De huidige studie schetst een zeer reproduceerbare en handelbare methode om paracriene niet-canonische Wnt-signaleringsgebeurtenissen in vitro te bestuderen. Dit protocol werd toegepast om de impact van paracriene Wnt5a-signalering in muizenneuraalcellen en myoblasten te evalueren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Modellering Paracriene Niet-canonische Wnt Signalering In Vitro
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Niet-canonische Wnt-signalering reguleert de intracellulaire actinefilamentorganisatie en gepolariseerde migratie van voorlopercellen tijdens embryogenese. Dit proces vereist complexe en gecoördineerde paracriene interacties tussen signaal-zendende en signaal-ontvangende cellen. Aangezien deze interacties kunnen optreden tussen verschillende soorten cellen uit verschillende afstammingslijnen, kan in vivo evaluatie van celspecifieke defecten een uitdaging zijn. De huidige studie beschrijft een zeer reproduceerbare methode om paracriene niet-canonische Wnt-signalering in vitro te evalueren. Dit protocol is ontworpen met de mogelijkheid om (1) functionele en moleculaire beoordelingen uit te voeren van niet-canonische Wnt-signalering tussen twee celtypen van belang; (2) de rol van signaalzendende versus signaal-ontvangende moleculen in de niet-canonische Wnt-signaleringsroute te ontleden; en (3) fenotypische reddingsexperimenten uitvoeren met standaard moleculaire of farmacologische benaderingen.
Dit protocol werd gebruikt om neurale crest cell (NCC)-gemedieerde niet-canonische Wnt-signalering in myoblasten te evalueren. De aanwezigheid van NCC's is geassocieerd met een verhoogd aantal falloïdine-positieve cytoplasmatische filopodia en lamellipodie in myoblasten en verbeterde myoblastmigratie in een wondgenezingstest. De Wnt5a-ROR2-as werd geïdentificeerd als een cruciale niet-canonische Wnt-signaleringsroute tussen NCC en tweede hartveld (SHF) cardiomyoblastvoorlopers. Kortom, dit is een zeer handelbaar protocol om paracriene niet-canonische Wnt-signaleringsmechanismen in vitro te bestuderen.
Inleiding
Niet-canonische Wnt-signalering is een evolutionair geconserveerde route die de organisatie van cellulair filament en directionele migratie reguleert. Deze route is betrokken bij meerdere biologische processen, waaronder embryonale weefselmorfogenese 1,2,3, lymfatische en vasculaire angiogenese 4,5,6,7, en kankergroei en metastase 8,9,10 . Op cellulair nive....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Preexperimentele expansie en passaging van cellen
- C2C12 celcultuur:
- Bereid 500 ml C2C12 kweekmedium door Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) te combineren met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine.
- Ontdooi een injectieflacon met C2C12-cellen in een waterbad van 37 °C. Terwijl de C2C12-cellen ontdooien, voegt u 5 ml C2C12-medium toe aan een conische buis van 15 ml. Breng de ontdooide cellen onmiddellijk over naar de buis van 15 ml met behulp van een P1000-pipet.
OPMERKING: C2C12-cellen zijn muizenmyoblastcellen die eerder zijn gebruikt en gevalideerd als primaire cellijn voor het mod....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Effecten van NCC's op de migratiecapaciteit van muizenmyoblasten
Deze test werd voor het eerst toegepast om de impact van NCC's op de migratiecapaciteit van myoblasten te evalueren. Figuur 1 schetst het schematische model van de test. Om deze impact te testen, werden krastests uitgevoerd met myoblasten die geïsoleerd werden gekweekt (zonder NCC-inserts) in vergelijking met die gekweekt in de aanwezigheid van inserts. Als positieve controle werd 500 ng/ml recombinant Wnt5a.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De niet-canonische Wnt/planaire celpolariteit (PCP) signaleringsroute is een uiterst belangrijke cellulaire signaleringsroute die betrokken is bij meervoudige ontwikkelingsprocessen24,25 en ziekteprocessen24,26. Tijdens de embryonale ontwikkeling omvat niet-canonische Wnt-signalering een uitgebreid netwerk van moleculaire signalen van signaalzendende cellen die uiteindelijk veranderingen in morfo.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd bij afwezigheid van commerciële of financiële relaties die kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door NIH-awards F30HL154324 aan O.T. en K08HL121191 en R03HL154301 aan S.R.K. De auteurs willen graag erkennen dat het schema in figuur 1 in dit manuscript is gemaakt met biorender.com.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M-7522 | |
| Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | Opgeslagen bij 4 °C |
| Bovine serum albumin | Santa Cruz Biotechnology | sc-2323 | Opgeslagen bij 4 °C |
| C2C12 murine myoblast cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Cell culture flasks, 75 cm2 | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| Chamber Slide System, 4-well | ThermoFisher Scientific | 154526 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), high glucose (4.5 g/L), L-glutamine (2 mM) | Corning | 10-017-CV | Opgeslagen bij 4 °C |
| Falcon conical centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Falcon permeable support for 24-well plate with 0.4 µM transparent PET membrane | Corning | 353095 | |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | W3381E | Opgeslagen in 50 mL aliquoten bij -20 °C |
| Gelatin solution, 0.1% | ATCC | PCS-999-027 | Opgeslagen bij 4 °C |
| Graduated and sterile pipette tips, 10 µL | USA Scientific | 1111-3810 | |
| Leukemia inhibitory factor (LIF), 106 unit/mL | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| Minimum essential medium (MEM) | Corning | 10-022-CV | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Non-stick auto-glass coverslips, 24 x 55 mm | Springside Scientific | HRTCG2455 | |
| O9-1 neural crest cell line | Millipore Sigma | SCC049 | |
| Opti-MEM I, 1x | Gibco | 31985-070 | |
| Paraformaldehyde solution in PBS, 4% | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Opgeslagen bij 4 °C |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL penicillin and 10,000 μg/mL streptomycin) | Fisher Scientific | W3470H | Opgeslagen in 10 mL aliquoten bij -20 °C |
| Phalloidin-iFluor 488 | Abcam | ab176753 | Opgeslagen bij -20 °C, Uit de buurt van licht houden |
| Phosphate-buffer saline (PBS), 1x, without calcium and magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CV | Opgeslagen bij 4 °C |
| Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Recombinant human/mouse Wnt5a protein | R&D Systems | 645-WN-010 | |
| Sodium pyruvate, 100 mM | Gibco | 11360-070 | |
| Square Petri dish with grid | Thomas Scientific | 1219C98 | |
| STO murine fibroblast feeder cells | ATCC | CRL-1503 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Fisher Scientific | W3513C | Opgeslagen bij 4 °C |
| Zeiss Apotome.2 fluorescence microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss inverted Axio Vert.A1 light microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zen lite 2012 microscopy software | Carl Zeiss AG | beeldvormingssoftware |
Referenties
- Ho, H. Y. H., et al. Wnt5a-Ror-Dishevelled signaling constitutes a core developmental pathway that controls tissue morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (11), 4044-4051 (2012).
- Čapek, D., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
