Ontwerp-tot-implementatiestudie voor ontwikkeling en patiëntvalidatie van op papier gebaseerde sleufschakelaardiagnostiek

Summary

Toegang tot gedecentraliseerde, goedkope en hoogwaardige diagnostiek die in de gemeenschap kan worden ingezet voor gedecentraliseerde tests is van cruciaal belang voor het bestrijden van wereldwijde gezondheidscrises. Dit manuscript beschrijft hoe op papier gebaseerde diagnostiek kan worden gebouwd voor virale RNA-sequenties die kunnen worden gedetecteerd met een draagbare optische lezer.

Abstract

Toegang tot moleculaire diagnostiek met lage belasting die in de gemeenschap kan worden ingezet om te testen, wordt steeds belangrijker en heeft betekenisvolle bredere implicaties voor het welzijn van samenlevingen en economische stabiliteit. De afgelopen jaren zijn er verschillende nieuwe isothermische diagnostische modaliteiten ontstaan om te voldoen aan de behoefte aan snelle, goedkope moleculaire diagnostiek. We hebben aan deze inspanning bijgedragen door de ontwikkeling en patiëntvalidatie van op toehold switch gebaseerde diagnostiek, inclusief diagnostiek voor de door muggen overgedragen Zika- en chikungunya-virussen, die prestaties leverden die vergelijkbaar waren met op goudstandaard reverse transcriptie-kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR) gebaseerde assays. Deze diagnostiek is goedkoop te ontwikkelen en te produceren en ze hebben het potentieel om diagnostische capaciteit te bieden aan omgevingen met weinig middelen. Hier biedt het protocol alle stappen die nodig zijn voor de ontwikkeling van een switch-gebaseerde test voor Zika-virusdetectie. Het artikel neemt lezers mee door het stapsgewijze diagnostische ontwikkelingsproces. Ten eerste dienen genomische sequenties van het Zika-virus als input voor het computationele ontwerp van kandidaat-switches met behulp van open-source software. Vervolgens wordt de assemblage van de sensoren voor empirische screening met synthetische RNA-sequenties en optimalisatie van diagnostische gevoeligheid getoond. Eenmaal voltooid, wordt validatie uitgevoerd met patiëntmonsters parallel met RT-qPCR en een speciaal gebouwde optische lezer, PLUM. Dit werk biedt een technische routekaart voor onderzoekers voor de ontwikkeling van goedkope op de koppeling gebaseerde sensoren voor toepassingen in de menselijke gezondheid, landbouw en milieumonitoring.

Introduction

RT-qPCR is de gouden standaardtechnologie voor klinische diagnostiek gebleven vanwege de uitstekende gevoeligheid en specificiteit. Hoewel zeer robuust, is de methode afhankelijk van dure, gespecialiseerde apparatuur en reagentia die temperatuurgecontroleerde distributie en opslag vereisen. Dit vormt aanzienlijke belemmeringen voor de toegankelijkheid van kwaliteitsdiagnostiek wereldwijd, met name in tijden van ziekte-uitbraken en in regio's waar de toegang tot goed uitgeruste laboratoria beperkt is ^1,2. Dit werd waargenomen tijdens de uitbraak van het Zika-virus in 2015/2016 in Brazilië. Met slechts vijf gecentraliseerde laboratoria beschikbaar om RT-qPCR-tests uit te voeren, ontstonden er aanzienlijke knelpunten, waardoor de toegang tot diagnostiek werd beperkt. Dit was vooral een uitdaging voor personen in peri-urbane omgevingen, die ernstiger werden getroffen door de uitbraak ^3,4. In een poging om de toegang tot diagnostiek te verbeteren, toont het protocol een platform dat is ontwikkeld met het potentieel om gedecentraliseerde, goedkope en hoge capaciteitsdiagnostiek te bieden in instellingen met weinig middelen. Als onderdeel hiervan werd een diagnostische ontdekkingspijplijn opgezet, waarbij isothermische amplificatie en synthetische RNA-switchgebaseerde sensoren werden gekoppeld aan op papier gebaseerde celvrije expressiesystemen ^5,6.

Celvrije eiwitsynthesesystemen (CFPS), in het bijzonder op E. coli gebaseerde celvrije systemen, zijn een aantrekkelijk platform voor een breed scala aan biosensingtoepassingen, van milieumonitoring ^7,8 tot pathogene diagnostiek ^{5,6,9,10,11,12} . Cfps-systemen bestaan uit de componenten die nodig zijn voor transcriptie en vertaling en hebben aanzienlijke voordelen ten opzichte van biosensoren voor hele cellen. In het bijzonder wordt detectie niet beperkt door een celwand en zijn ze over het algemeen modulair van ontwerp, bioveilig, goedkoop en kunnen ze worden gevriesdroogd voor draagbaar gebruik. De mogelijkheid om op gencircuits gebaseerde reacties op substraten zoals papier of textiel te vriesdrogen, maakt transport mogelijk, langdurige opslag bij kamertemperatuur⁵ en zelfs integratie in draagbare technologie¹³.

Eerder werk heeft aangetoond dat E. coli celvrije systemen kunnen worden gebruikt om talrijke analyten te detecteren, bijvoorbeeld toxische metalen zoals kwik, antibiotica zoals tetracycline ^7,14, hormoonontregelende chemicaliën ^15,16, biomarkers zoals hippuurzuur¹⁷, pathogeen-geassocieerde quorumdetectiemoleculen ^9,18 en illegale stoffen zoals cocaïne¹⁷ en gammahydroxybutyraat (GHB)¹⁹ . Voor de sequentiespecifieke detectie van nucleïnezuren zijn strategieën voor het grootste deel gebaseerd op het gebruik van switch-gebaseerde biosensoren gekoppeld aan isotherme amplificatietechnieken. Toehold-schakelaars zijn synthetische riboregulatoren (in de rest van de tekst ook wel gewoon 'schakelaars' genoemd) die een haarspeldstructuur bevatten die stroomafwaartse translatie blokkeert door de ribosomale bindingsplaats (RBS) en het startcodon te sekwestreren. Bij interactie met hun target trigger RNA wordt de haarspeldstructuur ontlast en wordt de daaropvolgende vertaling van een open leesframe van een reporter ingeschakeld²⁰.

Isothermische amplificatie kan ook worden gebruikt als moleculaire diagnostiek²¹; deze methoden zijn echter gevoelig voor niet-specifieke versterking, waardoor de specificiteit en daarmee de nauwkeurigheid van de test kan worden teruggebracht tot onder die van RT-qPCR ²². In het hier gerapporteerde werk werd isotherme amplificatie stroomopwaarts van de switch-gebaseerde sensoren gebruikt om gecombineerde signaalversterking te bieden die klinisch relevante detectie van nucleïnezuren (femtomolaire tot attomolaire) mogelijk maakt. Deze koppeling van de twee methoden biedt ook twee sequentiespecifieke controlepunten die in combinatie een hoge mate van specificiteit bieden. Met behulp van deze aanpak heeft eerder werk de detectie aangetoond van virussen zoals Zika⁶, Ebola⁵, Norovirus¹⁰, evenals pathogene bacteriën zoals C. difficile²³ en antibioticaresistente Tyfus¹². Onlangs zijn celvrije toehold-schakelaars gedemonstreerd voor SARS-CoV-2-detectie in pogingen om toegankelijke diagnostiek te bieden voor de COVID-19-pandemie 11,12,13.

Het volgende protocol schetst de ontwikkeling en validatie van celvrije, op papier gebaseerde synthetische toehold switch assay voor Zika-virusdetectie, van in silico biosensorontwerp, via de assemblage- en optimalisatiestappen, tot veldvalidatie met patiëntmonsters. Het protocol begint met het in silico-ontwerp van RNA-sensoren en isothermische amplificatieprimers die specifiek zijn voor het Zika-virale RNA. Hoewel er tal van isotherme amplificatiemethoden bestaan, werd hier het gebruik van nucleïnezuursequentie-gebaseerde amplificatie (NASBA) aangetoond om de concentratie van het virale RNA-doelwit in de reactie te verhogen, waardoor klinisch significante gevoeligheid mogelijk werd. Praktisch gezien hebben isothermische versterkingsmethoden het voordeel dat ze bij een constante temperatuur werken, waardoor er geen gespecialiseerde apparatuur nodig is, zoals thermische cyclers, die over het algemeen beperkt zijn tot gecentraliseerde locaties.

Vervolgens wordt het proces beschreven van het assembleren van de synthetische toehold-schakelaarsensoren met reportercoderingssequenties door middel van overlapuitbreiding PCR en het screenen van de synthetische toehold-schakelaarsensoren voor optimale prestaties in celvrije systemen met synthetisch RNA. Voor deze set Zika-virussensoren hebben we het lacZ-gen geselecteerd dat codeert voor het β-galactosidase-enzym, dat in staat is om een colorimetrisch substraat, chlorofenol rood-β-D-galactopyranoside (CPRG), te splitsen om een gele naar paarse kleurverandering te produceren die met het oog of met een platenlezer kan worden gedetecteerd. Zodra de best presterende synthetische schakelaars zijn geïdentificeerd, wordt het proces beschreven voor het screenen van primers op basis van nucleïnezuursequentie gebaseerde isotherme amplificatie van de overeenkomstige doelsequentie met behulp van synthetisch RNA om sets te vinden die de beste gevoeligheid bieden.

Ten slotte worden de prestaties van het diagnostisch platform ter plaatse gevalideerd in Latijns-Amerika (figuur 1). Om de klinische diagnostische nauwkeurigheid te bepalen, wordt de op papier gebaseerde celvrije test uitgevoerd met behulp van Zika-virusmonsters van patiënten; parallel wordt een gouden standaard RT-qPCR-test uitgevoerd ter vergelijking. Om colorimetrische celvrije testen te monitoren, maken we on-site kwantificering van resultaten mogelijk in regio's waar thermische cyclers niet beschikbaar zijn. De met de hand geassembleerde plaatlezer genaamd Portable, Low-Cost, User-friendly, Multimodal (PLUM; hierna draagbare plaatlezer genoemd) wordt hier ook geïntroduceerd²⁴. Oorspronkelijk ontwikkeld als een begeleidend apparaat voor celvrije synthetische toehold-schakelaardiagnostiek, biedt de draagbare plaatlezer een toegankelijke manier om resultaten op een manier met hoge doorvoer te incuberen en te lezen, waardoor geïntegreerde, op computervisie gebaseerde softwareanalyse voor gebruikers wordt geboden.

Figuur 1: Workflow voor het testen van patiëntmonsters met behulp van op papier gebaseerde celvrije toehold-switchreacties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 

Protocol

Alle procedures waarbij menselijke deelnemers betrokken zijn, moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met ethische normen en relevante richtlijnen, waaronder de ethische principes voor medisch onderzoek met menselijke proefpersonen die zijn vastgesteld in de Verklaring van Helsinki van de World Medical Association. Deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie voor menselijk onderzoek onder licentieprotocolnummer CAAE: 80247417.4.0000.5190. Geïnformeerde toestemming van alle patiënten die in deze studie waren opgenomen, werd door de Fiocruz-PE Institutional Review Board (IRB) voor diagnostische monsters kwijtgescholden.

OPMERKING: Het PLUM-apparaat wordt hierna een 'draagbare plaatlezer' genoemd.

1. Computationeel ontwerp van op nucleïnezuur gebaseerde amplificatieprimers

1. Scan het Zika-genoom om een reeks kandidaatregio's voor amplificatie te identificeren die ongeveer 200 nucleotiden (nt) tot 300 nt lang zijn door de genomische sequentie in NCBI / Nucleotide BLAST^25,26 te plaatsen. Vergelijk het genoom met referentie-RNA-sequenties (refseq_rna) en zoek naar locaties die sterk geconserveerd blijven en geen homologie hebben met het menselijk genoom (andere BLAST-parameters blijven ongewijzigd). Selecteer ten minste twee locaties om de synthetische grijpschakelaar te ontwerpen.
2. Gebruik de selectiecriteria van Deiman et ^al.27 om paren van voorwaartse en omgekeerde op nucleïnezuursequentie gebaseerde amplificatieprimers te genereren voor elk kandidaat-versterkingsgebied. In het kort, volg deze criteria voor het ontwerpen van primers: (1) GC-gehalte tussen 40% -60%; (2) 20 tot 24 nt lang bij dna-smelttemperatuur van meer dan 41 °C; (3) geen runs van vier of meer identieke nucleotiden; (4) het laatste 3'-nucleotide is een A-basen; (5) lage secundaire primerstructuur en dimeervormingskans. Scherm 8-10 primerparen voor elk doelgebied (aanbevolen).
3. Voeg de voorvoegselsequentie met de T7-promotorsequentie AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGG (T7-promotorsequentie onderstreept) toe aan het 5'-uiteinde van de voorwaartse primers om transcriptie van de ampliconen met behulp van T7-RNA-polymerase (RNAP) mogelijk te maken. Bestel de primers als DNA-oligo's bij een DNA-synthesebedrijf.

2. Computationeel ontwerp van de grijpschakelaars

1. Installeer NUPACK²⁸ versie 3.2 (nucleïnezuur design suite) op basis van de instructies op de website²⁹. Gebruik een UNIX-besturingssysteem en MATLAB (numeriek computerplatform) als programmeertaal (aanbevolen).
2. Identificeer de doelsequenties (bijv. viraal genoom) die specifiek zijn voor de ziekteverwekker die van belang is voor de ontwerpen van de grijpschakelaar zoals in stap 1.1. Kies de Zika-doelsequenties uit de op nucleïnezuursequentie gebaseerde ampliconen die in stap 1.2 zijn gegenereerd.
   OPMERKING: In de praktijk kunnen de op nucleïnezuursequentie gebaseerde versterkingsprimers of de synthetische grijpschakelaars eerst worden ontworpen en getest, afhankelijk van de behoeften van de gebruikers. Als er al bepaalde doelregio's van belang zijn vastgesteld (bijvoorbeeld op basis van bestaande publicaties of diagnostische protocollen), kunnen het ontwerp en de screening van de greepschakelaar eerst plaatsvinden, gevolgd door ontwerp en screening op amplificatieprimers op basis van nucleïnezuursequenties. Als er geen vastgestelde doelregio's zijn, screen dan eerst nucleïnezuursequentie-gebaseerde amplificatieprimers tegen het volledige genoom om de doelen van keuze te beperken terwijl wordt geselecteerd op primer-versterkingsefficiëntie. Als er meerdere sequenties voor de ziekteverwekker beschikbaar zijn, is het het beste om op nucleïnezuursequentie gebaseerde amplificatieprimers te ontwerpen die zich richten op sterk geconserveerde regio's (in plaats van het hele genoom te screenen).
3. Download en installeer de vereiste MATLAB-software op de computer.
4. Stel de omgevingsvariabelen zo in dat de functies van de nucleïnezuurontwerpsuite in de software kunnen worden aangeroepen. Hiertoe opent u de software en opent (of maakt u) een startup.m-bestand in de standaardwerkmap. Kopieer vervolgens de volgende regels code naar het bestand startup.m en voeg ten slotte de map met de binaire bestanden van de nucleïnezuurontwerpsuite toe aan het PATH:
   NUPACKINSTALL = '/Gebruikers/[user_name]/.../nupack3.2.2';
   setenv('NUPACKINSTALL',NUPACKINSTALL);
   setenv('PATH',[getenv('PATH'),sprintf(':%s/build/bin',NUPACKINSTALL)]);
5. Open de numerieke computerplatformsoftware en navigeer naar de map ontwerpsoftware. Voer de ontwerpalgoritmen uit die toegankelijk zijn op https://github.com/AlexGreenLab/TSGEN.
6. Voer de doelreeksen in de design_input_file.csv in de invoersubmap. De ingangen omvatten Naam, Buitenste sequentie, Binnenste sequentie, Temperatuur, Uitvoernaam en Uitvoervolgorde zoals gedefinieerd in Tabel 1. Als er nog geen primingplaatsen zijn bepaald voor het doel, houd dan de binnenste en buitenste sequenties hetzelfde. Alleen de eerste 29 nt van de verslaggever wordt tijdens het ontwerpproces in aanmerking genomen. Als u klaar bent, slaat u de bijgewerkte spreadsheet op en sluit u deze.
   OPMERKING: De uitvoersequentie is de volgorde van het reportereiwit dat gepland is om voor de test te worden gebruikt (bijv. lacZ). Het specificeren van de binnenste en buitenste sequenties zorgt ervoor dat het algoritme geen synthetische toehold-schakelaars genereert die overlappen met een van de primers. Het zorgt er ook voor dat de test drie unieke locaties in het Zika-genoom herkent om de specificiteit ervan te verbeteren.
7. Selecteer de parameters die u wilt gebruiken voor de ontwerpfunctie: toehold_switch_design_run(num_designs,input_file, opties). Vul de parameterwaarden in als:
   1. num_designs - het aantal topontwerpen voor elke doeluitvoer door de software. De standaardwaarde is 6 en kan indien nodig worden gewijzigd (een minimum van zes ontwerpen voor elk doel wordt aanbevolen).
   2. input_file - deze parameter geeft de naam op van het bestand dat de informatie over de invoerreeks bevat. De standaardwaarde is 'design_input_file.csv' en kan indien nodig worden gewijzigd.
   3. Kies uit de volgende opties - (1) SeriesA en SeriesB: de versie(s) van de toehold-schakelaar die de code zal genereren. Stel SeriesB in op 1 en SeriesA op 0 om serie B-sleufschakelaar te genereren, het formaat dat wordt gebruikt in de Zika-virusdiagnose⁶; (2) Parallel: ingesteld op 1 om meerdere kernen te gebruiken om de ontwerpen te berekenen; anders ingesteld op 0; (3) Antisense: ingesteld op 1 om toehold-schakelaars te genereren die de antisense-sequentie (d.w.z. het omgekeerde complement) van de doelingang hybridiseren; anders ingesteld op 0.
8. Voer de ontwerpfunctie uit met de geselecteerde parameters: toehold_switch_design_run(num_designs,input_file,options). Het algoritme zal dan beginnen met het genereren van de toehold switch ontwerpen voor de doelen van belang.
9. Zoek na voltooiing van het ontwerp de ontwerpsequenties van de bovenste toehold-switch en de bijbehorende doelsequenties in de map final_designs in de vorm van spreadsheets met .csv indeling. De DOOR het algoritme gegenereerde sequenties van de sleufschakelaar bevatten de T7-promotorsequentie aan het 5'-uiteinde en de geconserveerde 21-nt linkersequentie AACCTGGCGGGGGCGCAAAAG aan het 3'-uiteinde.
10. Scherm de resulterende ontwerpsequenties van de bovenste sleufschakelaar af tegen andere veel voorkomende virussen door ze op NCBI-BLAST te zetten en te controleren op sequentie homologie. Accepteer sequenties met 40% homologie of minder.
11. Bestel de haarspeldbochtsequenties van de toehold switch als DNA-oligo's en monteer ze later met het reporter-gen tot volledig functionele schakelaars. Bestel de benodigde PCR-primers voor de volgende sensorassemblage, afhankelijk van het rapporteiwit van keuze.

Parameter	Definitie
Naam	De gewenste namen van de uitgangsneus geschakelde sequenties.
Buitenste reeks	Volledig NASBA-transcript geproduceerd uit versterking.
Innerlijke volgorde	De buitenste reeks met uitzondering van de primerbindingsplaatsen. Het komt overeen met de buitenste reeks, maar sluit de delen van de transcripties uit die binden aan de voorwaartse en omgekeerde primers.
Temperatuur	De temperatuur die door de algoritmen wordt gebruikt om de RNA-structuren te berekenen.
Uitvoernaam	De naam van het uitgangsgen (bijv. lacZ, gfp).
Uitvoervolgorde	De sequentie van het uitgangsgen.

Tabel 1: De definitie van elke parameter die wordt gebruikt in de toehold switchdesign software.

3. Constructie van grijpschakelaars door PCR

OPMERKING: Deze stappen beschrijven de constructie van LacZ-sleufschakelaars door overlapuitbreiding PCR. Hier wordt het DNA-oligo gebruikt als forward primer en de T7 terminator als reverse primer. We gebruiken het pCOLADuet-LacZ plasmide als sjabloon voor het lacZ-gen (addgene: 75006). Alle andere DNA-sjablonen die de overeenkomstige sequentie bevatten, kunnen als sjablonen worden gebruikt, op voorwaarde dat de T7-terminator wordt opgenomen in de uiteindelijke constructie.

1. Zodra synthetische DNA-oligo's van de commerciële leverancier zijn ontvangen, bereidt u oplossingen van het synthetische DNA en omgekeerde amplificatieprimer in een concentratie van 10 μM in nucleasevrij water. Monteer reacties in PCR-buizen op ijs volgens tabel 2.
   OPMERKING: PCR-volumes kunnen naar behoefte worden geschaald. Gebruik een minimale hoeveelheid (0,1-1 ng) pCOLADuet-LacZ DNA-sjabloon om te voorkomen dat een extra plasmideverwijderingsstap of achtergrond LacZ-signaal nodig is. Voor hogere hoeveelheden DNA-sjablonen volgt u de PCR met een DpnI-restrictie-enzym digest om de resterende plasmidesjabloon te verwijderen.
2. Plaats de reacties in een thermische cycler, volgens de in tabel 3 vermelde fietsomstandigheden. Analyseer de PCR-producten op een agarose-gel (figuur 2; zie aanvullend protocol en³⁰).
3. Zuiver de PCR-producten met behulp van een pcr-zuiveringskit op basis van een spinkolom en eluteer het DNA in 15-30 μL nucleasevrij water, volgens de instructies van de fabrikant. Kwantificeer het DNA met behulp van een spectrofotometer.

Bestanddeel	Volume	Concentratie
5x Q5-reactiebuffer	10 μL	1x
10 mM dNTPs	1 μL	200 μM
10 mM Forward Primer (Synthetische Schakelaar DNA FW)	2,5 μL	0,5 μM
10 mM Omgekeerde Primer (T7 terminator RV)	2,5 μL	0,5 μM
Sjabloon DNA (pCOLADuet-LacZ)	veranderlijk	<1 ng
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase	0,5 μL	0,02 U/μL
Nucleasevrij water	tot 50 μL	-

Tabel 2: De PCR-componenten die worden gebruikt om toehold-schakelaars te bouwen.

Stap		Temperatuur	Tijd
Initiële denaturatie		98 °C	30 s
35 cycli	Denaturatie	98 °C	10 s
	Annealing	60 °C	20 s
	Extensie	72 °C	1.45 min
Definitieve verlenging		72 °C	5 min.
Houden		4 °C	-

Tabel 3: Fietsomstandigheden die worden gebruikt bij de bouw van grijpschakelaars door PCR.

4. Bereiding van synthetisch RNA-doelwit (Trigger)

1. Gebruik een moleculair biologische ontwerpsoftware om de synthetische trigger-RNA-sjablonen (geselecteerd in stap 1.1) aan te passen om een upstream T7-promotorsequentie op te nemen, zodat de volledige sjabloon kort blijft (<200 bp). Ontwerp voorwaartse en omgekeerde primers om de trigger sequence primer te versterken (voor oligosequenties zie Aanvullend Protocol).
2. Rangschik de sequenties als DNA-oligo's. Na ontvangst reconstitueer je het synthetische trigger-DNA en de amplificatieprimers tot 10 μM in nucleasevrij water. Monteer de overeenkomstige PCR's in dunwandige buizen op ijs volgens tabel 2 en gebruik 0,5 μL van het trigger-DNA-ultrameer (uiteindelijke concentratie van 0,1 μM) als sjabloon-DNA.
3. Plaats de reacties in een thermische cycler en gebruik de in tabel 3 vermelde fietsomstandigheden. Gebruik een verlengingstijd van 15 s. Beoordeel de kwaliteit en zuiver trigger PCR-producten zoals beschreven in stap 3.3 en het Aanvullend Protocol.
   OPMERKING: Om het proces te versnellen, kunnen kolomgezuiverde trigger PCR-producten ook direct worden gebruikt voor de initiële screening van de grijpschakelaar.

5. In vitro transcriptie van geselecteerde triggersequenties

1. Monteer reactiecomponenten op ijs volgens tabel 4.
2. Incubeer in vitro transcriptie (IVT) reacties bij 37 °C gedurende 4 uur, gevolgd door DNase I-behandeling om het sjabloon-DNA te verwijderen. Voeg voor de DNase I-stap 70 μL nucleasevrij water, 10 μL 10x DNase I-buffer en 2 μL DNase I (RNase-vrij) toe en incubeer bij 37 °C gedurende 15 minuten. Als u niet onmiddellijk doorgaat naar stap 5.4, inactiveer DNase I dan met de toevoeging van 50 mM EDTA en warmte-inactivering bij 65 °C gedurende 10 minuten.
3. Optionele stap: Voer denaturerende polyacrylamide-gel-elektroforese (bijv. ureum-PAGE) analyse uit op de IVT-producten om de RNA-kwaliteit te beoordelen zoals beschreven in het aanvullend protocol.
4. Zuiver de trigger IVT-producten met behulp van een kolomgebaseerde RNA-opruimkit volgens de instructies van de fabrikant en kwantificeer vervolgens de RNA-concentratie en zuiverheid met behulp van spectrofotometrie. Zie het Aanvullend Protocol voor instructies over het bepalen van de molariteit en het kopienummer/μL van het RNA.

Bestanddeel	Volume	Concentratie
10x reactiebuffer	1,5 μL	0,75x
25 mM NTP mix	6 μL	7,5 mM
Template trigger DNA	X μL	1 μg
T7 RNA Polymerase Mix	1,5 μL	-
Nucleasevrij water	X μL	Tot 20 μL

Tabel 4: In vitro transcriptie (IVT) van geselecteerde triggersequenties.

6. Eerste screening van de schakelaars

OPMERKING: In dit gedeelte worden de stappen beschreven die gepaard gaan met het instellen van celvrije, op papier gebaseerde toehold-switchreacties en hoe u kunt screenen op goed presterende toehold-schakelaars. Het BSA-geblokkeerde filterpapier dat in stap 6.10 is gebruikt, moet van tevoren worden voorbereid zoals beschreven in het Aanvullend Protocol.

1. Bereid een CPRG-stockoplossing door 25 mg van het poeder op te lossen in 1 ml nucleasevrij water. Bewaar de oplossing te allen tijde op ijs en bewaar bij -20 °C voor langdurig gebruik.
2. Bepaal het aantal reacties dat moet worden ingesteld. Neem voor elke beoordeelde toehold-switch een no template control op (geen switch en geen target-RNA- ook wel bekend als cell-free alone control) om rekening te houden met elk achtergrondsignaal dat kan voortvloeien uit de mastermix. Neem een schakelaar alleen controle op om te beoordelen op de achtergrondschakelaar lekkage of UIT-snelheid in afwezigheid van doel-RNA.
3. Stel een celvrije reactiemastermix van oplossing A, oplossing B, RNase-remmer en CPRG samen op ijs volgens het standaardprotocol in tabel 5.
   OPMERKING: De hier beschreven stappen zijn voor een hoofdmix die voldoende is voor een drievoudige set van 1,8 μL-reacties met toegevoegd volume van 10% om rekening te houden met pipetteerfouten. Het mastermixvolume moet indien nodig worden aangepast, afhankelijk van het aantal afgeschermde toehold-schakelaars.
4. Voor elke drievoudige celvrije reactie doseert u de mastermix in een PCR-buis, waarbij alle buizen op ijs blijven. Voor de buis die opzij is gezet als de celvrije alleen-regeling, voeg nucleasevrij water toe aan een eindvolume van 5,84 μL, meng door op en neer te pipetteren en centrifugeer kort. Voeg voor de rest van de buizen PCR-gezuiverd sleufschakelaar-DNA toe aan een eindconcentratie van 33 nM.
5. Voor buizen die alleen als schakelaar zijn gereserveerd, voegt u nucleasevrij water toe aan een eindvolume van 5,84 μL. Voor buizen die zijn gereserveerd om de toehold-schakelaar en doel-RNA-combinatie te testen, voegt u in vitro getranscribeerd doel-RNA toe aan een eindconcentratie van 1 μM. Voeg vervolgens nucleasevrij water toe aan een eindvolume van 5,84 μL. Meng alle reacties grondig door op en neer te pipetteren en centrifugeer kort.
6. Voeg 30 μL nucleasevrij water toe aan de putten rond de reactieputten op een zwarte, heldere bodemplaat van 384 goed. Dit minimaliseert verdamping in de loop van het experiment en verbetert de reproduceerbaarheid.
   OPMERKING: Als u het draagbare plaatlezerapparaat gebruikt, plaatst u een PCR-folie over de plaat en gebruikt u een precisiemes om de putten uit te snijden die bedoeld zijn voor uw reactie, evenals elk van de vier hoekputten. De PCR-folie voorkomt dat de draagbare plaatlezer camera overbelicht raakt door lege putten.
7. Snijd met behulp van een 2 mm biopsiepons en pincet BSA-geblokkeerde filterpapierschijven en plaats ze in de reactieputten door de pons uit te werpen of door een pincet te gebruiken (zie Aanvullend Protocol voor het bereiden van BSA-geblokkeerd filterpapier). Dispense drievoudige volumes van 1,8 μL van elke reactiebuis op de filterpapierschijven in de 384-well plaat, waarbij alle monsters, evenals de 384-well plaat, te allen tijde op ijs worden gehouden.
   OPMERKING: Als u het draagbare plaatlezerapparaat gebruikt, voegt u 1,8 μL CPRG (0,6 mg /ml) toe aan elk van de vier hoeken van de 384-well plaat. De gele kleur van de CPRG biedt patroonherkenning aan de draagbare plaatlezer voor uitlijning van de digitale multiwell-plaatsjabloon in beeldanalyse. Bedek de putten van de plaat met PCR-film om verdamping te voorkomen.
8. Plaats de plaat in een plaatlezer, lees OD₅₇₀ bij 37 °C elke minuut gedurende 130 min.

Bestanddeel	Volume	Eindconcentratie per reactie
Oplossing A	2,38 μL	40%
Oplossing B	1,78 μL	30%
RNase-remmer	0,03 μL	0,5% v/v
CPRG (25 mg/ml)	0,14 μL	0,6 mg/ml
Toehold Schakelaar	X μL	33 nM
Doel-RNA	X μL	1 μM
Nucleasevrij water	tot 5,94 μL	-
Totaal volume:		5,94 μL

Tabel 5: PURExpress celvrije transcriptie-translatiereactiecomponenten.

7. Het identificeren van goed presterende grijpschakelaars

OPMERKING: In dit gedeelte wordt beschreven hoe u gegevens uit stap 6 kunt analyseren om de best presterende toehold-switches te selecteren om mee verder te gaan.

1. Begin met gegevensanalyse door eerst te normaliseren naar de od_{570-absorptie} op de achtergrond. Om dit te doen, trekt u de OD_570-metingen van reacties die geen schakelaar of doel-RNA hebben (d.w.z. celvrije alleen putten) af van de andere OD_570-metingen .
2. Maak de genormaliseerde gegevens glad met behulp van een driepunts voortschrijdend gemiddelde en stel de minimumwaarde van elke put in op nul. Zie figuur 3 voor een voorbeeld van genormaliseerde tijdsverloopgegevens die zijn verzameld voor de sleufschakelaars 27B, 33B en 47B.
3. Bereken met behulp van deze verwerkte gegevens de vouwverandering (of AAN/UIT-verhouding) door het verschil te bepalen in de snelheid van kleurverandering (d.w.z. verandering in OD₅₇₀ in de loop van de tijd) tussen de teengreepschakelaar en de doel- en schakelputten (zie aanvullend protocol voor het berekenen van de verhouding; Figuur 4).
4. Selecteer schakelaars met de hoogste AAN/UIT-vouwverandering voor verdere karakterisering. Laat de slecht presterende klepschakelaars weg die de laagste vouwverandering weergeven.

8. Screening en gevoeligheid van amplificatieprimers op basis van nucleïnezuursequentie

OPMERKING: In de volgende stappen wordt eerst een screening uitgevoerd op functionele isotherme amplificatieprimers en vervolgens wordt hun gevoeligheid beoordeeld door het aantal doel-RNA-kopieën per μL synthetisch RNA te bepalen dat een bepaalde toehold-schakelaar betrouwbaar kan detecteren in combinatie met isothermische amplificatie. Voer na isothermische amplificatie celvrije reacties uit om succesvolle op nucleïnezuursequentie gebaseerde amplificatieprimersets te identificeren. Het kan echter kosteneffectiever zijn om polyacrylamide of agarose-gels uit te voeren op op nucleïnezuursequentie gebaseerde amplificatiereacties om eerst de pool van kandidaat-primersets te verkleinen. In dat geval kunnen op nucleïnezuur gebaseerde amplificatieprimersets die een band op de gel genereren met de juiste amplicongrootte op de shortlist worden geplaatst voor daaropvolgende celvrije screening.

1. Maak een 25 μM stockoplossing van alle voorwaartse en omgekeerde primersets in nucleasevrij water (zie Aanvullend Protocol). Bepaal het aantal op nucleïnezuursequentie gebaseerde amplificatiereacties en de daaropvolgende celvrije reacties die moeten worden opgezet. Dit is afhankelijk van het aantal toehold switches en respectievelijke primersets.
   OPMERKING: Bij het screenen van de primers is het belangrijk om altijd een no template-besturingselement voor elke primerset op te nemen om rekening te houden met eventuele achtergrondartefacten die kunnen ontstaan als gevolg van primer-geassocieerde niet-specifieke versterking.
2. Stel als volgt een reactie van 5 μL in (schaal deze indien nodig). Ontdooi alle reagentia op ijs. Stel een reactiemastermix samen van de reactiebuffer, nucleotidemix en RNase-remmer volgens tabel 6. Meng grondig door op en neer te pipetteren totdat het witte neerslag is opgelost en doseer vervolgens aliquots in PCR-buizen.
   1. Als de mastermix bedoeld is voor het screenen van op nucleïnezuur sequentie gebaseerde amplificatieprimers, sluit dan eerst de primers uit van de mastermix (dispense 2,55 μL mastermix). Anders kunnen, als u een primergevoeligheidsanalyse uitvoert, de primers worden opgenomen in de mastermix (in welk geval 2,75 μL aliquots worden verstrekt). Voeg het enzymmengsel toe na de denaturatie- en evenwichtsfasen.
3. Als u nucleïnezuursequentie-gebaseerde amplificatieprimers screent, voegt u de voorste en omgekeerde primers toe aan de juiste buizen. Stel op een thermische cycler het incubatieprotocol in zoals beschreven in tabel 7.
4. Voeg 1 μL nucleasevrij water of 1 μL doeltrigger-RNA toe bij 2 pM of ongeveer 10⁶ kopieën /μL, en zorg ervoor dat de buisjes dienovereenkomstig worden geëtiketteerd. Meng door zachtjes te pipetteren en draai kort door de buizen.
   OPMERKING: Gebruik voor primer set screening een concentratie van target trigger RNA die hoog genoeg is om de ondergrens van detectie van de isotherme amplificatiemethode niet te beïnvloeden, maar niet hoog genoeg om activering van de toehold-schakelaar te bieden als er geen versterking zou optreden.
5. Verplaats de buizen naar de thermische cycler en start de incubatie. Verwijder na 12 minuten de buisjes en voeg 1,25 μL van het enzymmengsel toe aan elke buis. Meng door op en neer te pipetteren en centrifugeer de buizen kort.
   OPMERKING: Op dit punt kunnen de buizen op kamertemperatuur worden gehouden; het enzymmengsel moet echter op ijs worden bewaard totdat het aan de buisjes wordt toegevoegd.
6. Breng de buizen terug naar de thermische cycler en sla de 41 °C hold-stap over om de 1 uur reactie-incubatie te starten.
   OPMERKING: Na incubatie kunnen de reacties op ijs worden geplaatst voor verwerking op dezelfde dag of worden ingevroren bij -20 °C voor latere verwerking.
7. Volg de stappen 6.2-6.7 en tabel 8 om op papier gebaseerde celvrije toehold-schakelreacties samen te stellen om de primerprestaties te beoordelen. Analyseer gegevens zoals beschreven in stap 7.1-7.2 en figuur 3.
   OPMERKING: Naast de eerder genoemde controles is het belangrijk om ook de negatieve controle op te nemen om rekening te houden met elk achtergrondsignaal dat uit de reactie kan voortvloeien. Daarnaast is het belangrijk om ook een controle met de schakelaar en 2 pM (eindconcentratie) van doel-RNA op te nemen, als een no-NASBA-amplificatiecontrole.
8. Identificeer kandidaat-primerparen om verder te gaan met gevoeligheidsanalyse. Primerparen worden geselecteerd op basis van de vraag of de activering van de toehold-schakelaar optreedt na de toevoeging van de geïncubeerde reactie. Herhaal indien nodig het primerscherm met meer primercombinaties.
9. Houd RNA-monsters te allen tijde op ijs en maak de volgende seriële verdunningsset van doel-RNA's in nucleasevrij water: 10⁴, 10³, 10², 10¹ en 10⁰ RNA-kopieën / μL. Herhaal op nucleïnezuursequentie gebaseerde amplificatie en celvrije reacties met de geselecteerde primersets (stappen 8.2-8.7), waarbij de seriële verdunningsreeks wordt getest om de primersets te identificeren die de beste gevoeligheid bieden. Zie figuur 5 voor een voorbeeld van resultaten voor het bepalen van de gevoeligheid van de primerset.
   OPMERKING: Idealiter zouden de geselecteerde toehold-schakelaar en het primerpaar slechts 1-100 doel-RNA-kopieën per μL van het RNA (stockoplossingconcentratie) moeten detecteren.
10. Herhaal het op nucleïnezuur gebaseerde amplificatiegevoeligheidsexperiment in biologisch triplicaat. Deze stap dient om de reproduceerbaarheid van de resultaten te bevestigen voordat u overgaat tot experimenten met patiëntmonsters.
11. Facultatief: Om een betrouwbare bron van het switch-DNA te hebben voor langdurig gebruik en voor transport, kloont u de geselecteerde switchvolgorde(s) in een plasmide met behulp van een conventionele kloonmethode. Op dezelfde manier kan de RNA-sequentie van de doeltrigger ook worden gekloond in een plasmide naar keuze voor opslag.

Bestanddeel	Volume per reactie	Eindconcentratie
NASBA-reactiebuffer	1,67 μL	1x
NASBA Nucleotide Mix	0,833 μL	1x
25 μM Voorwaartse Primer	0,1 μL	0,5 μM
25 μM Omgekeerde Primer	0,1 μL	0,5 μM
RNase-remmer (40 U/μL)	0,05 μL	0,4 U/μL
Doel-RNA	1 μL
NASBA Enzym Mix	1,25 μL	1x
Totaal volume	5 μL

Tabel 6: NASBA-reactiecomponenten.

Stap	Temperatuur	Tijd
Denaturatie	65 °C	2 min.
Evenwicht	41 °C	10 min.
Houden	41 °C	∞
Incubatie	41 °C	1 u
Houden	4 °C	-

Tabel 7: Reactieomstandigheden voor de NASBA.

Bestanddeel	Volume	Eindconcentratie per reactie
Oplossing A	2,38 μL	40%
Oplossing B	1,78 μL	30%
RNase-remmer	0,03 μL	0,5% v/v
CPRG (25 mg/ml)	0,14 μL	0,6 mg/ml
Toehold Schakelaar	X μL	33 nM
Doel-RNA (indien van toepassing)	X μL	1 μM
NASBA (indien van toepassing)	0,85 μL	1:7
Nucleasevrij water	tot 5,94 μL	-
Totaal volume:		5,94 μL

Tabel 8: Op papier gebaseerde celvrije reactiecomponenten.

9. Verzameling van patiëntmonsters en virale RNA-extractie

OPMERKING: In dit gedeelte wordt het protocol beschreven om patiëntmonsters te verzamelen en het RNA te extraheren met behulp van een RNA-zuiveringskit. Het onderstaande protocol wordt gebruikt om serum uit perifeer bloed te verkrijgen. De monsters die in deze studie werden gebruikt, werden verzameld van patiënten met koorts, exantheem, artralgie of andere gerelateerde symptomen van arbovirusinfectie in de staat Pernambuco, Brazilië.

1. Verzamel perifere bloedmonsters van vermoedelijk met arbovirus geïnfecteerde patiënten. Voer venapunctie (volbloedbuis) uit met behulp van een standaard aseptische techniek. Label de monsterbuizen met een anonieme code en de datum van monsterverzameling.
2. Centrifugeer bloed om het serum te scheiden op 2.300 x g gedurende 10 minuten. Bereid met behulp van een pipet aliquots serum (200 μL) die zullen worden gebruikt voor RNA-extractie in buizen van 1,5 ml.
   OPMERKING: Als het niet mogelijk is om de RNA-extractie kort na het verzamelen van het monster uit te voeren, moeten serummonsters worden bewaard bij -80 °C voorafgaand aan downstream-toepassingen.
3. Pipetteer 560 μL bereide buffer AVL (virale lysisbuffer) met het drager-RNA in een buisje van 1,5 ml. Voeg 140 μL serum toe aan het buffer AVL/drager-RNA-mengsel in de buis. Mix door puls-vortexing gedurende 15 s.
4. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en centrifugeer het monster vervolgens kort om de inhoud op de bodem van de buis te verzamelen. Voeg 560 μL ethanol (96%-100%) toe aan het monster en meng door puls-vortexing gedurende 15 s. Na het mengen, centrifugeer het monster om de inhoud op de bodem van de buis te verzamelen.
5. Voeg voorzichtig 630 μL van de oplossing uit stap 9.4 toe aan de spinkolom zonder de rand nat te maken. Sluit na deze stap de dop en centrifugeer gedurende 1 minuut op 6.000 x g . Plaats de spinkolom in een schone opvangbuis van 2 ml en gooi de gebruikte opvangbuis met het filtraat weg.
6. Open voorzichtig de spin-kolom en herhaal stap 9.5. Open voorzichtig de spinkolom en voeg 500 μL Buffer AW1 (wasbuffer 1) toe. Sluit de dop en centrifugeer gedurende 1 minuut op 6.000 x g . Plaats de spinkolom in een schone opvangbuis van 2 ml en gooi de gebruikte opvangbuis met het filtraat weg.
7. Open voorzichtig de spinkolom en voeg 500 μL Buffer AW2 (wasbuffer 2) toe. Sluit de dop en centrifugeer gedurende 3 minuten op 20.000 x g . Plaats de spinkolom in een schone opvangbuis van 2 ml en gooi de gebruikte opvangbuis met het filtraat weg.
8. Om verontreiniging door restbuffer AW2 te voorkomen, die problemen kan veroorzaken in downstream enzymatische reacties, plaatst u de spinkolom in een schone 2 ml opvangbuis en gooit u de gebruikte opvangbuis weg met het filtraat. Centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 1 min.
9. Plaats de spinkolom in een schone buis van 1,5 ml en gooi de gebruikte opvangbuis met het filtraat weg. Open voorzichtig de spinkolom en voeg 60 μL buffer AVE (elutiebuffer) toe, op kamertemperatuur gebracht. Sluit na deze stap de dop en incubeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
10. Centrifugeer bij 6.000 x g gedurende 1 min. Het geëlueerde RNA kan vervolgens parallel worden gebruikt als input voor de NASBA en RT-qPCRs.
11. Volg stap 8.3 tot en met 8.11 om de op nucleïnezuursequentie gebaseerde amplificatie en op papier gebaseerde celvrije reacties uit te voeren met behulp van 1 μL geëxtraheerd patiënt-RNA, waarbij ervoor wordt gezorgd dat negatieve en positieve controlereacties worden opgenomen. Bereid na de reacties de 384-well reactieplaat voor en voer de test uit in de draagbare plaatlezer bij 37 °C (zie details in het Aanvullend Protocol).
    OPMERKING: Twee RNA-concentraties van 10⁴ en 10² PFU / ml, geëxtraheerd uit gekweekt zikavirus, worden gebruikt als positieve controles voor alle experimenten tijdens de klinische validatie. Naast de eerder genoemde controles is het belangrijk om ook de trigger (10 ng/μL) als positieve controle op te nemen.
12. Aan het einde van elk experiment kunnen de onbewerkte gegevens (.csv bestand) van de prtable plate reader online worden geüpload naar een beveiligde database. Bovendien genereert de draagbare plaatlezer een rapport dat aangeeft of monsters positief of negatief zijn voor het Zika-virus (figuur 6); zie de sectie representatieve resultaten voor voorbeelden van alle grafieken die tijdens de incubatie zijn verkregen (figuur 7).
    OPMERKING: Gebruikers kunnen ook bestanden van de draagbare plaatlezer via de USB naar hun eigen computer overbrengen.

10. Draagbaar plaatlezerapparaat

1. Het draagbare plaatlezerapparaat (figuur 8) kan worden gebruikt als alternatief voor een conventionele plaatlezer²⁴. Voor het protocol en de representatieve resultaten, zie Aanvullend Protocol.

11. RT-qPCR voor Zika virus detectie

OPMERKING: In deze sectie worden de stappen beschreven voor het uitvoeren van de RT-qPCR voor Zika-virusdetectie op basis van patiëntmonsters (zie Aanvullend Protocol).

1. Om verontreiniging te voorkomen, assembleert u de RT-qPCR-componenten in een gebied dat geïsoleerd is van het versterkingsproces (bijv. clean-hood). Plaats de RT-qPCR-buffer, enzymen en primer/sondes op ijs of een koudblok. Voeg hierna de reacties toe aan een plaat met 384 putten op ijs volgens tabel 9.
   OPMERKING: Negatieve (extractiecontrole en niet-sjablooncontrole [NTC]) en positieve controle (10⁴ PFU / ml) worden aanbevolen voor alle experimenten.
2. Nadat u de reagentia aan een microcentrifugebuis van 1,5 ml hebt toegevoegd, mengt u de reactie door op en neer te pipetteren (vortex niet) en doseert u 6,5 μL in elke put. Voeg 3,5 μL van elke RNA-sjabloon toe in drievoud.
3. Plaats een PCR-film over de bovenkant van de plaat. Centrifugeer de 384-well plaat op 600 x g gedurende 2 min.
4. Plaats de plaat in een RT-qPCR-machine met behulp van de volgende in tabel 10 beschreven cyclusomstandigheden. Om de resultaten te analyseren, gebruikt u de RT-qPCR-machineontwerp- en analysesoftware en houdt u rekening met de automatische drempel en basislijn (zie details in het Aanvullend Protocol).

Bestanddeel	Volume	Concentratie
2x QuantiNova Probe RT-PCR Master Mix |	5 μL	1 x
100 μM Voorwaartse Primer	0,08 μL	0,8 μM
100 μM Omgekeerde Primer	0,08 μL	0,8 μM
25 μM sonde	0,04 μL	0,1 μM
QuantiNova ROX Referentiekleurstof	0,05 μL	1 x
QuantiNova Probe RT Mix	0,1 μL	1 x
Sjabloon RNA	3,5 μL	-
Nucleasevrij water	tot 10 μL	-

Tabel 9: RT-qPCR-componenten om Zika-virus-RNA te versterken op basis van het Centers for Disease Control and Prevention-CDC USA-protocol om het Zika-virus uit patiëntmonsters te detecteren³¹.

Stap		Temperatuur	Tijd
Reverse transcriptie		45 °C	15 min.
PCR initiële activeringsstap		95 °C	5 min.
45 cycli	Denaturatie	95 °C	5 s
	Gecombineerd gloeien/verlengen	60 °C	45 s

Tabel 10: Fietsomstandigheden voor RT-qPCR.

Results

Na de computationele ontwerppijplijn werd de bouw van drie toehold-switches uitgevoerd door PCR. De PCR-producten werden geanalyseerd met behulp van agarose gel-elektroforese (figuur 2). De aanwezigheid van een heldere band rond 3.000 bp, ongeveer de grootte van het lacZ-gen gekoppeld aan een teengreepschakelaar, duidt meestal op een succesvolle reactie. Een baan zonder band, meerdere banden of een band van de verkeerde grootte geeft ook een mislukte PCR aan. In het geval van een defecte PCR moeten de reactiecondities en/of primersequenties worden geoptimaliseerd.

De geassembleerde grijpschakelaars werden gescreend om elke sensor te beoordelen aan de hand van zijn respectievelijke in vitro getranscribeerde trigger-RNA (figuur 3). Terwijl alle drie de sensoren een verhoogde OD_{570-absorptie} vertoonden, had schakelaar 27B (figuur 3A) de snelste on-rate. Schakelaars 33B en, in mindere mate, 47B vertoonden een verhoogde OD_{570-absorptie} in afwezigheid van target trigger-RNA, wat aangeeft dat deze schakelaars enige achtergrondactiviteit of lekkage bezitten (figuur 3B, C) - een eigenschap die niet gewenst is in een kandidaat-sensor omdat het de specificiteit kan verminderen. Om de sensor met de hoogste AAN/UIT-signaalverhouding duidelijker te identificeren, werd de vouwverandering van de ABSORPTIE VAN OD₅₇₀ berekend (zie aanvullende informatie rubriek 5) en uitgezet (figuur 4). Uit deze analyse blijkt dat schakelaar 27B de sensor is die de beste prestaties levert met een AAN/UIT-verhouding van rond de 60.

De gevoeligheid van de best presterende toehold-schakelaar (27B) werd vervolgens geëvalueerd door de laagste RNA-concentratie te bepalen die nodig is om de toehold-schakelaar te activeren in combinatie met een NASBA-reactie. De grafiek illustreert dat de best presterende Zika-sensoren RNA kunnen detecteren bij concentraties zo laag als 1,24 moleculen per μL (gelijk aan ~ 2 aM; Figuur 5).

Nadat schakelaar 27B was geïdentificeerd en gevalideerd, werden de sensormaterialen gedistribueerd naar de teamleden in Recife in de Braziliaanse deelstaat Pernambuco. In Brazilië werd de klinische diagnostische nauwkeurigheid van het diagnostische platform voor het Zika-virus beoordeeld met behulp van monsters van Zika-viruspatiënten, parallel aan RT-qPCR voor vergelijking. Om het op papier gebaseerde Zika-diagnostische platform te valideren, werd de draagbare plaatlezer gebruikt, die in staat is om de colorimetrische uitvoer van op papier gebaseerde sensoren te incuberen en te lezen. De kleurverandering van geel naar paars wordt gebruikt om een positief monster te identificeren, terwijl een negatief monster geel blijft (figuur 6). Een extra optie voor het visualiseren van de resultaten die door de draagbare plaatlezer worden gegenereerd (figuur 8) is om de colorimetrische respons voor elke op papier gebaseerde reactie in de loop van de tijd te plotten. Monsters werden in drievoud getest en monsters die de drempel overschreden (rode lijn ingesteld op 1) werden als positief beschouwd, terwijl monsters onder de drempel als negatief werden beschouwd (figuur 6 en figuur 7).

Ten slotte, om de klinische prestaties van de Zika-greepschakelaarsensor te evalueren en te vergelijken met de huidige gouden standaardmethode voor het diagnosticeren van Zika-virusinfectie, werden alle patiëntmonsters parallel met RT-qPCR getest. De amplificatieplot van twee representatieve patiëntenmonsters werd in drievoud getest voor de detectie van het Zika-virus door RT-qPCR (figuur 9). De monsters worden als positief beschouwd wanneer de cyclusdrempel (Ct) ≤38 is; de rode lijn geeft een positief monster aan en de blauwe lijn geeft een negatief monster voor het Zika-virus aan.

Figuur 2: Agarose gel elektroforese om de kwaliteit van PCR-producten te beoordelen. PCR-producten worden geanalyseerd op een 1% agarose-gel in 1X TAE, uitgevoerd op 80 V gedurende 90 minuten. Een enkele duidelijke band duidt meestal op een succesvolle reactie. Baan 1: 1 kb DNA ladder; Lanes 2-4: 27B switch DNA, 33B trigger DNA en 47B trigger DNA, respectievelijk. De nummers aan de linkerkant vertegenwoordigen de bandgrootte in bp. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Prototyping van drie grijpschakelaars voor op papier gebaseerde Zika-sensoren. De prestaties van drie op papier gebaseerde RNA-toevoerschakelaarsensoren werden gemeten bij 37 °C gedurende meer dan 130 minuten. Elke grafiek bevat twee sporen, één vertegenwoordigt de schakelaar alleen controle, terwijl de andere de schakelaar en trigger vertegenwoordigt. De drie grafieken geven gegevens weer die zijn verkregen met behulp van de sensoren 27B (A), 33B (B) en 47B (C). Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde (SEM) van drie replicaties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: De best presterende sensoren worden geïdentificeerd door de vouwverandering in absorptie bij 570 nm te berekenen. Vouwverandering (of maximale AAN/UIT-verhouding) wordt berekend door de absorptieverhouding (OD₅₇₀) te meten op 130 minuten tussen de schakelaar alleen controle en de schakelaar plus trigger CFPS-test. Foutbalken vertegenwoordigen SEM van drie replicaties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Gevoeligheidsbeoordeling van de best presterende switch. In vitro getranscribeerd Zika-RNA wordt getitreerd in NASBA-reacties. Na een incubatie van 1 uur werden de reacties toegevoegd aan celvrije PURExpress-reacties op papieren schijven in een verhouding van 1:7. De vouwwissel na 130 min bij 37 °C wordt uitgezet. Dit cijfer is gereproduceerd van²⁴. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Draagbare plaatlezer opnamepagina geladen met vastgelegde afbeeldingsgegevens. Deze afbeelding toont een voorbeeldafbeelding van de uiteindelijke afbeelding die door de draagbare plaatlezer is vastgelegd tijdens een gegevensverzamelingsrun. De oorspronkelijke datum-/tijdstempel is zichtbaar boven aan de afbeelding. Gele kleur duidt op controle of negatieve reacties en de paarse kleur duidt op een positieve reactie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Gegevensanalysemodus. Aan de linkerkant selecteren gebruikers de datasets die ze willen plotten; de grafieken worden vervolgens aan de rechterkant weergegeven met unieke kleuren voor elk monster of controleset. De stippellijn dient als drempel voor het bepalen van positieve en negatieve monsters. Monsters die in drievoud zijn getest en de drempel overschrijden, worden als positief beschouwd, terwijl monsters onder de drempel als negatief worden beschouwd. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie (SD) van drie replicaties. Ctrl 1 tot Ctrl 5 geeft besturingselementen aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8. PLUM, een draagbare plaatlezer. Deze draagbare plaatlezer fungeert als een lab-in-a-box en dient als een temperatuurgestuurde plaatlezer om colorimetrische reacties te incuberen en te bewaken. Dit draagbare apparaat kan kwantitatieve en high-throughput metingen van de op papier gebaseerde Zika-sensoren ter plaatse leveren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 9: RT-qPCR-plot van de versterking van twee patiëntmonsters die in drievoud zijn getest voor de detectie van het Zika-virus. Monsters worden als positief beschouwd wanneer de cyclusdrempel (Ct) ≤38 is. De gestippelde rode lijn dient als drempel voor het bepalen van positieve en negatieve monsters. Het rode spoor duidt op een positief monster en het blauwe spoor op een negatief monster. De ΔRn-waarde (delta Rn) vertegenwoordigt de genormaliseerde grootte van het fluorescentiesignaal dat door het RT-qPCR-instrument wordt gedetecteerd voor alle geteste monsters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend Protocol Dossier. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende cijfers. Klik hier om deze cijfers te downloaden. 

Discussion

Het gecombineerde op papier gebaseerde systeem dat hier wordt beschreven, kan klinisch relevante moleculaire diagnostiek, met prestaties die functioneel vergelijkbaar zijn met RT-qPCR, naar het punt-van-behoefte brengen⁶. Belangrijk is dat voor externe instellingen de beschikbaarheid van diagnose op locatie de tijd tot resultaten kan verkorten van dagen tot uren. Om de programmeerbaarheid van deze aanpak te benadrukken, kan de beschreven pijplijn worden gebruikt om vrijwel elk pathogeendoel te detecteren. We hebben de moleculaire gereedschappen gekoppeld aan een speciaal gebouwde draagbare plaatlezer, die compact is en compatibel met batterijwerking (8-9 uur) en on-board data-analyse biedt om gedistribueerde toepassingen mogelijk te maken. In ander werk hebben we de gecombineerde hardware en het diagnostische platform voor het Zika-virus gevalideerd met 268 patiëntmonsters, parallel aan RT-qPCR, en een diagnostische nauwkeurigheid van 98,5% ²⁴ gevonden. Alles bij elkaar genomen is ons doel om de technologieoverdracht van dit platform aan onderzoekers mogelijk te maken, zodat het door de gemeenschap kan worden hergebruikt en verbeterd om onvervulde diagnostische behoeften aan te pakken.

Het ontwerpproces van de in silico toehold switch is geïntegreerd en geautomatiseerd in een pijplijn die in drie fasen kan worden verdeeld. De eerste fase genereert een pool van toehold switch-ontwerpen die hybridiseren naar de doelsequentie in één nucleotide-stappen. De tweede fase onderzoekt de secundaire structuur en de beschikbaarheid van de sleufschakelaar en elimineert sensoren met in-frame voortijdige stopcodons. Een scoringsfunctie die rekening houdt met meerdere factoren (bijv. defectniveau van de toehold-switch, beschikbaarheid van toehold-switch en toegankelijkheid van de doellocatie) wordt vervolgens geïmplementeerd om top toehold-switchontwerpen te selecteren op basis van algemene scores. In de laatste fase wordt een lijst met sequenties gegenereerd voor de top toehold switch-ontwerpen en de bijbehorende doeltriggers. De bovenste sensorsequenties moeten worden gescreend op specificiteit tegen het menselijke transcriptoom en nauw verwante virale genomen met behulp van NCBI/Primer-BLAST²⁵. Het is ook de beste praktijk om de sensordoellocaties te screenen op sequentiebehoud in het Zika-virale genoom om ervoor te zorgen dat de sensoren een brede en robuuste detectie bieden. Er zijn verschillende versies van de ontwerpsoftware voor de toehold-schakelaar ontwikkeld en het ontwerpalgoritme stelt gebruikers in staat om twee versies te genereren, ofwel serie A⁶ of serie B-sleufschakelaars⁶. In dit artikel ligt de focus op het serie B-staartschakelaarontwerp.

Na commerciële DNA-synthese kunnen de toehold-schakelaars snel worden geassembleerd en vervolgens worden getest door een eerste screening uit te voeren tegen een synthetische doeltriggersequentie die overeenkomt met korte regio's (200-300 nt) van het doelgenoom. Voor het screenen van de prestaties van op toehold switch gebaseerde sensoren is het ideaal om de doelsequentie in de vorm van RNA toe te voegen. In dit artikel zijn de stappen beschreven die nodig zijn om in vitro getranscribeerd trigger-RNA toe te voegen. Indien beschikbaar, kunnen echter genoomsjablonen over de volledige lengte worden gebruikt, zoals gekwantificeerde virale RNA-extracten of commerciële synthetische RNA-genomen of -standaarden. Het gebruik van volledige RNA-genomen voor de eerste screening van de toehold-switch is gunstig omdat het kan informeren of aanvullende factoren, zoals de secundaire structuur van RNA, de sensorprestaties zullen beïnvloeden. Om de AAN/UIT-verhouding van kandidaatschakelaars te optimaliseren, kan het DNA van de grijpschakelaar worden getitreerd in de celvrije reactie. Deze stap kan ook dienen om goed presterende toehold-schakelaars te identificeren (vouwversterking of hoge AAN / UIT-ratio) en lekkende toehold-schakelaars (hoog signaal in afwezigheid van het doel-RNA) weg te laten uit downstream-karakteriseringsstappen.

Om de detectiegrens van de best presterende toehold switch-kandidaten te verbeteren, wordt NASBA gebruikt om klinisch relevante concentraties van doel-Zika viraal RNA te verhogen tot een niveau dat kan worden gedetecteerd door toehold switches⁶. Verschillende combinaties van voorwaartse en omgekeerde primersets worden gescreend om de beste NASBA-primer- en toehold-switchcombinaties te bepalen om detectie bij klinisch relevante concentraties mogelijk te maken. Zodra een ideale primer set en toehold switch combinatie is geïdentificeerd, wordt de assay verder gebracht naar klinische validatie. Het is belangrijk op te merken dat de teengreepschakelaar en NASBA-screeningsfasen arbeids- en resource-intensief kunnen zijn en daarom is testontwikkeling het meest geschikt voor goed uitgeruste onderzoekslocaties. Hoewel we geen procesautomatisering hebben toegepast, is het waarschijnlijk dat dit de iteratieve ontwerp-, bouw- en testcyclus³² kan versnellen. Gelukkig kan de doorlooptijd van sensorontwerp en testen tot implementatie opmerkelijk kort zijn (minder dan een week), waardoor deze strategie ideaal is voor tijdkritische situaties, zoals epidemische uitbraken⁶.

Zelfs nadat een biosensor met klinisch relevante gevoeligheid is ontwikkeld, zijn er technische uitdagingen die moeten worden aangepakt. Aangezien dit protocol handmatige bediening omvat en een procedure met meerdere stappen is, bestaat het risico op kruisbesmetting tussen monsters. We doen ons best om dit risico te verminderen door zorgvuldige laboratoriumpraktijken. In een recente klinische studie van 268 patiëntenmonsters ondervonden we geen besmettingsproblemen; het is echter een belangrijke overweging²⁴. Met dit in gedachten blijft het protocol een laboratoriumtest en vereist het een bekwame gebruiker met de juiste moleculaire biologietechnieken. Een extra overweging voor de inzet is de RNA-isolatie van patiëntmonsters. Hier beschrijven we RNA-isolatie met behulp van kolomgebaseerde nucleïnezuurextractiekits. In ander werk hebben we echter een effectieve en eenvoudige kooklysemethode gedemonstreerd (95 °C gedurende 2 minuten) voor de verwerking van patiëntmonsters met lage belasting⁶. Deze strategie elimineert bijna de kosten die gepaard gaan met RNA-extractie en vermijdt het gebruik van kolomgebaseerde nucleïnezuurextractiekits, die een logistieke uitdaging kunnen vormen in omgevingen met weinig middelen of problemen met de toeleveringsketen tijdens crises, zoals de COVID-19-pandemie³³.

Zoals we tijdens de COVID-19-pandemie hebben gezien, kunnen de instrumenten die worden gebruikt om RT-qPCR uit te voeren zelf als een knelpunt dienen en de toegang van patiënten tot testen beperken. Deze factor, die ook grotendeels financieel is, leidt tot een gecentraliseerde testmodus die de diagnostische toegang kan beperken. Tijdens de Zika-uitbraak van 2015/2016 waren bijvoorbeeld slechts vijf nationale referentielaboratoria beschikbaar in Brazilië, wat vertragingen veroorzaakte bij het testen van patiënten. Zonder rekening te houden met het potentiële voordeel van schaalvoordelen, zijn de huidige kosten van goederen voor de draagbare plaatlezer ~ $ 500 USD, die zelfs als deze vervijfvoudigd is om rekening te houden met arbeid en commerciële marge, nog steeds een betaalbaar instrument biedt. Dit is goed te vergelijken met RT-qPCR-instrumenten die variëren in kosten van $ 15.000 - $ 90.000 USD³⁴. Bovendien zijn de geschatte kosten per test voor de celvrije test in Latijns-Amerika ongeveer $ 5,48 USD, terwijl de kosten per test van RT-qPCR in Brazilië ~ $ 10-11 USD waren ten tijde van de Zika-uitbraak³⁶. Naast de kosten van apparatuur, heeft de draagbare plaatlezer een kleine voetafdruk (20 cm³), automatische analyse, gegevensupload naar de cloud via internet en kan deze op batterijvoeding worden uitgevoerd. Deze functies breiden de potentiële instellingen waar testen kan worden ingezet drastisch uit en breiden tegelijkertijd de patiëntenpopulatie uit die kan worden bediend.

Tot op heden zijn de meest voorkomende commerciële E. coli CFPS-platforms de S30- en PURE-systemen³⁷; een belangrijke overweging bij het verbeteren van de toegang tot diagnostiek in lage- en middeninkomenslanden is echter de beperkte binnenlandse beschikbaarheid van deze reagentia. Een belangrijke stap in de richting van het oplossen van deze uitdaging is de ontwikkeling van lokale CFPS-productie. Het Federici-lab heeft onlangs aanzienlijke vooruitgang geboekt bij de ontwikkeling van een niet-commercieel platform om op lysaat gebaseerde sensoren te implementeren in op lysaat gebaseerde celvrije systemen, met een LOD van 2,7 fM met Zika-virus RNA¹⁴. Deze prestatie maakt het niet alleen mogelijk om de reagentia in het land van gebruik te maken, waardoor importtarieven en vertragingen worden vermeden, maar de arbeidskosten schalen ook naar lokale tarieven en dus kunnen de totale kosten aanzienlijk worden verlaagd. In het werk geschetst door de Federici-groep bedroegen de kosten voor het produceren van de CFPS-expressiereactie (5 μL) in Chili 6,9 cent (USD) ^35,38, wat een dubbele stimulans (verbeterde logistiek en kosten) biedt voor het implementeren van op lysaat gebaseerde systemen^35,38.

De plaatsing van RT-qPCR-vergelijkbare tests in gedistribueerde diagnostische netwerken kan aanzienlijke voordelen opleveren ten opzichte van de huidige praktijken die afhankelijk zijn van het transport van monsters naar gecentraliseerde RT-qPCR-faciliteiten. In peri-urbane omgevingen, waar Zika-gevallen geconcentreerd waren, vertraagt de fysieke afstand tussen een patiënt en de diagnostische faciliteit de diagnose en verhoogt het risico dat de resultaten de patiënt niet op een klinisch relevant moment bereiken. Het is onze hoop dat het hier gepresenteerde werk kan bijdragen aan het in staat stellen van de onderzoeksgemeenschap, door de overdracht van kennis, om gedecentraliseerde biotechnologie en draagbare hardware te creëren voor menselijke gezondheid, landbouw en milieumonitoring.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
384 well plate covers - aluminum	Sarstedt	95.1995	Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the PLUM reader
384 well plate covers - transparent	Sarstedt	95.1994	Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the BioTek plate reader
384 well plates	VWR	CA11006-180	2 mm paper-based diagnostics are placed into the wells of these plates for quantification
Agarose	BioShop Canada	AGA001.500	Gel electrophoresis
BSA	BioShop Canada	ALB001.500	Blocking agent for the Whatman filter paper
Cell free reactions	New England Biolabs	E6800L	PURExpress
CPRG	Roche	10884308001	Chlorophenol red-b-D-galactopyranoside
Disposable Sterile Biopsy Punches	Integra Miltex	23233-31	Used to create 2 mm paper discs that fit into a 384-well plate
DNAse I	Thermo Scientific	K2981	Digests template DNA following incubation of the in vitro transcription reaction
DNAse I Kit	Thermo Scientific	74104	DNase I Kit For removing template DNA from IVT RNA
dNTPs	New England Biolabs	N0446S	Used for PCRs
electrophoresis system	Bio-Rad	1704487	Used to run the agarose gels
Gel imaging station	Bio-Rad	1708265	ChemiDoc XRS+ Imaging System
IVT kit	New England Biolabs	E2040S	Used for in vitro transcribing template (trigger) RNA for switch screening
Nanodrop One	Thermo Scientific	ND-ONE-W	Used for determining nucleic acid concentrations
NASBA kit	Life Sciences Advanced Technologies	NWK-1	Isothermal amplification reaction components
Nuclease free H20	invitrogen	10977015	Added to reaction mixes
PAGE electrophoresis system	Biorad	1658001FC	Used to cast and run polyacrylamide gels
pCOLADuet-LacZ DNA	Addgene	75006	https://www.addgene.org/75006/
Phusion polymerase/reactioin buffer	New England Biolabs	M0530L	Used for PCRs
Plate reader	BioTek	BioTek NEO2	Multi Mode Plate Reader, Synergy Neo2
Primers	Integrated DNA Technologies		Custom oligo synthesis
Q5 polymerase/reaction buffer	New England Biolabs	M0491L	Used for PCRs
Qiagen PCR Puriifcation Kit	QIAGEN	27106	QIAprep Spin Miniprep Kit
RNA loading dye	New England Biolabs	B0363S	2X RNA loading dye
RNA Purification Kit	QIAGEN	EN0521	QIAamp Viral RNA extraction kit
RNase inhibitor	New England Biolabs	M0314S	Used to prevent contamination of RNases A, B, and C
RT-qPCR kit	QIAGEN	208352	QuantiNova Probe RT-PCR Kit
SYBR Gold	Invitrogen S11494	S11494	PAGE gel stain for nucleic acids
TAE Buffer	BioShop Canada	TAE222.4	Gel electrophoresis buffer
Thermal Cycler	Applied Biosystems	4484073	Used for temperature cycling and incubating reactions
Whatman 42 filter paper	GE Healthcare	1442-042	Used to imbed molecular components for paper-based diagnostics