordt vastgehouden en herhaal het huidverwijderingsproces totdat de huid is verwijderd in somietvormende gebieden.
   OPMERKING: Het is van cruciaal belang om de huid rond de somieten die zullen worden geëxplanteerd volledig te verwijderen, anders wordt het moeilijk om fijnere dissecties uit te voeren in de latere stappen van het protocol.
6. Gebruik een micromes om de dooier af te schrapen (Figuur 1C - explantatie met huid verwijderd en dooier afgeschraapt) en maak een reeks incisies als volgt:
   1. Snijd door het embryo met de eerste snede vóór de eerste morfologische somiet in het embryo en de tweede snede achter de meest recent gevormde somiet (Figuur 1D). Snijd nog een keer posterieur en anterieur aan somites van belang (Figuur 1E).
   2. Gebruik het micromes om de resterende dooier van de uitgeplante delen van het embryo af te schrapen. Probeer zoveel mogelijk van de dooier te verwijderen om de kans te verkleinen dat explantaten aan het micromes blijven plakken. Als dit gebeurt, gebruik dan een wimpertool om het explantaat terug naar de oplossing te verplaatsen terwijl u het micromes ondergedompeld houdt in het medium.
   3. Plaats de explantatie dorsaal en maak een snede langs de anteroposterieure as door het notochord, dicht bij somieten aan één kant (Figuur 1F,G).
   4. Neem de explantatie zonder het notochord en snijd door het mesoderm van de laterale plaat (LPM) dicht bij de somieten.
      OPMERKING: Deze stap kan worden uitgewisseld met de vorige stap, d.w.z. het werkt even goed om eerst door de LPM te snijden en vervolgens door het notochord te snijden.
7. Kies de somiet die moet worden geëxplanteerd en maak respectievelijk twee plakjes achter en voor de somiet (Figuur 1H).
8. Draai ten slotte de somiet 90° met behulp van de wimpertool om de neurale plaat te visualiseren die nog steeds aan de somiet vastzit. Maak een snede tussen de somiet en de neurale plaat, waardoor een enkele somiet vrijkomt (Figuur 1I).
   OPMERKING: De neurale plaat kan ook onmiddellijk na stap 2.6.4 worden verwijderd, d.w.z. na verwijdering van het notochord en de LPM en vóór het ontleden van een somiet van naburige somieten.

3. Beeldvorming van enkelvoudige somietexplantaten

OPMERKING: Hier wordt de procedure beschreven voor het afbeelden van single-somiet explantaten met behulp van een single-view light-sheet microscoop. Als alternatief kunnen de geëxplanteerde enkelvoudige somieten ook worden afgebeeld in een confocale microscoop, die op grotere schaal beschikbaar is, of zelfs in een breedveldmicroscoop als ze uitsluitend geïnteresseerd zijn in het volgen van de algemene morfologie van explantaten.

1. Bereid een beeldkamer als volgt voor:
   1. Vul een spuit van 1 ml met siliconenrubber. Knip een pipetpunt van 200 μl op ongeveer 1 cm afstand van de mond af en steek de spuit in de pipetpunt.
   2. Wikkel de membraanhouder handmatig in met een voorgesneden membraanstrip van gefluoreerd ethyleenpropyleen (FEP) (Figuur 2A-C) en bevestig de beeldkamer op de membraanhouder, die goed in elkaar passen (Figuur 2D).
   3. Voeg siliconenrubberformule toe langs de kruising van de kamer en het membraan en droog het een nacht, zodat het membraan aan de kamer kan blijven plakken. Verwijder de membraanhouder 1 uur voor het explantatie-experiment.
   4. Verwarm een hoeveelheid van 0,5 ml 2% laagsmeltende agarose gemaakt met L-15 medium bij 75 °C gedurende 10 min. Voeg 160 μL van de verwarmde laagsmeltende agarose toe aan het midden van de kamer en plaats een beeldvormende vorm in de agarose (Figuur 2E,F) en houd deze rechtop totdat de agarose stolt.
   5. Voeg nog eens 160 μL verwarmd laagsmeltend agarose toe aan de twee uiteinden van de vorm en breng het hele apparaat gedurende 30 minuten over op 4 °C.
   6. Voeg 600 μL L-15 medium toe aan de kamer en verwijder de vorm uit de kamer met een tang. Wacht tot de kamer met L-15 medium weer op kamertemperatuur is.
2. Breng de geëxplanteerde somiet met een gepolijste glazen pipet over door te pipetteren naar de beeldkamer en gebruik een wimper om de explantatie in het midden van de kamer te plaatsen.
3. Lijn de beeldlasers uit volgens de instructies van de fabrikant en breng de beeldkamer voorzichtig over naar de microscoop die is uitgerust met een incubatiekamer om de explantaten op 28 °C te houden.
4. Voer een tweede ronde van laseruitlijning uit met interessegebieden van de transgene lijn, gevolgd door het instellen van de gewenste z-stack, het tijdsinterval en de duur voor time-lapse-beeldvorming. Verkrijg voor dit experiment 70 z-slices met een tussenruimte van 2 μm en een frame-interval van 2 min.
5. Voer tweekleurige lightsheet-beeldvorming uit (Figuur 1J) van de explantaten met lasers van 561 nm (10% laservermogen, 100 ms belichting) en 488 nm (10% laservermogen, 100 ms belichting). In dit protocol werd het signaal verzameld met een 25x/1.1 NA-objectief en via respectievelijk 561/25 nm en 525/50-25 banddoorlaatfilters op een sCMOS-camera.

Resultaten

Explantaten maken het mogelijk om grootschalige vormveranderingen in 3D te kwantificeren. Om dit te illustreren, hebben we miet vier (N = 3) geëxplanteerd uit vroege zebravisembryo's verkregen uit een kruising tussen Utr::mCherry (Tg(actb2:mCherry-Hsa.UTRN); e119Tg) en H2B::GFP (Tg(h2az2a:h2az2a-GFP); kca6Tg) heterozygote lijnen. Utrofine is een actinebindend eiwit en de Utr::mCherry-lijn toont de verdeling van filamenteuze actinestructuren. Dit transgen werd hier gebruikt als marker voor celcontouren. H2B::GFP is een fluorescerend gelabeld histon en markeert bijgevolg de verdeling van het chromatine, waardoor een effectieve beschrijving van de nucleaire locatie en vorm wordt gegeven, evenals mitotische figuren die de celdeling benadrukken.

We beoordeelden het succes van het explantatieprotocol tijdens de beeldvorming. We hebben waargenomen dat in een somiet die tijdens dissectie is beschadigd, ofwel de integriteit van het somietweefsel wordt aangetast, waarbij veel cellen dissociëren en extruderen uit de geëxplanteerde somiet, en/of veel cellen afsterven, wat kan worden opgemerkt door de aanwezigheid van gefragmenteerde kernen in het nucleaire kanaal. Succesvolle explantaten bleven 4-6 uur gezond, waarna veranderingen in de integriteit van somiet werden waargenomen met cellen die dissocieerden van de explantatie en afstierven.

In het utrofinekanaal hebben we handmatige segmentatie van explantaten uitgevoerd in MATLAB (R2018b) op z-plakjes met een tussenruimte van elke 10 μm. We hebben in MATLAB een op maat gemaakt algoritme ontwikkeld voor segmentatie, dat gratis kan worden gedownload (https://github.com/sundar07/SomSeg). In het algoritme kunnen het bestand, het frame en de z-slice die moeten worden gesegmenteerd, worden ingesteld, gevolgd door een gebruikersprompt, waarmee handmatig een overzicht rond het interessegebied kan worden getekend. Dit werd herhaald voor meerdere z-slices en uitgezet, wat een afronding van explantaten in de tijd in 3D liet zien (Figuur 3A). Daarnaast werd ook aanvullende informatie over de weefselvorm verkregen met behulp van het nucleaire kanaal. Hiervoor gebruikten we Mastodon (versie 1.0.0-beta-19, https://github.com/mastodon-sc/mastodon), een FIJI^15-plug-in , om kerncentroïdposities te verkrijgen door middel van spotdetectie. We hebben eerst de tif-bestanden van de microscoop geconverteerd naar xml/hdf5-formaat in FIJI, waarna een nieuw project werd geopend met behulp van de Mastodon-plug-in. In de plug-in kozen we voor de optie voor spotdetectie, waarbij we een interessegebied definieerden dat de explant bedekte en het verschil van een Gauss-detector met een diameter van 5 μm en een kwaliteitsfactor van 25 gebruikten voor het detecteren van vlekken. Vervolgens brachten we de posities van het kerncentrum over naar MATLAB en gebruikten we een ingebouwde functie (convhull) om een convexe romp te verkrijgen (Figuur 3B), die de geometrie van de explantatie kenmerkte. Dit toonde op dezelfde manier afronding van explantaten in de tijd (Figuur 3B). De kerngegevens maken het bovendien mogelijk om celbewegingen te kwantificeren door tracking in 3D en een verandering in celaantal in de loop van de tijd. Aan de andere kant maakt het utrofinekanaal kwantificering mogelijk van veranderingen in celvormen naarmate explantaten ronder worden. Samen zijn deze parameters waardevol voor het karakteriseren van intrinsieke materiaaleigenschappen van somieten, wat helpt bij het ontwikkelen van effectieve fysische beschrijvingen van vormveranderingen op weefselschaal.

Explantaten maken het ook mogelijk om contactspanningen met naburige weefsels op een kwantitatieve manier te karakteriseren. Om dit te illustreren, hebben we handmatig twee somieten geïsoleerd en dicht bij elkaar geplaatst en hun dynamiek geobserveerd (N = 2). Voor dit experiment werd de oriëntatie van de somieten ten opzichte van de in vivo lichaamsassen niet gevolgd. Interessant is dat in de loop van de tijd de geëxplanteerde somieten zich aan elkaar hechtten langs één oppervlak, terwijl de vrije oppervlakken, d.w.z. gebieden weg van de contactplaats, naar boven werden afgerond (Figuur 4). Dit suggereert dat de kleefkrachten de spanningen overwinnen die worden veroorzaakt door oppervlaktespanning op contactplaatsen in explantaten. Dit kan verder worden gekarakteriseerd door vormveranderingen te volgen zoals hierboven beschreven en door contacthoeken tussen de twee weefsels in de loop van de tijd in 3D te kwantificeren. De explantaten bieden dus een aantrekkelijk systeem voor het kwantificeren van concurrerende krachten in actie die leiden tot specifieke weefselvormen, waarvan de implicaties vervolgens in vivo kunnen worden onderzocht.

Figuur 1: Bereiding van enkelvoudige somiete explantaten. Het zebravisembryo (A) wordt eerst gedechorioneerd (B), gevolgd door verwijdering van huid en dooier (C). Het somiet-bevattende gebied van het embryo wordt vervolgens geselecteerd door de rest van de weefsels (D, E) te verwijderen. Gebieden rond de somiet van belang worden vervolgens serieel verwijderd (F-H) om uiteindelijk een enkele somiet (I) te isoleren, gevolgd door time-lapse-beeldvorming met behulp van een light-sheet microscoop (middelste z-sectie van somiet hier getoond) (J). Afkortingen: S = somiet; N = notochord; LPM = mesoderm van de laterale plaat; A = anterieur; P = posterieur. Stippellijnen geven de snijposities aan. Schaalbalk = 50 μm in alle panelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Assemblage van de beeldkamer met lichte vellen. (A-D) Een FEP-membraanstrip (afmetingen in (B)) wordt om de membraanhouder gewikkeld, op de beeldkamer gemonteerd en het membraan wordt op de beeldkamer gelijmd. (E-F) De volgende dag wordt de membraanhouder verwijderd en wordt een beeldvormende mal (afmetingen in (E)) in het midden van de beeldkamer geplaatst in laagsmeltende agarose. Het hele apparaat wordt gedurende 30 minuten op 4 °C gehouden, waarna de mal wordt verwijderd en de kamer met de trog wordt gebruikt voor beeldvorming van explantaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: 3D-analyse van weefselvormen. (A) Celcontouren werden gevisualiseerd met fluorescerend gelabeld utrofine (Utr::mCherry) en kernen werden gevisualiseerd met fluorescerend gelabeld histon (H2B::GFP). De contouren van de explantatie werden handmatig gesegmenteerd op meerdere dieptes met behulp van MATLAB en hier getoond. (B) Kernen (rood) werden gedetecteerd in dezelfde explantatie met behulp van Mastodon, een FIJI-plug-in, en onderworpen aan een convexe romp (cyaan), die informatie geeft over de geometrie van de explantatie. Opmerking Het naar boven afronden van explantaten is duidelijk in beide analyses. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Geëxplanteerde somieten hechten zich aan elkaar. Twee somieten geïsoleerd uit embryo's en handmatig dicht bij elkaar geplaatst, hebben de neiging zich na verloop van tijd te hechten (N = 2). Meerdere z-plakjes met een frame-interval van 2 minuten werden verkregen met behulp van een light-sheet microscoop en middelste secties van somieten van geselecteerde tijdstippen worden hier getoond. Celcontouren werden gevisualiseerd met fluorescerend gelabeld Utrophin (Utr::mCherry). Schaalbalk = 25 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussie

Het somitogeneseveld werd gedomineerd door studies naar de rol van de segmentatieklok bij het bepalen van segmentlengtes tijdens de embryonale ontwikkeling. Het is echter net zo belangrijk om de rol van weefselmechanica in overweging te nemen bij het bepalen van de uiteindelijke somietmorfologieën. Het hier beschreven protocol maakt het mogelijk om alleenstaande sorieten te explanten, waarvan de intrinsieke fysische eigenschappen geïsoleerd van het embryo kunnen worden bestudeerd. De handmatige voorbereiding beperkt echter het aantal somieten dat doorgaans wordt voorbereid tot vier tot zes per beeldvormingssessie. Aangezien het protocol zorgvuldige fijne dissecties van verschillende weefsels in embryo's omvat zonder het gebruik van enzymen om weefselverwijdering te vergemakkelijken, kan het een paar weken duren om het dissectieproces onder de knie te krijgen. In onze handen omvatten de kritieke stappen in het protocol het zorgvuldig verwijderen van huid en dooier van de explantaten, wat voorkomt dat explantaten in verschillende stadia van het protocol aan de gebruikte gereedschappen blijven kleven, wat op zijn beurt gemakkelijkere dissecties mogelijk maakt om weefsels rond een somiet serieel te verwijderen.

Het dissectieprotocol kan worden gestopt bij tussenstappen om somieten te verkrijgen die aan slechts één van de omliggende weefsels zijn gehecht of om explantaten van groepen somieten te verkrijgen. Dit biedt een krachtige methode om weefsels serieel te strippen en de impact van naburige weefsels te bestuderen bij het vergemakkelijken van vormveranderingen in somieten of in de naburige weefsels. Aan de andere kant kunnen met behulp van dit protocol individuele geëxplanteerde weefsels worden toegestaan om zich te hechten en zichzelf mechanisch te organiseren, zoals wordt aangetoond door twee geëxplanteerde somieten dicht bij elkaar te plaatsen.

Explantaten die volgens deze methode zijn bereid, vereisen geen toegevoegde ingrediënten in de buffer of beperkingen om overleving gedurende perioden tot enkele uren te garanderen. Men kan zich echter voorstellen om ze in hydrogels te kweken en hun dynamiek te volgen in aanwezigheid van externe beperkingen, die als model zouden kunnen dienen voor de contactspanningen die somieten in vivo tegenkomen. Bovendien maken explantaten het mogelijk om hun materiaaleigenschappen direct te onderzoeken door middel van atoomkrachtmicroscopie, pipetaspiratie of met behulp van microrobotinstrumenten¹⁶. Ten slotte verwachten we dat deze methode gemakkelijk kan worden aangepast voor het kweken en bestuderen van andere ontwikkelingsweefsels in vergelijkbare stadia, zoals het notochord, de neurale plaat en het mesoderm van de laterale plaat.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Agarose	Sigma	9012-36-6	Voor het coaten van de bodem van petrischalen
Agarose, lage geltemperatuur	Sigma	39346-81-1	Voor het bereiden van de Viventis-beeldvormingskamer
Camera	Andor	Andor Zyla 4.2 Plus	Voor beeldverwerving in de lichtbladmicroscoop
Detectieobjectief	Nikon	Nikon CFI75 Apo LWD 25x/1.1 NA	Voor het beeldvormen van explantaten
FEP-membraanstrip	Lohmann Technologies UK Ltd	Dupont FEP Fluorocarbon film, 200A	Voor het bereiden van de Viventis-beeldvormingskamer
Fijne pincet	Dumont	Dumont 5SF 11252-00	Voor het verwijderen van de huid van embryo's
Pincet	Dumont	Dumont 55	Voor het dechorioneren van embryo's
Leibovitz's L-15 medium	Gibco	21083-027	Explantaatcultuurmedium
Lichtbladmicroscoop	Viventis	LS1 live	Voor het beeldvormen van explantaten
Micromes	Fine Science Tools	10318-14	Voor het maken van insnijdingen in embryo's
Siliconenrubberformule	Wacker Chemie AG	Silpuran 4200	Voor het bereiden van de Viventis-beeldvormingskamer