Methodenartikel

Analyses van actinedynamica, koppelingskoppeling en tractiekracht voor groeiconusvooruitgang

DOI:

10.3791/63227

⸱

21 oktober 2021

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Systems Neurobiology and Medicine, Division of Biological Science, Nara Institute of Science and Technology, 2Laboratory of Data-Driven Biology, Division of Biological Science, Nara Institute of Science and Technology

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om vooruit te komen, moeten groeikegels tractiekrachten uitoefenen tegen de externe omgeving. Het genereren van trekkrachten is afhankelijk van actinedynamiek en koppeling. De huidige studie beschrijft methoden voor het analyseren van actinedynamica, koppelingskoppeling en tractiekrachten voor groeikegelvoortgang.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om functionele netwerken tot stand te brengen, moeten neuronen migreren naar hun juiste bestemmingen en vervolgens axonen uitbreiden naar hun doelcellen. Deze processen zijn afhankelijk van de vooruitgang van groeikegels die zich aan de uiteinden van neurieten bevinden. Axonale groeikegels genereren drijvende krachten door hun lokale micro-omgeving te detecteren en cytoskeletdynamiek en actine-adhesiekoppeling (koppelingskoppeling) te moduleren. Tientallen jaren van onderzoek hebben geleid tot de identificatie van geleidingsmoleculen, hun receptoren en stroomafwaartse signaalcascades voor het reguleren van neuronale migratie en axonale begeleiding; de moleculaire machines die nodig zijn voor het genereren van krachten om de voortgang en navigatie van de groeikegel te stimuleren, beginnen echter net te worden opgehelderd. Aan de voorzijde van neuronale groeikegels ondergaan actinefilamenten een retrograde stroom, die wordt aangedreven door actinepolymerisatie en actomyosinecontractie. Een koppelingskoppeling tussen F-actine retrograde flow en lijmsubstraat genereert tractiekrachten voor groeikegelvooruitgang. De huidige studie beschrijft een gedetailleerd protocol voor het monitoren van de F-actine retrograde stroom door middel van beeldvorming met enkele spikkels. Belangrijk is dat deze techniek in combinatie met een F-actine marker Lifeact 1) de F-actine polymerisatiesnelheid en 2) de koppelingskoppelingsefficiëntie tussen F-actine retrograde stroom en het lijmsubstraat kan kwantificeren. Beide zijn kritische variabelen voor het genereren van krachten voor groeikegelvooruitgang en navigatie. Bovendien beschrijft de huidige studie een gedetailleerd protocol van tractiekrachtmicroscopie, dat 3) tractiekracht gegenereerd door groeikegels kan kwantificeren. Dus door de analyses van single spikkelbeeldvorming en tractiekrachtmicroscopie te koppelen, kunnen onderzoekers de moleculaire mechanica volgen die ten grondslag ligt aan de voortgang en navigatie van groeikegels.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In het zich ontwikkelende gewervelde brein ondergaan neuronen uitgebreid georganiseerde migraties en projecteren axonen naar geschikte synaptische partners om functionele neuronale netwerken tot stand te brengen1,2,3. Groeikegels, die sensorische en beweeglijke structuren zijn die zich aan het uiteinde van neurieten bevinden, bepalen de snelheid en richting van neuronale migratie en axonuitgroei3,4,5. Omdat neuronen worden omringd door dicht opeengepakte omgevingen, moeten groeikegels krachten uitoefenen tegen hun omgeving om vooruit te komen6,7. Om de mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan neuronale migratie en axonale begeleiding, zijn analyses van de moleculaire mechanica voor groeikegelvoortgang essentieel.

Tientallen jaren van analyse hebben aangetoond dat tractiekracht om de vooruitgang van de groeikegel te stimuleren, wordt gegenereerd door het 'koppelingsmechanisme'; men denkt dat dit mechanisme niet alleen functioneert in de axonale groeikegel, maar ook in de leidende procesgroeikegel van migrerende neuronen8,9,10,11,12. Actinefilamenten (F-actinen) in groeikegels polymeriseren namelijk aan de voorrand en depolymeriseren proximaal, waardoor het voorste membraan13,14,15 wordt uitgestoten. De resulterende kracht, in combinatie met actomyosinecontractie, induceert achterwaartse beweging van F-actinen genaamd retrograde flow7,11,16,17,18,19,20,21. Koppelings- en celadhesiemoleculen bemiddelen de mechanische koppeling tussen de F-actine retrograde stroom en het lijmsubstraat en geven de kracht van de F-actinestroom door aan het substraat, waardoor tractiekracht wordt gegenereerd voor groeikegelvooruitgang7,8,9,11,12,22 . Tegelijkertijd vermindert de actine-substraatkoppeling de F-actinestroomsnelheid en zet actinepolymerisatie om in de kracht om het toonaangevende membraan uit te steken9,10.

Axonale groeikegels detecteren lokale chemische signalen en transformeren deze in een directionele drijvende kracht voor groeikegelnavigatie3,23,24,25. Een axongeleidingsmolecuul netrin-1 stimuleert bijvoorbeeld zijn receptor verwijderd bij colorectale kanker (DCC) en activeert het Rho guanosinetrifosfaat (GTP)-bindende eiwitten celdelingscontrole-eiwit 42 (Cdc42) en Ras-gerelateerd C3 botulinetoxinesubstraat 1 (Rac1), en hun stroomafwaartse kinase p21-geactiveerd kinase 1 (Pak1)26. Cdc42 en Rac1 bevorderen 1) actinepolymerisatie en Pak1 fosforyleert een koppelingsmolecuul shootin122,26. Shootin1 interageert met F-actine retrograde stroom via een actine-bindend eiwit cortactin27. Shootin1 interageert ook met L1 celadhesie molecuul (L1-CAM)20,24. Shootin1 fosforylering verhoogt de bindingsaffiniteiten voor cortactine en L1-CAM, en verbetert shootin1-gemedieerde 2) koppelingskoppeling24,27. Binnen de groeikegel nemen asymmetrische activeringen van actinepolymerisatie en koppelingskoppeling toe 3) tractiekracht aan de zijkant van de netrin-1-bron, waardoor directionele drijvende kracht wordt gegenereerd voor het draaien van groeikegels (figuur 1)24. Intensief onderzoek in de afgelopen decennia met betrekking tot neuronale migratie en axongeleiding heeft het begrip van geleidingsmoleculen, hun receptoren en bijbehorende stroomafwaartse signaalcascades2,10,28,29,30 verbeterd. De moleculaire machines om krachten te genereren voor de vooruitgang van de groeikegel beginnen echter nog maar net te worden opgehelderd; dit kan worden toegeschreven aan het beperkte gebruik van de protocollen voor mechanobiologische analyses.

De huidige studie beschrijft een gedetailleerd protocol voor het monitoren van de F-actine retrograde stroom door middel van beeldvorming met enkele spikkel16,18. Monitoring van F-actine retrograde stroom is uitgebreid uitgevoerd met behulp van superresolutie microscopie, spinning-disk confocale microscopie en total interference reflection fluorescence (TIRF) microscopie25,31,32,33,34,35,36,37,38 . Het protocol in deze studie maakt echter gebruik van een standaard epifluorescentiemicroscoop en is dus gemakkelijk over te nemen11,16,18,20,22,23,24,27,39,40,41,42. In combinatie met F-actine-etikettering door Lifeact43 maakt beeldvorming met enkele spikkel kwantificeringen mogelijk van de actinepolymerisatiesnelheid en de koppelingskoppelingsefficiëntie tussen F-actine retrograde stroom en het lijmsubstraat39,42. De huidige studie beschrijft verder een gedetailleerd protocol van tractiekrachtmicroscopie met behulp van een fluorescerende in kralen ingebedde polyacrylamide (PAA) gel11,22,23,24,27,39,41,42,44. Deze methode detecteert en kwantificeert de trekkracht onder de groeikegel door het monitoren van door kracht geïnduceerde kraalbewegingen44,45. Er wordt een open-source tractiekrachtanalysecode verstrekt en de methode voor het kwantificeren van tractiekracht tijdens groeikegelmigratie wordt in detail uitgelegd. Met behulp van single spikkelbeeldvorming en tractiekrachtmicroscopie zal het begrijpen van de moleculaire mechanica die ten grondslag ligt aan groeikegelmigratie en navigatie worden vergemakkelijkt. Deze technieken zijn ook toepasbaar voor het analyseren van de moleculaire mechanica die ten grondslag ligt aan dendritische wervelkolomvergroting, waarvan bekend is dat deze belangrijk is bij het leren en geheugen42.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimenten met proefdieren werden uitgevoerd met de Institutional Animal Care and Use Committee van het Nara Institute of Science and Technology. Onderzoekers moeten de vastgestelde richtlijnen van hun institutionele en nationale regelgevende comités voor dieren voor de verzorging en het gebruik van proefdieren volgen.

1. Voorbereiding van oplossingen en media

  1. Bereid de oplossingen en cultuurmedia voor zoals samengevat in Aanvullend dossier 1

2. Bereiding van poly-D-lysine (PDL)/laminine-gecoate substraten

  1. Bestrijk schalen met glazen bodem met een diameter van 14 mm met 100 μg/ml PDL, opgelost in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4), en incubeer gedurende een nacht in een bevochtigde incubator bij 37 °C.
    OPMERKING: Droog de glazen oppervlakken niet op na deze stap
  2. Verwijder de PDL-oplossing en pipetteer driemaal 1 ml PBS op het glas gedurende 10 s.
  3. Bestrijk de gerechten met 5 μg/ml laminine, opgelost in PBS, en incubeer gedurende een nacht in een bevochtigde incubator bij 37 °C.
  4. Verwijder de laminine-oplossing en pipetteer driemaal 1 ml PBS op het glas gedurende 10 s.
  5. Verwijder de PBS en plaats 0,5 ml van het neurobasismedium op de glazen oppervlakken. Bewaar de gerechten in een bevochtigde couveuse bij 37 °C.
    OPMERKING: PDL/laminine-gecoate gerechten kunnen 2-3 dagen worden bewaard in een bevochtigde incubator bij 37 °C.

3. Dissectie en dissociatie van de hippocampus

  1. Euthanaseer een zwangere muis door cervicale dislocatie.
    OPMERKING: De huidige studie maakt gebruik van in de handel verkrijgbare muizen (zie Tabel met materialen). Onderzoekers moeten muizen gebruiken die zijn gefokt en humaan worden behandeld in een gesteriliseerde omgeving.
  2. Ontleed embryonale dag-16 (E16) muizenembryo's en plaats ze op ijs.
  3. Ontleed in een laminaire stroomkap de hersenen met een schaar en plaats ze op een steriele schaal van 10 cm met 10 ml ijskoude dissectie-oplossing.
  4. Pel met een dissectie-stereomicroscoop voorzichtig de hersenvliezen van de hersenhelften af en ontleed vervolgens de hippocampi met een tang.
  5. Breng de hippocampi over in 5 ml ijskoude vergistingsoplossing in een buis van 15 ml. Incubeer de hippocampi in een waterbad gedurende 20 minuten bij 37 °C.
  6. Verwijder de digestieoplossing en voeg 3 ml dissectieoplossing toe.
  7. Pipetteer de hippocampi vier keer voorzichtig met een Pasteur pipet.
  8. Incubeer de hippocampi in een waterbad gedurende 20 minuten bij 37 °C.
  9. Breng de celsuspensie over in een centrifugebuis van 50 ml. Voeg 3 ml nieuwe dissectieoplossing toe aan het niet-geositocieerde weefsel.
  10. Herhaal stap 3.7-3.9 totdat de hippocampi volledig zijn gedissocieerd.
  11. Verwijder de zwevende aggregaten van DNA uit de celsuspensie door te wervelen en te aspirateren met een Pasteur pipet. Centrifugeer de celsuspensie bij 180 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C.
    OPMERKING: DNA afgeleid van beschadigde cellen zal het centrifugatieproces verstoren. Als neuronen in het supernatant blijven, centrifugeer de celsuspensie opnieuw na zorgvuldig verwijderen van het DNA.
  12. Equilibrate neurobasaal medium met 10% foetaal runderserum (FBS), penicilline (100 E/ml) en streptomycine (100 μg/ml) in een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% CO2.

4. Transfectie en het kweken van neuronen

  1. Verwijder het supernatant en voeg 5 ml ijskoude PBS toe aan de buis van 50 ml. Resuspend de celkorrel door zachtjes pipetteren.
  2. Breng 10 μL van de celsuspensie over in een microcentrifugebuis, voeg 10 μL 0,5% trypan blauwe oplossing toe en tel vervolgens het aantal cellen met een hemocytometer.
  3. Centrifugeer de celsuspensie in de buis van 50 ml bij 180 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C.
  4. In de tussentijd, aliquot voor transfectie, 1 μg pFN21A-HaloTag-actine en 3 μg pmNeonGreen-N1-Lifeact per 1 x 106 cellen, in een microcentrifugebuis.
  5. Verwijder na het centrifugeren het supernatant en voeg 100 μL elektroporatiemedium (geleverd door transfectieset) toe aan de buis van 50 ml. Resuspend de celkorrel door pipetteren.
  6. Meng de celsuspensie met de gealiquoteerde DNA-oplossing en breng het mengsel over op een cuvette (geleverd door de transfectieset).
    OPMERKING: Aangezien luchtbellen de elektroporatie verstoren, verwijdert u ze uit de celsuspensie.
  7. Plaats de cuvette in het elektroporatieapparaat (Tabel van materialen) en voer elektroporatie uit met behulp van programma O-005.
  8. Voeg onmiddellijk 1 ml van het voorverwarmde en gebalanceerde neurobasismedium met 10% FBS, penicilline (100 E / ml) en streptomycine (100 μg / ml) toe aan de cuvette.
  9. Breng de celsuspensie over in een centrifugebuis van 15 ml met behulp van een plastic pipet (geleverd door de transfectieset).
  10. Breng 10 μL van de celsuspensie over in een microbuis, voeg 10 μL 0,5% trypan blauwe oplossing toe en tel vervolgens het aantal cellen met een hemocytometer.
  11. Haal PDL/laminine-gecoate glazen bodemschalen uit de couveuse en verwijder het neurobasale medium.
  12. Pipetteer 0,5 ml van de celsuspensie met 2,0 x 105 cellen per schaal en incubeer in een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 3 uur.
  13. Vervang het medium door 0,5 ml neurobasaal medium met 2% B-27 supplement, glutamine (1 mM), penicilline (100 U / ml) en streptomycine (100 μg / ml). Kweek de neuronen in een bevochtigde incubator gedurende 3 dagen bij 37 °C met 5% CO2.

5. Beeldvorming met enkele spikkel bij neuronale groeikegels

  1. Behandel op dag in vitro (DIV) 3 de neuronen met tetramethyl-rhodamine (TMR) ligand bij een verdunning van 1:2000 verdunning in kweekmedium. Houd de neuronen gedurende 1 uur op 37 °C met 5% CO2.
  2. Was het TMR-ligand driemaal met voorverwarmd PBS.
  3. Verwijder de PBS en pipetteer 0,5 ml verwarmd Leibovitz's L-15 medium met 2% B-27 supplement, glutamine (1 mM), penicilline (100 U / ml) en streptomycine (100 μg / ml).
  4. Houd neuronen gedurende 1 uur bij 37 °C.
  5. Zet een epifluorescentiemicroscoop aan en stel de stage-top incubator in op 37 °C.
    OPMERKING: Het huidige protocol maakt gebruik van een epifluorescentiemicroscoop uitgerust met een complementaire metaaloxide halfgeleidercamera, een 100x/1.40 NA olie-onderdompelingsobjectieve lens, een kwiklamp en een beeldacquisitiesoftware (zie Materiaaltabel). Andere epifluorescentiemicroscopen met gelijkwaardige specificaties kunnen ook voor deze analyse worden gebruikt.
  6. Plaats de met TMR ligand behandelde neuronen in de schotel met glazen bodem op de verwarmde incubator met podiumtop.
  7. Stel de beeldacquisitieparameters als volgt in: belichtingstijd, 500 ms voor Lifeact- en HaloTag-actine fluorescerende kanalen; binning, 1 x 1 (0,065 μm × 0,065 μm per pixel); tijdsinterval, 3 s; duur, 50 frames.
  8. Selecteer een groeikegel die Lifeact sterk tot expressie brengt en halotag-actine zwak tot expressie brengt.
    OPMERKING: Lifeact-expressie moet sterk genoeg zijn om de morfologie van de groeikegel te visualiseren. HaloTag-actine-expressie moet zwak genoeg zijn om te worden gedetecteerd (figuur 2A). De niveaus van fluorescerende eiwitexpressies kunnen worden aangepast door de hoeveelheid DNA voor transfectie te variëren.
  9. Sluit het veld van het membraan om een minimaal gebied te verlichten dat de groeikegel omvat (figuur 2B).
    OPMERKING: De verlichting van een minimaal gebied vermindert het achtergrondsignaal en verhoogt de verhouding tussen fluorescentiesignaal en ruis (S/N), waardoor actinespikkels kunnen worden gedetecteerd (figuur 2B). Om de S/N-verhouding verder te verhogen, wordt aanbevolen om de groeikegel te verlichten zonder het licht te verminderen door filters met neutrale dichtheid.
  10. Time-lapse-afbeeldingen aanschaffen (aanvullend bestand 2). Opslaan als een multichannel time-lapse stackafbeelding (tiff-indeling).

6. Kwantificeringen van F-actine stroomsnelheid en polymerisatiesnelheid met behulp van een beeldverwerkings- en analysesoftware Fiji

OPMERKING: Raadpleeg aanvullend bestand 3 voor praktijkgegevens voor het kwantificeren van de F-actinestroomsnelheid en de actinepolymerisatiesnelheid.

  1. Open de multichannel time-lapse stack-afbeelding op Fiji.
  2. Selecteer Analyseren > Schaal instellen en stel de pixelgrootte van de afbeeldingen in.
  3. Zoek een actine spikkel die retrograde stroomt gedurende een minimum van vijf tijdframes binnen een F-actine bundel in filopodia of lamellipodia.
  4. Selecteer Afbeelding > Transformeren > Roteren en pas de hoek van de afbeeldingen aan zodat de F-actinebundel naar boven wijst (afbeelding 3A).
  5. Klik op Rechthoek op de werkbalk en teken een vak met actine spikkels en de punt van de F-actine bundel (Figuur 3B, 1 en 2).
    OPMERKING: De signalen van HaloTag-actine spikkels zijn zwak. Bovendien zijn Lifeact-signalen aan de distale uiteinden van de groeikegel zwak en zwak (figuur 2B) omdat de distale uiteinden van de groeikegel dun zijn in vergelijking met het proximale deel. Onderzoekers moeten de signalen verbeteren om de kwantificeringen van de F-actinestroomsnelheid en polymerisatiesnelheid te optimaliseren (figuur 3B). Hoewel het Lifeact-signaal bij de proximale groeikegel verzadigd raakt, zal dit de bepaling van het distale uiteinde van F-actinen niet verstoren (figuur 3E, gele lijn).
  6. Selecteer Afbeelding > Dupliceren en voer de vijf tijdframes in (Figuur 3B, 3-5).
  7. Selecteer Afbeelding > stapels > Montage maken en voer de parameters in: Kolommen, 5; Rijen, 1; Schaalfactor, 1.
  8. Klik op OK. De beeldmontage verschijnt op het scherm.
  9. Selecteer Afbeelding > kleur > gesplitste kanalen. Dit scheidt de twee fluorescerende kanalen.
  10. Kwantificering van de F-actine stroomsnelheid.
    1. Selecteer Analyseren > Metingen instellen en kies Gebied en Omsluitende rechthoek.
    2. Klik op Ovaal op de werkbalk en teken een cirkel op een actine spikkel (Figuur 3C, 1 en 2).
    3. Selecteer Afbeelding > overlay > Selectie toevoegen. De cirkel wordt over de beeldmontage gelegd (figuur 3C, 3 en 4).
      OPMERKING: De kleur van de overlay kan worden gewijzigd in Bewerken > Opties > Kleuren.
    4. Herhaal de overlay van cirkels voor de resterende spikkels (figuur 3C, 5).
      OPMERKING: Om de centra van actine spikkel nauwkeurig te bepalen, moeten onderzoekers cirkels op de spikkels leggen.
    5. Klik op Recht op de werkbalk en teken een lijn die de middelpunten van de cirkels met elkaar verbindt (Figuur 3D, 1 en 2).
    6. Selecteer Analyseren > meting. Het resultaat verschijnt op het scherm (Figuur 3D, 3).
      OPMERKING: De hoogte die in het resultaat wordt weergegeven, geeft de translocatieafstand van de actinespikkel tijdens de waarneming aan (figuur 3D, 3).
    7. Bereken de F-actine stroomsnelheid door de translocatieafstand te delen door de waarnemingstijd.
  11. Kwantificering van de F-actine polymerisatiesnelheid.
    1. Teken een lijn die de uiteinden van de F-actinebundel verbindt (figuur 3E, 1).
    2. Selecteer Analyseren > meting. Het resultaat verschijnt op het scherm (Figuur 3E, 2).
      OPMERKING: Hoogte in het resultaat geeft de verlengingslengte van de F-actinebundel tijdens de waarneming aan (figuur 3E, 2).
    3. Bereken de F-actine-extensiesnelheid door de verlengingslengte te delen door de waarnemingstijd.
    4. Bereken de F-actinepolymerisatiesnelheid als de som van de F-actinestroomsnelheid en de extensiesnelheid (figuur 3F).

7. Bereiding van een PAA-gel voor tractiekrachtmicroscopie en neuronculturen

  1. Bereiding van PAA-gels die nodig zijn voor tractiekrachtmicroscopie (figuur 4)
    1. Pipetteer 0,5 ml NaOH (100 mM), opgelost in gedestilleerd H2O, op schalen met glazen bodem met een diameter van 27 mm en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT).
    2. Voeg 50 μL 3-aminopropyltrimethyoxysilaan (APTMS) toe aan de NaOH-oplossing op de gerechten en meng de oplossingen door zachtjes pipetteren en incubeer gedurende 15 minuten bij RT.
    3. Was de glazen bodemschalen met gedestilleerd H2O en droog.
    4. Pipetteer 0,5 ml 0,5% glutaaraldehyde-oplossing, opgelost in PBS, op de met APTMS behandelde schotel met glazen bodem en incubeer gedurende 30 minuten bij RT.
    5. Was de glazen bodemschalen met gedestilleerd H2O en droog.
    6. Bereid een oplossing met gedestilleerde H2O (412 μL), 30% (w/v) acrylamideoplossing (63 μL), 2,5% (m/v) bis-acrylamideoplossing (6 μL) en carboxylaatgemodificeerde microsfeer (fluorescerende kraal) oplossing (20 μL).
      OPMERKING: Vortex de fluorescerende kraaloplossing om geaggregeerde kralen te dissociëren voordat u ze aan de acrylamideoplossing toevoegt.
    7. Ontgas de oplossing in een vacuümkamer gedurende 30 minuten bij RT.
    8. Voeg aan deze oplossing 1 μL van 10% (w/v) ammoniumperssulfaat (APS), opgelost in gedestilleerd H2O, en 1 μL N,N,N',N'-tetramethyleendiamine (TEMED) toe en meng door zacht pipetteren.
    9. Plaats een glazen afdekplaat (diameter 18 mm) op de dop van een centrifugebuis van 15 ml.
    10. Voeg onmiddellijk 25 μL van de oplossing toe aan de coverslip en plaats vervolgens voorzichtig een omgekeerde schotel met glazen bodem op de coverslip. Laat het acrylamide 1 uur polymeriseren bij RT.
    11. Breng gedestilleerde H2O aan op de coverslip en pel deze weg van de gel met behulp van een spuitnaald met een gebogen punt.
    12. Verwijder de H2O en voeg sulfo-SANPAH (1 mM), opgelost in PBS, toe aan de gel.
    13. Stel de gels onder steriele omstandigheden gedurende 5 minuten bloot aan ultraviolet licht. Was de gel drie keer met PBS gedurende 15 minuten per wasbeurt.
  2. Bepaling van de stijfheid van de gel met behulp van een microsfeerinspringingsmethode (figuur 5A)44.
    1. Breng een microsfeer die is gespecificeerd voor de diameter en dichtheid over naar de gel en plaats deze vervolgens op het monsterstadium van een confocale laserscanmicroscoop.
    2. Focus op het geloppervlak en noteer de z-positie (figuur 5B).
    3. Richt je op dezelfde manier op de bodem van de microsfeer en noteer de z-positie (figuur 5C).
    4. Bereken de inkepingsdiepte zoals bepaald door het verschil tussen de z-posities van het geloppervlak en de bodem van de microsfeer.
    5. Bereken Young's modulus E van de gel door:
      figure-protocol-1
      waarbij f het voor drijfvermogen gecorrigeerde gewicht van de microsfeer is, d de inkepingsdiepte van de gel, r de straal van de microsfeer en v de Poisson-verhouding (waarvan de waarde 0,3 is, zoals eerder bepaald46).
  3. Bestrijk de gels met PDL en laminine zoals beschreven in rubriek 2.
  4. Zoals beschreven in secties 3 en 4, ontleed e16-muizenembryo's, dissociëer hippocampi en transfecteer met 5 μg pEGFP-C1 per 1,0 x 106 cellen. Zaad 2,0 x 105 cellen op PDL/laminine-gecoate gels.
    OPMERKING: Voor tractiekrachtanalyse is microscopische beeldvorming van fluorescerend gelabelde cellen nodig voor het bepalen van het gebied van de groeikegel.

8. Tractiekrachtmicroscopie bij neuronale groeikegels

  1. Vervang op DIV3 het kweekmedium door 0,5 ml verwarmd L-15-medium van Leibovitz met 2% B-27-supplement, glutamine (1 mM), penicilline (100 E / ml) en streptomycine (100 μg / ml). Houd de neuronen gedurende 1 uur op 37 °C.
  2. Zet een confocale laserscanmicroscoop aan en stel de incubator op 37 °C in.
    OPMERKING: De huidige studie maakt gebruik van een laser scanning confocale microscoop uitgerust met een 63x/1.2 NA water onderdompeling objectief lens en een beeld acquisitie en analyse software (zie Tabel van materialen).
  3. Plaats de neuronen in de glazen schaal op de voorverwarmde incubator met podiumtop.
  4. Stel de parameters voor beeldacquisitie als volgt in: scangrootte, 512 × 512 pixels; scangebied, 1,5-3x zoom; scansnelheid, ~ 1 s per frame; lasergolflengte, 561 nm (de excitatiegolflengte voor de fluorescerende kralen) en 488 nm (de excitatiegolflengte voor verbeterd groen fluorescerend eiwit (EGFP)); tijdsinterval, 3 s; duur, 50 frames.
  5. Om de morfologie van de groeikegel te visualiseren, selecteert u een groeikegel die EGFP sterk tot expressie brengt.
  6. Focus op het geloppervlak en verkrijg time-lapse-beelden (figuur 6A en aanvullend bestand 4).
    OPMERKING: Gebruik voor tractieanalyse twee fluorescerende kanalen (voor fluorescerende kralen en EGFP) en een helder veldkanaal (het vastleggen van differentieel interferentiecontrast (DIC) of fasecontrastbeelden wordt aanbevolen).
  7. Gebruik een beeldverwerkingssoftware (bijvoorbeeld Fiji) om single-channel time-lapse RGB-afbeeldingsstapels te produceren en deze afbeeldingen op te slaan als tiff-bestanden.
    OPMERKING: Het is van cruciaal belang dat onderzoekers ook de onbewerkte gegevens opslaan.
  8. Breng 100 μL van 10% (w / v) natriumdodecylsulfaat (SDS), opgelost in gedestilleerd H2O, aan op de schaal met glazen bodem om het gelsubstraat te ontspannen door neuronen uit het substraat vrij te maken. Incubeer de schotel gedurende 5 minuten bij 37°C om de temperatuur te stabiliseren.
    OPMERKING: De afbeelding van de kralen in een ongetraind substraat wordt gebruikt om te verwijzen naar de oorspronkelijke kraalposities tijdens de tractiekrachtanalyse (figuur 6C). Toepassing van SDS-oplossing verandert de xyz-posities als gevolg van thermische verandering in de incubator en ontspanning van de cel-geïnduceerde vervorming. Onderzoekers moeten daarom het brandpuntsvlak en de x-y-positie corrigeren.
  9. Focus op het geloppervlak en krijg een beeld van de kralen in het ongetrainde substraat (figuur 6B).
  10. Maak een eenkanaals RGB-afbeelding van de kralen in het ongetrainde substraat en sla deze afbeelding op als tiff-bestand.
  11. Correctie van de x-y positie van het kraalbeeld in het ongetrainde substraat met Fiji
    1. Open in Fiji de kraalafbeelding in het ongetrainde substraat en het time-lapse stack-beeld van fluorescerende kralen.
    2. Selecteer > gereedschappen voor > stapels > samenvoegen. Er verschijnt een dialoogvenster op het scherm (figuur 7A, 1).
    3. Selecteer de kraalafbeelding in het ongetrainde substraat en de time-lapse stackafbeelding van fluorescerende kralen in respectievelijk Afbeelding1 en Afbeelding2 (Afbeelding 7A, 2).
    4. Klik op OK. De kraalafbeelding in het ongetrainde substraat wordt toegevoegd aan de time-lapse stackafbeelding (figuur 7A, 3).
    5. Gebruik de schuifbalk (afbeelding 7B, 1, rood kader) om het tweede frame van de stapelafbeelding weer te geven (rode pijl).
    6. Selecteer Plugins > StackReg (Figuur 7B, 2). Er verschijnt een dialoogvenster op het scherm (figuur 7B, 3).
    7. Selecteer Rigid Body in de vervolgkeuzelijst (Figuur 7B, 3, rood kader) en klik op OK. De correctie van de x-y positie begint dan.
    8. Gebruik de schuifbalk om het eerste frame van de x-y-positie gecorrigeerde stapelafbeelding weer te geven.
    9. Selecteer Afbeelding > duplicaat (afbeelding 7C, 1). Er verschijnt een dialoogvenster op het scherm (figuur 7B, 2).
    10. Voer 1 in het bereik in, schakel Dubbele stapel (figuur 7C, 2) uit en klik op OK. Het x-y positiegecorrigeerde kraalbeeld in het ongetrainde substraat verschijnt op het scherm (Figuur 7C, 3). Sla deze afbeelding op als tiff-bestand.
  12. Kwantificering van de trekkracht
    OPMERKING: De hier beschreven methode voor tractiekrachtanalyse maakt gebruik van MATLAB en twee MATLAB-toolboxen, 'Image Processing Toolbox' en 'Parallel Computing Toolbox'. Onderzoekers moeten ze voorafgaand aan de analyse installeren. De tractiekrachtanalysecode is ontwikkeld op basis van MATLAB-versie 2018a. Daarom moet MATLAB versie 2018a (of hoger) worden gebruikt voor de analyse. De algoritmen die worden gebruikt voor tractiekrachtanalyse zijn eerder beschreven22.
    1. Download de tractiekrachtanalysecode TFM2021 uit Supplemental File 5. Open TFM 2021 in MATLAB
    2. Open hoofd.m in TFM2021 en voer het uit. Er verschijnt een grafische gebruikersinterface (GUI) op het scherm (figuur 8A).
    3. Klik op Load unstrained substrate image en selecteer de x-y position-gecorrigeerde kraalafbeelding in unstrained substrate.
    4. Klik op Fluorescerende kralenafbeeldingen laden en selecteer de time-lapse stapelafbeelding van kralen.
    5. Klik op Bright Field-afbeeldingen laden en selecteer de time-lapse-stackafbeelding van bright-field.
    6. Klik op GFP-afbeeldingen laden en selecteer de time-lapse stackafbeelding van EGFP.
    7. Selecteer GFP in de vervolgkeuzelijst op de GUI (figuur 8A, rood vak).
    8. Klik op ROI om het rechthoekige interessegebied (ROI) op te geven, inclusief de groeikegel, door op twee punten te klikken op de celafbeelding die op de GUI wordt weergegeven (figuur 8B).
    9. Klik op de knop Opslaan op de GUI (Figuur 8A, rode pijl). De geselecteerde stapelafbeeldingen worden samen met de ROI opgeslagen in een .mat-bestand (MATLAB-bestand).
    10. Klik op Spot detect. Er verschijnt een dialoogvenster op het scherm.
    11. Voer een waarde (meestal 50-150) in het dialoogvenster in om een drempelwaarde voor kraaldetectie te bepalen. Als u op OK klikt , wordt de berekening gestart.
    12. Nadat u de berekening hebt voltooid, klikt u op Track plotten om het bij stap 8.12.8 geselecteerde gebied te vergroten en de gedetecteerde kralen als witte stippen weer te geven (figuur 8C, 1).
      OPMERKING: Controleer of kraaldetectie (witte stippen) overlapt met de fluorescerende kralen. Kraaldetectie kan ook achtergrondgeluid detecteren. Om deze externe interferentie te verminderen, wijzigt u de drempelwaarde bij Spot detect. Selecteer bovendien handmatig de juiste punten bij stap 8.12.13.
    13. Klik op Kralen selecteren en baken een veelhoekig gebied af met de juiste stippen onder de groeikegel. Druk op Enter op het toetsenbord. De witte stippen binnen het veelhoekige gebied veranderen in een rode kleur (Figuur 8C, 2).
    14. Klik op Schattingskracht op de GUI. Voer vervolgens waarden in voor de volgende parameters: pixelgrootte, μm / pixel; Young's modulus, de waarde berekend bij stap 7.2.5; Poisson's ratio, 0,3.
    15. Schattingskracht uitvoeren om de berekening te starten. De software slaat de berekeningsresultaten automatisch op in een spreadsheetformaatbestand.
      OPMERKING: De spreadsheet toont de x-component, y-component en krachtgrootte in elk tijdsbestek (figuur 8D). Raadpleeg aanvullend bestand 6 voor praktijkgegevens voor het kwantificeren van de tractiekracht.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beeldvorming met enkele spikkel om de actinepolymerisatiesnelheid en koppelingskoppelingsefficiëntie te kwantificeren
Een hoge Lifeact-expressie maakt F-actinevisualisatie binnen de groeikegel mogelijk; een lage HaloTag-actine-expressie maakt de monitoring van de F-actine retrograde stroom mogelijk (Figuur 3, Aanvullend bestand 2). Tracering van de actine spikkels maakt het mogelijk om de F-actine stroomsnelheid te meten (Figuur 3C,D). Omdat de mechanische koppeling van F-actine retrograde flow en het lijmsubstraat de F-actine stroomsnelheid vermindert, kan de koppelingskoppelingsefficiëntie worden geschat aan de hand van de snelheid. Bovendien helpt F-actine-etikettering met Lifeact de visualisatie van F-actine-extensie en is het nuttig voor het kwantificeren van de actinepolymerisatiesnelheid (figuur 3E, F).

Kwantitatieve analyse van de trekkracht
Strikte naleving van de hier gepresenteerde methodologie zal de bewegingen van fluorescerende kralen onder de groeikegel onthullen (figuur 6C, aanvullend bestand 4). F-actine retrograde stroming op het substraat genereert trekkracht waardoor de fluorescerende kralen naar achteren bewegen onder de groeikegel. De tractiekrachtanalysecode schat de tractiekracht van fluorescerende kraalverplaatsing en drukt de berekende tractiekracht uit als een krachtvector. De richting en grootte van de trekkracht worden bepaald aan de hand van de x- en y-componenten van de krachtvector (figuur 8C,D). Het rode vak in figuur 8D vertegenwoordigt de x- en y-componenten van een krachtvector; Figuur 8C toont de bijbehorende groeikegel. In termen van x-y-coördinaten wijst de vector naar -93,8° tegen de x-as; deze oriëntatie is gericht op de achterkant van de groeikegel (figuur 8C). De grootte van de trekkracht F werd als volgt berekend:

figure-results-1

figure-results-2
Figuur 1: Een groeikegelmachinerie voor krachtgeneratie en groeikegelnavigatie. Een netrine-1 chemoattractant gradiënt induceert asymmetrische stimulatie van zijn receptor DCC op een axonale groeikegel. Dit activeert Rac1 en Cdc42, en hun stroomafwaartse kinase Pak1. Rac1 en Cdc42 bevorderen (1) actinepolymerisatie, terwijl Pak1 shootin1 fosforyleert, waardoor shootin1-gemedieerde (2) koppelingskoppeling wordt verbeterd. De asymmetrische activering van actinedynamica en de koppeling in de groeikegel verhoogt (3) de trekkracht aan de zijkant van de netrin-1-bron, waardoor een directionele drijvende kracht wordt gegenereerd voor het aantrekken van groeikegel. De hier gepresenteerde protocollen maken het mogelijk om de belangrijkste variabelen (1)-(3) voor groeikegelnavigatie te kwantificeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 2: Fluorescentiebeelden van een neuronale groeikegel onder een volledig geopend en vernauwd diafragma. De groeikegel drukt Lifeact en HaloTag-actine uit. (A) Een hoge Lifeact-expressie maakt visualisatie van de morfologie van de groeikegel mogelijk. Aan de andere kant zijn halotag-actine-expressieniveaus erg laag, met zwakke signalen wanneer het diafragma volledig is geopend. (B) Wanneer het diafragma op de juiste manier is vernauwd, nemen de achtergrondsignalen af en verschijnen er enkele actine-spikkels in de groeikegel. Schaalbalken: 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 3: Stappen voor het kwantificeren van de F-actine stroomsnelheid en actinepolymerisatiesnelheid met behulp van een beeldverwerkings- en analysesoftware Fiji. (A) Pas de hoek van het beeld aan voor analyse. (1) Zoek en selecteer een actine spikkel (pijlpunt) die stroomt in een F-actine bundel. (2) Selecteer Afbeelding > Transformeren > roteren. (3) Stel de hoek zo in dat de F-actinebundel naar boven wordt gericht. (4) De hoek van de afbeelding wordt gewijzigd. (B) Baken het gebied af, met inbegrip van de actinespikkel en de F-actinebundel. (1) Klik op Rechthoek op de werkbalk. (2) Baken een gebied op de afbeelding af. De helderheid en het contrast van het beeld worden verhoogd om een duidelijke visualisatie van de actine spikkel en de punt van de F-actine bundel mogelijk te maken. (3) Selecteer Afbeelding > dupliceren. (4) Voer de vijf tijdframes in die de actine-spikkelstroom in de F-actinebundel laten zien. (5) De geselecteerde stapelafbeelding verschijnt op het scherm. (C) Overlay cirkels op de actine spikkel. (1) Klik op Ovaal op de werkbalk. (2) Teken een cirkel op een actine spikkel. (3) Selecteer Afbeelding > overlay > Selectie toevoegen. (4) De cirkel is bedekt. 5) Herhaal het bedekken van de cirkels op de resterende actine spikkels. (D) Meet de translocatieafstand van actine spikkels gedurende de vijf tijdframes. (1) Klik op Direct op de werkbalk. (2) Teken een lijn die de middelpunten van de cirkels met elkaar verbindt. (3) Selecteer Analyseren > meting. Het resultaat, aangegeven door de parameter Hoogte (rood vak), die de translocatieafstand van de actinespikkel doorgeeft. (E) Meet de verandering in de lengte van het uitsteeksel van F-actine gedurende de vijf tijdframes. (1) Trek een lijn die de uiteinden van het F-actine-uitsteeksel met elkaar verbindt. (2) Selecteer Analyseren > meting. Het resultaat (rood vak), Hoogte, geeft de verlengingslengte van de F-actinebundel aan. (F) De actinepolymerisatiesnelheid wordt berekend op basis van de som van de F-actinestroomsnelheid en de extensiesnelheid. Zie ook Aanvullend dossier 2. Aanvullend dossier 3 helpt onderzoekers om de hierboven beschreven methodologie te oefenen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 4: Stappen voor het PAA-gelpreparaat. Zie stap 7.1 voor een gedetailleerde beschrijving. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 5: Bepaling van de stijfheid van paa-gel. (A) Een microsfeerinspringingsmethode. Wanneer een microsfeer op een fluorescerende paa-gel met kralen wordt geplaatst, veroorzaakt het gewicht van de microsfeer een inkeping in de gel. De inkepingsdiepte wordt berekend door de z-posities van het PAA-geloppervlak af te trekken van de onderkant van de microsfeer (B,C) Fluorescentiebeelden van een PAA-gel ingesprongen door een microsfeer en die fluorescerende kralen bevat. Een confocale laserscanmicroscoop werd gebruikt om beelden vast te leggen van het geloppervlak (B) en de bodem van de microsfeer (C). Signalen van de fluorescerende kralen zijn niet zichtbaar op het geloppervlak in het ingesprongen gebied (B, cirkel). Ze kunnen echter worden waargenomen aan de onderkant van de microsfeer. Schaalbalken: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 6: Force mapping van een neuronale groeikegel. (A-C) Fluorescentiebeelden van kralen ingebed in een PAA-gel en een neurale groeikegel gevisualiseerd met EGFP. Na het verkrijgen van time-lapse-beelden (A) werd het neuron vrijgegeven uit het gelsubstraat door SDS-oplossing toe te passen en werd een beeld van de kralen in het ongetrainde substraat vastgelegd (B). (C) De afbeelding van de kralen in het ongetrainde substraat toont de kralen in hun oorspronkelijke (groene) en verplaatste (rode) posities. Het EGFP-signaal van de groeikegel wordt blauw weergegeven. Kymografen (rechts) tonen de bewegingen van kralen met intervallen van 3 s voor een duur van 147 s, aangegeven door de pijlen in de ingepakte gebieden 1 en 2. De kraal in gebied 2 is een referentiekraal. Schaalbalken: 2 μm voor (A), (B) en (C, links) en 1 μm voor (C, midden). Zie ook Aanvullend dossier 4. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-8
Figuur 7: Stappen voor het corrigeren van de x-y-positie van de kraalafbeelding in ongetraind substraat met Fiji. (A) Voeg het kraalbeeld in ongetraind substraat samen met het time-lapse stapelbeeld van fluorescerende kralen. (1) Selecteer Afbeelding > stapels > tools > samenvoegen. (2) Selecteer de kralenafbeelding in ongetraind substraat en de time-lapse stackafbeelding van fluorescerende kralen in respectievelijk Afbeelding1 en Afbeelding2. Klik op OK. (3) De kraalafbeelding in het ongetrainde substraat wordt toegevoegd aan de time-lapse stackafbeelding. (B) Corrigeer de x-y-positie van het fluorescerende kralenbeeld. (1) Gebruik de schuifbalk (rood kader) om het tweede frame (rode pijl) in de afbeeldingsstapel te selecteren. (2) Selecteer Plugins > StackReg. (3) Selecteer Rigid Body in de vervolgkeuzelijst (rood frame) en klik op OK. De correctie van de x-y positie zal beginnen. (C) Sla de x-y positie-gecorrigeerde kraalafbeelding op. Nadat u het eerste frame van de x-y-positiegecorrigeerde stapelafbeelding hebt geselecteerd(1), selecteert u Afbeelding > Dupliceren. (2) voer 1 in het bereik in en schakel Dubbele stapel uit. Klik vervolgens op OK. (3) het x-y positiegecorrigeerde kraalbeeld in het ongetrainde substraat verschijnt op het scherm. Sla deze afbeelding op als tiff-bestand. Aanvullend dossier 6 helpt onderzoekers om de hierboven beschreven methodologie te oefenen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-9
Figuur 8: Analyse van tractiekracht onder een neuronale groeikegel met behulp van een open-source tractiekrachtanalysecode. (A) GUI voor het analyseren van tractiekracht. Time-lapse-afbeeldingen die in de GUI zijn geselecteerd, kunnen worden bevestigd in de vervolgkeuzelijst en met de aangegeven schuifregelaar (rood vak). (B) Selecteer een regio die de groeikegel bevat. (1) Klik op ROI op de GUI. Geef met de muiscursor twee punten (pijlpunten) op de celafbeelding op. (2) Er verschijnt een rood vak op de celafbeelding. Twee klikken bepalen de locaties van twee hoeken. (C) Selecteer de gedetecteerde kralen (witte stippen) onder de groeikegel. (1) Klik in de GUI op Kralen selecteren en destreep een veelhoekig gebied af dat de groeikegel bevat door te klikken. Druk op enter . (2) De witte stippen binnen het veelhoekige gebied veranderen in een rode kleur. D) Berekende resultaten van de richting en de omvang van de trekkracht. Het rode vak in de spreadsheet vertegenwoordigt de x- en y-componenten van de krachtvector, geschat door tractiekrachtanalyse. Op de x-y-coördinaat in het rechterpaneel wijst de krachtvector die door de groeikegel wordt gegenereerd tot -93,8° tegen de x-as; deze oriëntatie is gericht op de achterkant van de groeikegel in (C). Aanvullend dossier 6 helpt onderzoekers om de hierboven beschreven methodologie te oefenen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend bestand 1: Recepten van oplossingen en media die in deze studie worden gebruikt. Zie tekst voor gedetailleerd gebruik. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: Fluorescentiebeeldvorming van Lifeact en fluorescerende spikkelbeeldvorming van HaloTag-actine in een zenuwgroeikegel. Lifeact (groen) en HaloTag-actine (magenta). Beelden werden elke 3 s verkregen voor een totale duur van 147 s. Schaalbalk: 2 μm. Zie ook Figuur 3. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 3: Praktijkgegevens voor het kwantificeren van de F-actinestroomsnelheid en de actinepolymerisatiesnelheid. Een multichannel time-lapse stack afbeelding van Lifeact (groen) en HaloTag-actine (magenta). Zie ook figuur 3. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 4: Een force-mapping video die tractiekracht detecteert bij een neuronale groeikegel. De oorspronkelijke (groene) en verplaatste (rode) posities van de kralen. Het EGFP-signaal in de groeikegel wordt blauw weergegeven. Beelden werden verkregen om de 3 s voor 147 s. Schaalbalk: 2 μm. Zie ook figuur 6. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 5: Tractiekrachtanalysecode. Zie stap 8.12 voor gedetailleerd gebruik. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 6: Oefengegevens voor het kwantificeren van de trekkracht. Een enkelkanaals RGB-afbeelding van de kralen in ongetraind substraat en eenkanaals time-lapse stapel RGB-beelden van fluorescerende kralen onder een groeikegel, EGFP en helder veld. Zie ook figuren 7 en 8. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De protocollen die in deze studie worden beschreven, maken gebruik van commercieel beschikbare materialen en microscopie-apparatuur die routinematig wordt aangetroffen in alle laboratoria, instituten en universiteiten. Daarom kunnen onderzoekers gemakkelijk de huidige enkele spikkelbeeldvorming en tractiekrachtmicroscopie in hun studies gebruiken.

De spikkelbeeldvorming kan actinepolymerisatie en koppelingskoppeling analyseren. Bovendien kan spikkelbeeldvorming de retrograde stroom van koppelingsmoleculen zoals shootin1 en cortactine volgen, die interageren met de retrograde stroom van F-actine. Met behulp van een TIRF-microscoop kan ook de retrograde stroom van het celadhesiemolecuul L1-CAM worden gevolgd23,41; De L1-CAM ondergaat grip- en slipgedrag dat de efficiëntie van de koppeling weerspiegelt23,41. Hoewel de huidige studie het TMR-HaloTag-systeem gebruikt voor spikkelbeeldvorming, zijn andere fluorescerende eiwitten, zoals EGFP en monomer rood fluorescerend eiwit, ook beschikbaar in de analyse16,18,20,23,24,27,39. De essentie voor het visualiseren van actine spikkels zijn een laag expressieniveau van fluorescerende actine en de verlichting van een minimaal gebied (figuur 2). In dit protocol worden Lifeact- en HaloTag-actinesignalen sequentieel verkregen. Omdat de actine retrograde stroom relatief langzaam is (4,5 ± 0,1 μm/min)24, wordt de analyse van de F-actine retrograde stroom en actinepolymerisatie niet beïnvloed door sequentiële beeldacquisitie van verschillende fluorescerende kanalen (interval ~1 s). Lifeact is een veelgebruikte F-actine marker, maar kan concurreren met actine bindende eiwitten47. Van verder belang is dat Lifeact de actinedynamiek kan veranderen, waardoor F-actinestructuren en de celmorfologie worden beïnvloed47,48,49.

Tractiekrachtmicroscopie kan krachten detecteren om de voortgang van de groeikegel te stimuleren. Door de neuronen in een extracellulaire matrix te monteren, kunnen onderzoekers ook krachten analyseren die zijn gegenereerd in een semi-3D-omgeving11. Beeldvorming met een hoge vergroting is belangrijk voor een nauwkeurige kwantificering van de tractiekracht omdat groeikegels zwakke tractiekrachten genereren7. Hoewel andere methoden met nanopillars of stressgevoelige biosensoren ook worden gebruikt om de tractiekracht50,51 te meten, is de op PAA-gel gebaseerde methode zeer aanpasbaar en maakt het mogelijk de substraatstijfheid aan te passen door de concentraties acrylamide en bisacryryxamide41 te variëren41,44,52. In dit protocol wordt de PAA-gel bereid in een eindconcentratie van 3,75% acrylamide en 0,03% bis-acrylamide; De modulus van Young is ~270 Pa22 en deze stijfheid ligt binnen het bereik van hersenweefsel (100-10.000 Pa)53,54,55. Vanwege de dikte van de PAA-gel (~100 μm) beperkt deze methode het gebruik van lenzen met een hoge vergroting tijdens microscopie. Om beelden met een hoge vergroting te verkrijgen, moeten onderzoekers de zoomfunctie gebruiken in een confocale microscoop voor laserscanning.

Kortom, de huidige spikkelbeeldvorming en tractiekrachtmicroscopie maken kwantitatieve analyses mogelijk van de belangrijkste gebeurtenissen in krachtgeneraties. Deze informatie zal van onschatbare waarde zijn voor het verbeteren van het begrip van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de vooruitgang en navigatie van groeikegels.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door AMED onder subsidienummer 21gm0810011h0005 (N.I. en Y.S.), JSPS KAKENHI (JP19H03223, N.I.) en JSPS Grants-in-Aid for Early-Career Scientists (JP19K16258, T.M.), de Osaka Medical Research Foundation for Incurable Diseases (T.M.), en NAIST Next Generation Interdisciplinary Research Project (Y.S.).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.5% trypan blue stain solutionNacalai29853-34
3-aminopropyltrimethyoxysilaneSigma281778-100ML
Acrylamide monomerNacalai00809-85
Ammonium persulphateCytiva17-1311-1
Axio Observer Z1Zeiss431007-9902-000Epi-fluorescence microscope (single speckle imaging)
B-27 supplement (50x)Thermo Fisher Scientific17504-044
Bovine serum albmineSigmaA7906-10G
C-Apochromat 63x/1.2 W CorrZeiss421787-9970-799Objective lens (traction force microscopy)
Coverslip (diameter 18 mm)MatsunamiC018001
D-glucoseNacalai16806-25
DNaseISigmaDN25-100MG
Fetal bovine serumThermo Fisher Scientific10270-106
FijiOpen source software packagehttps://imagej.net/software/fiji/
FluoSpheres carboxylate-modified 0.2 mm, red (580/605), 2% solidThermo Fisher ScientificF8810carboxylate-modified microspheres
Glass bottom dish (14 mm diameter)MatsunamiD1130H
Glass bottom dish (27 mm diameter)MatsunamiD1140H
Glutaraldehyde solutionSigmaG5882-10X10ML
HaloTag TMR ligandPromegaG8251
HBO103 W/2Osram4050300382128Mercury lamp (single speckle imaging)
Image Processing ToolboxMathWorkhttps://www.mathworks.com/products/image.html
Laminin solution from mouse EHS tumorWako120-05751
Leibovitz’s L-15 mediumThermo Fisher Scientific11415064
L-glutamineNacalai16919-42
LSM710ZeissN/AConforcal laser microscope (traction force microscopy)
MATLAB2018aMathWorkhttps://www.mathworks.com/products/new_products/release2018a.html
Mouse C57BL/6Japan SLCN/A
Mouse neuron nucleofector kitLonzaVPG-1001
N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED)Nacalai33401-72
N,N’-methylenebisacrylamideNacalai22402-02
Neurobasal mediumThermo Fisher Scientific21103-049
Nucleofector IAmaxaAAD-1001Electroporation apparatus
ORCA Flash 4.0 V2HamamatsuC11440-22CUCMOS camera (single speckle imaging)
PapainNacalai26036-34
Parallel Computing ToolboxMathWorkhttps://www.mathworks.com/products/parallel-computing.html
pEGFP-C1Clontech1528177
Penicillin-streptomycin (100x)Nacalai Tesque26253-84
pFN21A-HaloTag-actin(Minegishi et al., 2018)N/A
Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 (10x)Thermo Fisher Scientific70011-044
Plan-Apochromat 100x/1.4 OilZeiss420790-9901-000Objective lens (single speckle imaging)
pmNeonGreen-N1-Lifeact(Kastian et al., 2021)N/A
Poly-D-lysine hydrobromideSigmaP6407-5MG
Slulfo-SAMPHAThermo Fisher Scientific22589
Sodium dodecyl sulfateNacalai08933-05
Sodium hydrate (NaOH)Nacalai31511-05
Steel ballSako tekkouN/AMicroshpere to determin PAA gel rigidity. 0.6 mm diameter, 7.87 g/cm3.
ZEN2009Zeisshttps://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introductionImage acquisition software (traction force microscopy)
ZEN2012Zeisshttps://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introductionImage acquisition software (single speckle imaging)

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. TessierLavigne, M., Goodman, C. S. The molecular biology of axon guidance. Science. 274, 1123-1133 (1996).
  2. Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 001834(2010).
  3. Vitriol, E. A., Zheng, J. Q. Growth cone travel in space and time: the cellular ensemble of cytoskeleton, adhesion, and membrane. Neuron. 73 (6), 1068-1081 (2012).
  4. Cooper, J. A. Cell biology in neuroscience: mechanisms of cell migration in the nervous system. Journal of Cell Biology. 202, 725-734 (2013).
  5. Dupraz, S., et al. RhoA controls axon extension independent of specification in the developing brain. Current Biology. 29, 3874-3886 (2019).
  6. Suter, D. M., Miller, K. E. The emerging role of forces in axonal elongation. Progress in Neurobiology. 94, 91-101 (2011).
  7. Franze, K. Integrating chemistry and mechanics: the forces driving axon growth. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 61-83 (2020).
  8. Mitchison, T., Kirschner, M. Cytoskeletal dynamics and nerve growth. Neuron. 1, 761-772 (1988).
  9. Suter, D. M., Forscher, P. Substrate-cytoskeletal coupling as a mechanism for the regulation of growth cone motility and guidance. Journal of Neurobiology. 44, 97-113 (2000).
  10. Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 332-343 (2009).
  11. Minegishi, T., et al. Shootin1b mediates a mechanical clutch to produce force for neuronal migration. Cell Reports. 25, 624-639 (2018).
  12. Minegishi, T., Inagaki, N. Forces to drive neuronal migration steps. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 863(2020).
  13. Forscher, P., Smith, S. J. Actions of cytochalasins on the organization of actin filaments and microtubules in a neuronal growth cone. Journal of Cell Biology. 107, 1505-1516 (1988).
  14. Suter, D. M., Forscher, P. An emerging link between cytoskeletal dynamics and cell adhesion molecules in growth cone guidance. Current Opinion in Neurobiology. 8, 106-116 (1998).
  15. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112, 453-465 (2003).
  16. Waterman-Storer, C. M., Desai, A., Bulinski, J. C., Salmon, E. D. Fluorescent speckle microscopy, a method to visualize the dynamics of protein assemblies in living cells. Current Biology. 8, 1227-1230 (1998).
  17. Katoh, K., Hammar, K., Smith, P. J., Oldenbourg, R. Birefringence imaging directly reveals architectural dynamics of filamentous actin in living growth cones. Molecular Biology of the Cell. 10, 197-210 (1999).
  18. Watanabe, N., Mitchison, T. J. Single-molecule speckle analysis of actin filament turnover in lamellipodia. Science. 295, 1083-1086 (2002).
  19. Medeiros, N. A., Burnette, D. T., Forscher, P. Myosin II functions in actin-bundle turnover in neuronal growth cones. Nature Cell Biology. 8, 215-226 (2006).
  20. Shimada, T., et al. Shootin1 interacts with actin retrograde flow and L1-CAM to promote axon outgrowth. Journal of Cell Biology. 181, 817-829 (2008).
  21. He, M., Zhang, Z. H., Guan, C. B., Xia, D., Yuan, X. B. Leading tip drives soma translocation via forward F-actin flow during neuronal migration. Jounal of Neuroscience. 30, 10885-10898 (2010).
  22. Toriyama, M., Kozawa, S., Sakumura, Y., Inagaki, N. Conversion of a signal into forces for axon outgrowth through Pak1-mediated shootin1 phosphorylation. Current Biology. 23, 529-534 (2013).
  23. Abe, K., et al. Grip and slip of L1-CAM on adhesive substrates direct growth cone haptotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 2764-2769 (2018).
  24. Baba, K., et al. Gradient-reading and mechano-effector machinery for netrin-1-induced axon guidance. Elife. 7, 34593(2018).
  25. Nichol, R. I., Hagen, K. M., Lumbard, D. C., Dent, E. W., Gomez, T. M. Guidance of axons by local coupling of retrograde flow to point contact adhesions. Journal of Neuroscience. 36, 2267-2282 (2016).
  26. Shekarabi, M., et al. Deleted in colorectal cancer binding netrin-1 mediates cell substrate adhesion and recruits Cdc42, Rac1, Pak1, and N-WASP into an intracellular signaling complex that promotes growth cone expansion. Journal of Neuroscience. 25, 3132-3141 (2005).
  27. Kubo, Y., et al. Shootin1-cortactin interaction mediates signal-force transduction for axon outgrowth. Journal of Cell Biology. 210, 663-676 (2015).
  28. Huber, A. B., Kolodkin, A. L., Ginty, D. D., Cloutier, J. F. Signaling at the growth cone: ligand-receptor complexes and the control of axon growth and guidance. Annual Review of Neuroscience. 26, 509-563 (2003).
  29. Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3, 001727(2011).
  30. Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. Trekking across the brain: the journey of neuronal migration. Cell. 128, 29-43 (2007).
  31. Tatavarty, V., Kim, E. J., Rodionov, V., Yu, J. Investigating sub-spine actin dynamics in rat hippocampal neurons with super-resolution optical imaging. PLoS One. 4, 7724(2009).
  32. Frost, N. A., Shroff, H., Kong, H., Betzig, E., Blanpied, T. A. Single-molecule discrimination of discrete perisynaptic and distributed sites of actin filament assembly within dendritic spines. Neuron. 67, 86-99 (2010).
  33. Chazeau, A., et al. Nanoscale segregation of actin nucleation and elongation factors determines dendritic spine protrusion. EMBO Journal. 33, 2745-2764 (2014).
  34. Garcia, M., et al. Two-tiered coupling between flowing actin and immobilized N-cadherin/catenin complexes in neuronal growth cones. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 6997-7002 (2015).
  35. Swaminathan, V., et al. Actin retrograde flow actively aligns and orients ligand-engaged integrins in focal adhesions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 10648-10653 (2017).
  36. Tsai, T. Y., et al. Efficient front-rear coupling in neutrophil chemotaxis by dynamic myosin II localization. Developmental Cell. 49, 189-205 (2019).
  37. Zhang, X. F., et al. Regulation of axon growth by myosin II-dependent mechanocatalysis of cofilin activity. Journal of Cell Biology. 218 (7), 2329-2349 (2019).
  38. Reversat, A., et al. Cellular locomotion using environmental topography. Nature. 582, 582-585 (2020).
  39. Katsuno, H., et al. Actin migration driven by directional assembly and disassembly of membrane-anchored actin filaments. Cell Reports. 12, 648-660 (2015).
  40. Urasaki, A., et al. Shootins mediate collective cell migration and organogenesis of the zebrafish posterior lateral line system. Scientific Reports. 9, 12156(2019).
  41. Abe, K., et al. Mechanosensitive axon outgrowth mediated by L1-laminin clutch interface. Biophysical Journal. 120, 3566-3576 (2021).
  42. Kastian, R. F., et al. Shootin1a-mediated actin-adhesion coupling generates force to trigger structural plasticity of dendritic spines. Cell Reports. 35, 109130(2021).
  43. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5, 605-607 (2008).
  44. Chan, C. E., Odde, D. J. Traction dynamics of filopodia on compliant substrates. Science. 322, 1687-1691 (2008).
  45. Wang, Y. L., Pelham, R. J. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).
  46. Li, Y., Hu, Z., Li, C. New method for measuring poisson's ratio in polymer gels. Journal of Applied Polymer Science. 50, 1107-1111 (1993).
  47. Belyy, A., Merino, F., Sitsel, O., Raunser, S. Structure of the Lifeact-F-actin complex. PLoS Biology. 18, 3000925(2020).
  48. Flores, L. R., Keeling, M. C., Zhang, X., Sliogeryte, K., Gavara, N. Lifeact-GFP alters F-actin organization, cellular morphology and biophysical behaviour. Scientific Reports. 9, 3241(2019).
  49. Kumari, A., Kesarwani, S., Javoor, M. G., Vinothkumar, K. R., Sirajuddin, M. Structural insights into actin filament recognition by commonly used cellular actin markers. EMBO Journal. 39, 104006(2020).
  50. du Roure, O., et al. Force mapping in epithelial cell migration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 2390-2395 (2005).
  51. Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466, 263-266 (2010).
  52. Koch, D., Rosoff, W. J., Jiang, J., Geller, H. M., Urbach, J. S. Strength in the periphery: growth cone biomechanics and substrate rigidity response in peripheral and central nervous system neurons. Biophysical Journal. 102 (3), 452-460 (2012).
  53. Barnes, J. M., Przybyla, L., Weaver, V. M. Tissue mechanics regulate brain development, homeostasis and disease. Journal of Cell Science. 130, 71-82 (2017).
  54. Moore, S. W., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. Stretchy proteins on stretchy substrates: the important elements of integrin-mediated rigidity sensing. Developmental Cell. 19, 194-206 (2010).
  55. Tyler, W. J. The mechanobiology of brain function. Nature Reviews Neuroscience. 13, 867-878 (2012).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

F actine retrograde flowsingle speckle imagingtractiekrachtmicroscopieneuronale migratieactinepolymerisatieconfocale microscopie

Gerelateerde artikelen