Methodenartikel

Confocale beeldvorming met hoge doorvoer van Quantum Dot-geconjugeerde SARS-CoV-2 Spike Trimers om binding en endocytose in HEK293T-cellen te volgen

DOI:

10.3791/63202

⸱

21 april 2022

 ,  ,  ,  , 
1National Center for Advancing Translational Sciences, 2Optical Sciences Division, Code 5600, Naval Research Laboratory, 3Jacobs Corporation

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit protocol stellen quantum dots geconjugeerd aan recombinant SARS-CoV-2 spike celgebaseerde assays in staat om spikebinding aan hACE2 aan het plasmamembraan en daaropvolgende endocytose van de gebonden eiwitten in het cytoplasma te controleren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ontwikkeling van nieuwe technologieën voor cellulaire fluorescentiemicroscopie heeft screeningmethoden met hoge doorvoer voor het ontdekken van geneesmiddelen vergemakkelijkt. Quantum dots zijn fluorescerende nanodeeltjes met uitstekende fotofysische eigenschappen doordrenkt met heldere en stabiele fotoluminescentie en smalle emissiebanden. Quantum dots zijn bolvormig en kunnen met de juiste modificatie van de oppervlaktechemie worden gebruikt om biomoleculen te conjugeren voor cellulaire toepassingen. Deze optische eigenschappen, gecombineerd met het vermogen om ze te functionaliseren met biomoleculen, maken ze een uitstekend hulpmiddel voor het onderzoeken van receptor-ligandinteracties en cellulaire handel. Hier presenteren we een methode die quantum dots gebruikt om de binding en endocytose van SARS-CoV-2 spike-eiwit te volgen. Dit protocol kan worden gebruikt als een gids voor experimentalisten die quantum dots willen gebruiken om eiwit-eiwitinteracties en mensenhandel te bestuderen in de context van cellulaire fysiologie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fluorescentiemicroscopie stelt onderzoekers in staat om in de innerlijke werking van de cel te kijken met behulp van gespecialiseerde kleurstoffen1, genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten2 en fluorescerende nanodeeltjes in de vorm van quantum dots (QDs)3. Voor de wereldwijde pandemie van het ernstige acute respiratoire syndroom coronavirus van 2019 (SARS-CoV-2) hebben onderzoekers fluorescentiemicroscopie gebruikt om te begrijpen hoe het virus interageert met de cel, zowel bij het plasmamembraan als in het cytoplasma. Onderzoekers hebben bijvoorbeeld inzicht kunnen krijgen in de binding van het SARS-CoV-2 Spike-eiwit op het oppervlak van het virion aan het menselijke angiotensine-converterende enzym 2 (hACE2) op het oppervlak van menselijke cellen, daaropvolgende internalisatie via fusie aan het plasmamembraan en endocytose van het Spike: hACE2-eiwitcomplex4,5. Er zijn ook geweldige inzichten verkregen in de SARS-CoV-2-uitgang van cellen via het lysosoom met behulp van cellulaire fluorescentiebeeldvorming, een uniek kenmerk van coronavirussen waarvan eerder werd gedacht dat ze optraden via traditionele blaasjes die ontluiken uit de Golgi, zoals het is met veel andere virussen6. Een steunpilaar van bijna alle aspecten van biologisch onderzoek, de cellulaire fluorescentiemicroscopietechniek is noodzakelijkerwijs gevorderd in zijn breedte en toepassingsgebied van superresolutie beeldvorming van hele dieren tot geautomatiseerde multi-parametrische beeldvorming met een hoog gehalte voor geneesmiddelenscreening. Hier wordt geautomatiseerde confocale microscopie met een hoog gehalte toegepast op de studie van SARS-CoV-2-celinvoer met behulp van fluorescerende QD's geconjugeerd aan het virale spike-eiwit.

High-content analyse van beelden gegenereerd door biologische beeldvormingsplatforms maakt een grotere extractie van waardevolle biologische inzichten mogelijk dan afzonderlijke parameters zoals de intensiteit van de hele put, die men zou verkrijgen met behulp van een multimodale plaatlezer7. Door de objecten in een gezichtsveld te scheiden met behulp van geautomatiseerde segmentatiealgoritmen, kan elk object of een populatie objecten worden geanalyseerd op parameters zoals intensiteit, oppervlakte en textuur in elk beschikbaar fluorescentiekanaal8. Het combineren van veel metingen in multivariate datasets is een nuttige benadering voor fenotypische profilering. Wanneer het gewenste fenotype bekend is, zoals QD-internalisatie in de vorm van puncta, kan men de metingen met betrekking tot puncta zoals grootte, aantal en intensiteit gebruiken om de werkzaamheid van een behandeling te beoordelen.

Cloudgebaseerde high content imaging-analysesoftware is geschikt voor een grote verscheidenheid aan instrumentgegevensuitvoer, waaronder het high content imaging-platform. Door een cloudgebaseerde server te gebruiken voor beeldopslag en online analyse, kan de gebruiker zijn gegevens uploaden vanaf het beeldvormingsinstrument of vanaf de netwerkschijf waar de gegevens zijn opgeslagen. Het analysegedeelte van het protocol wordt uitgevoerd binnen de cloudsoftwareomgeving en gegevens kunnen in verschillende bestandsindelingen worden geëxporteerd voor downstream-gegevensvisualisatie.

Het SARS-CoV-2-virus bestaat uit niet-structurele en structurele eiwitten die helpen bij de assemblage en replicatie ervan. SARS-CoV-2-piek heeft twee domeinen genaamd S1 en S2, waarbij S1 het receptorbindende domein bevat dat verantwoordelijk is voor hACE2-interacties bij het plasmamembraan9. Spike blijkt ook te interageren met andere moleculen in het plasmamembraan die naast hACE210,11 als co-receptoren kunnen fungeren. Gedurende de spike-eiwitsequentie en met name op de S1/S2-interface zijn er proteasesplitsingsplaatsen die fusie op het membraan mogelijk maken na het transmembraan serineprotease 2 (TMPRSS2)12. Verschillende recombinante SARS-CoV-2 Spike-eiwitten zijn geproduceerd uit individuele receptorbindende domeinen, tot S1, S2, S1 met S2 en hele spike trimers van meerdere commerciële leveranciers voor gebruik in onderzoeksactiviteiten13.

In dit werk werd het oppervlak van QD's gefunctionaliseerd met recombinante spike trimers die een histidine tag (QD-Spike) bevatten. De QD's geproduceerd door Naval Research Laboratory Optical Nanomaterials Section bevatten een cadmiumselenidekern en een zinksulfideschaal14,15. Het zink op het QD-oppervlak coördineert de histidineresiduen in het recombinante eiwit om een gefunctionaliseerde QD te vormen die qua vorm en functie lijkt op een SARS-CoV-2-virusdeeltje. De generatie van de nanodeeltjes en eiwitconjugatie werd eerder beschreven met behulp van het QD-geconjugeerde receptorbindingsdomein15. Deze methode beschrijft de celkweekpreparaten, QD-behandeling, beeldacquisitie en data-analyseprotocol dat een onderzoeker kan begeleiden bij het bestuderen van SARS-CoV-2 Spike-activiteit in de fysiologische context van een menselijke cel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De HEK293T-cellijn die in deze studie wordt gebruikt, is een vereeuwigde cellijn. In deze studie werden geen menselijke of dierlijke proefpersonen gebruikt.

1. Cel kweken en zaaien

  1. In een steriele bioveiligheidskast, met persoonlijke beschermingsmiddelen (inclusief laboratoriumhandschoenen, laboratoriumjas en veiligheidsbril), bereidt u celkweekmedium voor door Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aan te vullen met 10% foetaal runderserum (FBS), 1% penicilline / streptomycine (P / S) en 250 μg / ml G418.
    1. Voeg voor 500 ml media 443,75 ml DMEM, 50 ml FBS, 5 ml P/S en 1,25 ml G418 toe.
    2. Filtreer door een filterkolf van 0,2 μm en behoud de steriliteit om bacteriële besmetting te voorkomen.
  2. Zaai in een steriele bioveiligheidskast de binnenste 60 putten van een zwarte, heldere bodem, poly-D-lysine gecoate 96-well plaat met 20.000 cellen in 100 μL per put celkweekmedium. Vul de buitenste 36 putten met 100 μL per put fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
    1. Om de cellen te tellen, voegt u 2 μL acridine orange en propidiumjodidekleuring toe aan 18 μL celsuspensie.
    2. Laad 10 μL van deze oplossing in één kant van een celtelschuif.
    3. Herhaal stap 1.2.1. en 1.2.2. om beide zijden van de dia te laden.
    4. Plaats de schuif in een geautomatiseerde celteller.
    5. Selecteer het protocol voor het tellen van fluorescentie en druk op Tellen. Tel beide zijden van de dia en bereken het gemiddelde van de twee levend-celdichtheden.
    6. Om het benodigde volume celsuspensie te berekenen, deelt u het totale aantal benodigde cellen door de gemiddelde celdichtheid.
  3. Inspecteer de putten na het zaaien onder een lichtmicroscoop om er zeker van te zijn dat de juiste dichtheid en verdeling zijn bereikt.
  4. Incubeer de plaat een nacht in een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% CO2.

2. Behandeling van cellen met QD-Spike

  1. Bereid 0,1% runderserumalbumine (BSA) voor door verdunning in beeldvormende media.
    1. Voeg voor 10 ml beeldmedia 130 μL 7,5% BSA toe en meng.
  2. Verdun in een 12-well reservoir of assayplaat de 440 nM QD-Spike (SARS-CoV-2, Isolate USA-WA1/2020) voorraad tot 20 nM met behulp van 0,1% BSA in beeldvormingsmedia.
    1. Voeg voor 1 put QD-Spike 2,27 μL van 440 nM QD-Spike toe aan 47,73 μL van 0,1% BSA-beeldvormingsmedia voor een uiteindelijke concentratie van 20 nM.
    2. Om een zespunts 1:3 seriële verdunning (in drievoud) te genereren, voegt u 14,26 μL QD-Spike toe aan 285,74 μL 0,1% BSA-beeldvormingsmedia om de hoogste concentratie van 20 nM te maken. Voeg 100 μL 20 nM QD-Spike toe aan 200 μL 0,1% BSA-media om de tweede verdunning van 6,67 nM QD-Spike te maken. Herhaal vier keer om de zes concentratiepunten te genereren.
  3. Gebruik een meerkanaals aspirator om alle gebruikte media uit elke put te verwijderen. Gebruik een meerkanaalspipet en was eenmaal met beeldvormende media (100 μL/put).
  4. Zuig 100 μL beeldvormende media op en voeg 50 μL/put QD-Spike-oplossing toe.
  5. Incubeer de plaat gedurende 3 uur in een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% CO2. Ga verder met stap 4.

3. Fixatie en kernkleuring

  1. In een steriele bioveiligheidskast, met persoonlijke beschermingsmiddelen (inclusief laboratoriumhandschoenen, laboratoriumjas en veiligheidsbril), bereidt u 4% paraformaldehyde (PFA) voor in 0,1% BSA-beeldvormingsmedia.
  2. Zuig 50 μL QD-Spike uit elke put en voeg 100 μL /put van 4% PFA toe.
    1. Laat de putten niet uitdrogen. Gebruik een geautomatiseerde meerkanaalspipet om droging van de putten te voorkomen (aanbevolen).
  3. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Was drie keer met 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
  5. Bereid de dieprode kernkleurstof door de 5 mM-stamoplossing te verdunnen tot 1:1000 verdunning in PBS.
  6. Zuig de PBS uit en voeg 50 μL/put verdunde kernkleurstof toe.
  7. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
  8. Drie keer wassen met PBS.
  9. Stel de plaat of afdichting voor met behulp van een platensealer voor beeldvorming op een later tijdstip. Bewaar de plaat bij 4 °C. Fluorescentie moet enkele weken of langer stabiel zijn.

4. Acquisitie set-up en imaging

  1. Start de software voor het imaging platform. Schakel het beeldverwerkingsplatform met hoge inhoud in en het lampje op de statusbalk moet branden. Als het apparaat niet is aangesloten, gaat de software in de offline analysemodus.
  2. Log in op het imaging platform.
  3. Maak een nieuw acquisitieprotocol.
    1. Selecteer Plaattype als 96-goed heldere bodembeeldplaat.
      OPMERKING: De plaatselectie in het instrument kan variëren en kan worden aangepast door de juiste plaatdefinities te laden die plaatafmetingen zoals hoogte, breedte en andere afstanden omvatten om goed afstand en brandpunten te definiëren.
    2. Selecteer Optische modus als confocaal en vergroting als 40x onderdompeling in water.
    3. Selecteer Binning als 1.
    4. Kies de kanalen en fluorescerende excitatie-/emissiegolflengten zoals beschreven in stap 4.3.5-4.3.8. Maak een momentopname wanneer de instellingen zijn geselecteerd om de afbeelding te bekijken en zorg ervoor dat de instellingen geschikt zijn.
      OPMERKING: Digital Phase Contrast (DPC) maakt visualisatie van levende cellen mogelijk zonder een celvlek of fluorescerende kleurstof. Het wordt niet aanbevolen voor vaste cellen.
    5. Selecteer de modus voor DPC, zoals Hoog contrast, om goed gedefinieerde cellichamen te produceren. Maak een momentopname om te bevestigen dat deze instelling geschikt is, zoals te zien is in het afbeeldingsvenster.
    6. Selecteer het FITC-kanaal voor gebruik met de ACE2-GFP-cellijn waarmee ACE2-handel in de cel kan worden gevisualiseerd.
    7. Als u een aangepast kanaal voor het QD-kanaal wilt maken, selecteert u het vervolgkeuzemenu driehoek voor het kanaal en kiest u de excitatie in het bereik van 405 nm en de emissie in het bereik van 608 nm.
    8. Als cellen werden gefixeerd en een dieprode kernkleurstof werd gebruikt, selecteert u het verrode kanaal met een emissie van meer dan 630 nm om het cellichaam verder af te bakenen en als een celmasker te fungeren.
    9. Selecteer een put met een sterk cytoplasmatisch QD-signaal om de belichtingstijd, het laservermogen en de Z-hoogtepositie in te stellen. Volg de stappen van 4.3.10-4.3.13.
    10. Controleer of de standaardhoogte een afbeelding oplevert waarbij de cellen zich in het gewenste brandpuntsvlak bevinden. Als de endocytosed puncta het doelorganel zijn, zal de Z-positie lager zijn dan wanneer het plasmamembraan het doelorganel is.
    11. Kies een belichtingstijd die een helder beeld oplevert met grijswaarden die minstens drie keer groter zijn dan het achtergrondsignaal. Dit is meestal tussen de 100 en 300 ms. Bij 20 nM moeten de grijswaarden ongeveer 6000 a.u. zijn met een belichtingstijd van 200 ms en een laservermogen van 80%.
    12. Controleer de grijswaarden door met de rechtermuisknop op de afbeelding te klikken die is geproduceerd met de functie Momentopname in elk kanaal en Intensiteit weergeven te selecteren. Klik vervolgens met de linkermuisknop op het object of de achtergrond om het grijsniveau voor die pixel weer te geven.
    13. Pas het laservermogen aan om de intensiteit van de objecten van interesse nauwkeurig af te stellen.
  4. Sla het acquisitieprotocol op.
  5. Schakel over naar Experiment uitvoeren en voer de naam van de plaat in.
  6. Voer het experiment uit.

5. Data-analyse

  1. Importeer gegevens in de beeldbewerkingssoftware.
    1. Nadat u alle afbeeldingen hebt verkregen, exporteert u metingen naar de beeldvormingssoftware. Hiervoor moet een server worden opgezet en een account worden aangemaakt. Maak een scherm voor de gegevens die moeten worden geëxporteerd naar de beeldbewerkingssoftware.
  2. Selecteer in de beeldbewerkingssoftware Beeldanalyse om te beginnen met het bouwen van het analyseprotocol.
  3. Laad de metingen uit het beeldvormingsexperiment door met de rechtermuisknop op het bestand in de lijst met schermen te klikken en op Selecteren te klikken. De plaatkaart van afgebeelde putten en de bijbehorende velden moet zichtbaar zijn in de linkerbenedenhoek van het venster.
  4. Kies een put met heldere cytoplasmatische QD-vlekken om te beginnen met beeldsegmentatie.
  5. Selecteer in het Building Block Input Image de optie Vlakveldcorrectie.
  6. Voeg de volgende bouwsteen toe aan het protocol door Zoek kernen te selecteren.
    1. Gebruik hier de DPC of het verrode kanaal als de nuclei-marker.
    2. Selecteer de methode waarmee de objecten eerst nauwkeurig worden gesegmenteerd en pas vervolgens de segmentatie aan met behulp van het vervolgkeuzemenu en pas de schuifregelaars aan.
      OPMERKING: Goede segmentatie definieert nauwkeurig het interessegebied (ROI) voor de kern, cel en vlekken. Alleen de pixels die positief zijn voor de marker moeten worden vastgelegd binnen een individuele ROI. Achtergrondsignaal moet worden uitgesloten. Als de achtergrond wordt vastgelegd in de ROI, kan de gevoeligheid van de methode worden verlaagd of kan de intensiteitsdrempel worden verhoogd om de strengheid van het segmentatiealgoritme te vergroten. Dit is van toepassing op alle Find-bouwstenen.
  7. Voeg vervolgens de Find Cytoplasm Building Block toe om het cytoplasma te identificeren.
    1. Gebruik in dit geval het ACE2-GFP-kanaal voor cytoplasmatische segmentatie.
    2. Selecteer de methode die het cytoplasma van elke cel het beste identificeert.
  8. Voeg vervolgens het Building Block Find Spots toe om de QD-Spike puncta te identificeren.
    1. Selecteer de Kernen als de ROI-populatie.
    2. Selecteer de cel als roi-regio. Dit vangt de puncta op in de hele cel.
    3. Selecteer de methode die de QD-puncta in elke cel het beste identificeert.
  9. Zodra alle objecten in de afbeelding zijn gesegmenteerd en nauwkeurig zijn geïdentificeerd in deze put, kiest u andere putten om ervoor te zorgen dat de bouwstenen en instellingen over het algemeen kunnen worden toegepast op de andere putten en andere omstandigheden.
  10. Voeg de eigenschappen intensiteit berekenen toe voor alle gesegmenteerde objecten (kernen, cytoplasma/cellen en vlekken).
  11. Voeg de morfologie-eigenschappen berekenen toe voor alle gesegmenteerde objecten (kernen, cytoplasma/cellen en vlekken).
  12. Voeg de textuureigenschappen berekenen toe voor alle gesegmenteerde objecten (kernen, cytoplasma/cellen en vlekken).
  13. Definieer de resultaten door de parameters voor elke populatie te selecteren, inclusief kernen en vlekken. Het aantal objecten kan worden gebruikt als een indirecte maat voor de levensvatbaarheid van cellen.

6. Gegevens exporteren

  1. Klik op Batchanalyse. Wacht tot de analyse is voltooid voordat u doorgaat naar de volgende stap (stap 6.2).
    OPMERKING: Met de batchanalyse kan de softwareserver voor beeldanalyse het analyseprotocol laden met behulp van de geselecteerde metingen om de gegevens op afstand te analyseren.
  2. Exporteer de gegevensset naar een lokale computer of netwerkstation.
    1. Verbind de beeldanalysesoftware met een helpertoepassing op de computer door een verbindingsbestand te downloaden en te openen.
    2. Selecteer het bestandstype van de resultaten (.txt, .csv, .html of Native XML).
    3. Kies de instellingen voor bestandsmappen in het vervolgkeuzemenu.

7. Analyseer de gegevens in een spreadsheet

  1. Open het geëxporteerde bestand. Als het een .csv bestand is, slaat u het op als een .xls bestandsindeling om het gebruik van draaitabellen in te schakelen. Als het bestandspad te lang is, slaat u het .xls bestand hoger in de mappenhiërarchie op om fouten bij het opslaan te voorkomen.
  2. Voeg kolommen toe aan de spreadsheet die de voorwaarden voor elk putje aangeven. Bijvoorbeeld het celtype, QD-Spike varianten, QD-Spike concentraties, incubatietijd, etc.
  3. Kies de functie Draaitabel en bouw de tabel met de toegevoegde voorwaarden als Rijen en de gemeten parameters als Kolommen. Selecteer de berekening voor elke parameter, d.w.z. Gemiddelde, Standaarddeviatie, Mediaan, Min, Max of Aantal.
  4. Normaliseer de gegevens om monsters te controleren, inclusief niet-geconjugeerde QD's als 0% en de hoogste concentratie QD-Spike als 100%.
    OPMERKING: Bij het beoordelen van de werkzaamheid van remmers zoals neutraliserende antilichamen, normaliseer de gegevens naar met media behandelde cellen (100% werkzaamheid) en QD-Spike zonder remmer (0% werkzaamheid).
  5. Plot de gegevens in grafische software.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na behandeling zullen de QD's worden geïnternaliseerd omdat het nanodeeltje zich bindt aan ACE2 op het plasmamembraan en endocytose induceert. Met behulp van een ACE2-GFP-expressiecellijn kan de translocatie van zowel QD's als ACE2 worden gevisualiseerd met behulp van fluorescentiemicroscopie. Eenmaal geïnternaliseerd, vertonen de twee QD- en ACE2-signalen een sterke colocalisatie. Uit deze beelden kan beeldsegmentatie en daaropvolgende analyse worden uitgevoerd om relevante parameters zoals spot count te extraheren (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De methode die in dit artikel wordt beschreven, biedt de nodige stappen voor het in beeld brengen van gefunctionaliseerde QD's in menselijke cellen met behulp van confocale microscopie met hoge doorvoer. Deze methode is het meest geschikt voor cellen waar endocytose de belangrijkste route van virale binnenkomst is in plaats van de activiteit van TMPRSS2 en membraanfusie, omdat het de studie van SARS-CoV-2 Spike en hACE2 endocytose mogelijk maakt. Vanwege de aard van het QD-model en de C-terminal His-tag op de in de hande...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door het Intramurale Onderzoeksprogramma van het National Center for Advancing Translational Sciences, NIH. Naval Research Laboratory verstrekte financiering via zijn interne Nanoscience Institute. Reagensvoorbereiding werd ondersteund via het NRL COVID-19-basisfonds.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
32% ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15714Wordt gebruikt voor het fixeren van cellen na behandeling met quantum dots, uiteindelijke concentratie 3,2%
Wordt gebruikt voor het stabiliseren van QD's in Optimem I en het voorkomen van niet-specifieke interacties, uiteindelijke concentratie 0,1%
7,5% bovien serum albumineGibco15260-037Wordt gebruikt als een cellevensvatbaarheidskleurstof voor fluorescerende celtelling
Acridine Orange / Propidium Iodide StainLogos BiosystemsF23001Microwell platen gebruikt voor het zaaien van cellen en het testen van QD-Spike
Zwarte doorzichtige bodem 96-well gecoate plaat gecoat met poly-D-lysineGreiner655946Wordt gebruikt om celkweek te ondersteunen, DMEM-supplement
Gekarakteriseerd foetaal bovien serumCytiva/HyCloneSH30071.03Cloud-gebaseerde beeldanalysesoftware voor hoogwaardige inhoud; V2.9.1
Columbus AnalyzerPerkin ElmerNAWordt gebruikt voor het labelen van celkernen en cellichamen na fixatie, dieprode nucleaire kleurstof
DRAQ5 (5 mM)ThermoFisher Scientific62252Basale media voor HEK293T-celkweek
Dulbecco's Minimal Essential Media, D-glucose (4,5 g/L), L-glutamine, natriumpyruvaat (110 mg/L), fenol roodGibco11995-065Wordt gebruikt voor het ordenen van gegevens na export uit Columbus; V2110 Microsoft 365
ExcelMicrosoftNAWordt gebruikt om de selectie van hACE2-GFP-positieve cellen voort te zetten, DMEM-supplement
G418InvivoGenant-gn-5Menselijk embryonaal niercellijn met stabiele expressie van humaan angiotensine-converterend enzym 2 gelabeld met GFP
HEK293T hACE2-GFPCodex BiosolutionsCB-97100-203Geautomatiseerde celteller
Luna Automated Cell CounterLogos BiosystemsNAWordt gebruikt voor fluorescerende celtelling
Luna Cell Counting SlidesLogos BiosystemsL12001Platform voor hooginhoudige beeldvorming
Opera PhenixPerkin ElmerNABeeldvormingsmedia, gebruikt voor het incuberen van cellen met quantum dots
Opti-MEM I Reduced Serum MediumGibco11058-021Fosfaatgebufferd zout oplossing zonder calcium of magnesium, gebruikt voor het wassen van cellen tijdens het overbrengen en testen
PBS -/-Gibco10010-023Wordt gebruikt om bacteriële besmetting van celkweek te voorkomen, DMEM-supplement
Penicilline StreptomycineGibco15140-122Wordt gebruikt voor het maken van grafieken, gegevensvisualisatie en statistische analyse; V9.1.0
PrismGraphPadNAWordt gebruikt voor het testen van SARS-Cov-2 Spike-binding aan hACE2 en het monitoren van Spike-endocytose
Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike)Op maat gemaakt door Naval Research LaboratoryWordt gebruikt voor het remmen van SARS-Cov-2 Spike-binding aan hACE2
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse MabSino Biological40592-MM57Wordt gebruikt om cellen los te maken van de fles tijdens het overbrengen
TrypLE ExpressGibco12605-010

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chazotte, B. Labeling Lysosomes in Live Cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571(2011).
  2. Mehta, S., Zhang, J. Biochemical activity architectures visualized-using genetically encoded fluorescent biosensors to map the spatial boundaries of signaling compartments. Accounts of Chemical Research. 54 (10), 2409-2420 (2021).
  3. Barroso, M. M. Quantum dots in cell biology. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (3), 237-251 (2011).
  4. Cuervo, N. Z., Grandvaux, N. ACE2: Evidence of role as entry receptor for SARS-CoV-2 and implications in comorbidities. eLife. 9, 61390(2020).
  5. Shang, J., et al. Cell entry mechanisms of SARS-CoV-2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (21), 11727-11734 (2020).
  6. Ghosh, S., et al. β-Coronaviruses use lysosomes for egress instead of the biosynthetic secretory pathway. Cell. 183 (6), 1520-1535 (2020).
  7. Buchser, W., et al. Assay development guidelines for image-based high content screening, high content analysis and high content imaging. Assay Guidance Manual. Markossian, S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. (2012).
  8. Chandrasekaran, S. N., Ceulemans, H., Boyd, J. D., Carpenter, A. E. Image-based profiling for drug discovery: due for a machine-learning upgrade. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (2), 145-159 (2021).
  9. Huang, Y., Yang, C., Xu, X. F., Xu, W., Liu, S. W. Structural and functional properties of SARS-CoV-2 spike protein: potential antivirus drug development for COVID-19. Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1141-1149 (2020).
  10. Gao, C., et al. SARS-CoV-2 spike protein interacts with multiple innate immune receptors. bioRxiv: the preprint server for biology. , 227462(2020).
  11. Zhang, Q., et al. Heparan sulfate assists SARS-CoV-2 in cell entry and can be targeted by approved drugs in vitro. Cell Discovery. 6 (1), 80(2020).
  12. Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
  13. Cai, Y., et al. Distinct conformational states of SARS-CoV-2 spike protein. Science. 369 (6511), New York, N.Y. 1586-1592 (2020).
  14. Oh, E., et al. Meta-analysis of cellular toxicity for cadmium-containing quantum dots. Nature Nanotechnology. 11 (5), 479-486 (2016).
  15. Gorshkov, K., et al. Quantum dot-conjugated SARS-CoV-2 spike pseudo-virions enable tracking of angiotensin Converting enzyme 2 binding and endocytosis. ACS Nano. 14 (9), 12234-12247 (2020).
  16. Narayanan, S. S., Pal, S. K. Aggregated CdS quantum dots: Host of biomolecular ligands. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (48), 24403-24409 (2006).
  17. Wang, S., et al. Endocytosis of the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein together with virus receptor ACE2. Virus Research. 136 (1), 8-15 (2008).
  18. Hildebrandt, N., et al. Energy transfer with semiconductor quantum dot bioconjugates: A versatile platform for biosensing, energy harvesting, and other developing applications. Chemical Reviews. 117 (2), 536(2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Quantum dot imagingconfocale microscopiehigh throughput screeningspike endocytoseprote neconjugatiefluorescentiemicroscopiereceptorbindingneutraliserende antilichamen

Gerelateerde artikelen