Hier presenteren we een verbeterd chemotaxis-testprotocol. Het doel van dit protocol is om de stappen en kosten van traditionele bacteriële chemotaxismethoden te verminderen en te dienen als een waardevolle bron voor het begrijpen van plant-microbe interacties.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een verbeterde chemotaxistest voor de snelle identificatie van rhizobacteriële chemoattractanten in wortelexsudaten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Chemotaxis identificatie is erg belangrijk voor het onderzoek en de toepassing van rhizosfeer groeibevorderende bacteriën. We hebben een eenvoudige methode ontwikkeld om snel de chemoattractanten te identificeren die de chemotactische beweging van rhizosfeergroeibevorderende bacteriën op steriele glazen dia's via eenvoudige stappen kunnen induceren. Bacterieoplossing (OD600 = 0,5) en steriele chemoattractante waterige oplossing werden druppelsgewijs op de glasplaat toegevoegd met een interval van 1 cm. Een inentingslus werd gebruikt om de chemoattractante waterige oplossing met de bacteriële oplossing te verbinden. De glijbaan werd 20 minuten op kamertemperatuur gehouden op de schone bank. Ten slotte werd de chemoattractante waterige oplossing verzameld voor bacterieel tellen en microscopische observatie. In deze studie, door middel van meerdere vergelijkingen van experimentele resultaten, overwon de methode meerdere tekortkomingen van traditionele bacteriële chemotaxismethoden. De methode verminderde de fout van het tellen van platen en verkortte de experimentele cyclus. Voor de identificatie van chemoattractante stoffen kan deze nieuwe methode 2-3 dagen besparen in vergelijking met de traditionele methode. Bovendien stelt deze methode elke onderzoeker in staat om systematisch een bacterieel chemotaxis-experiment binnen 1-2 dagen te voltooien. Het protocol kan worden beschouwd als een waardevolle bron voor het begrijpen van plant-microbe interacties.
Inleiding
Chemotaxis is belangrijk voor de kolonisatie van plantengroeibevorderende rhizobacteriële (PGPR) op wortels en voor het begrijpen van plant-microbe interacties1. Een klasse van verbindingen met een laag molecuulgewicht (chemoattractanten) in plantenwortelexsudaten induceert de chemotactische beweging van PGPR naar de rhizosfeer2. Appelzuur, citroenzuur en andere componenten in de wortelexsudaten stimuleren chemotaxis van Bacillus-stammen3. Glucose, citroenzuur en fumaarzuur in maïswortelexsudaten rekruteren bijvoorbeeld bacteriën naar het worteloppervlak4. D-galactose, dat is afgeleid van wortelexsudaten, induceert de chemotaxis van Bacillus velezensis SQR95. Organische zuren, waaronder fumaraat, appelzuur en succinaat, beïnvloeden chemotaxis en kolonisatie van verschillende PGPR in het Cajanus cajan - Zea mays intercropping-systeem6. Oleanolic acid in rijstwortel exsudaten, werkt als een chemoattractant voor de stam FP357. Andere plantenexsudaten (waaronder histidine, arginine en aspartaat) kunnen een cruciale rol spelen in de chemotactische respons van bacteriën8. Plantenexsudaten functioneren als een signaal om de beweging van bacteriën te sturen, wat de eerste stap is tijdens de kolonisatie van de rhizosfeer. Plantenkolonisatie door PGPR is een proces van enorme relevantie, omdat PGPR gunstig is voor de plantgastheer.
Veel methoden zijn gebruikt voor het analyseren van bacteriële chemotaxis. De zwemplaatmethode is een van de eerder beschreven methoden9. Bij deze methode werden platen gemaakt met een halfvast medium. Een chemotactische buffer met agar (1,0%, w/v) werd aan de plaat toegevoegd. De buffer wordt verwarmd en vervolgens gemengd met het chemoattractant. Vervolgens werd 8 μL bacteriesuspensie druppelsgewijs aan het midden van de plaat toegevoegd en werd de plaat bij 28 °C in een incubator geplaatst. De plaat werd regelmatig geobserveerd en gefotografeerd. De experimentele cyclus van de zwemplaatmethode was echter erg lang. Bij de capillairachtige methode10 dient een pipetpunt als kamer voor het vasthouden van 100 μL bacteriële suspensie. 1 ml spuitnaald werd gebruikt als capillair. Een spuitnaald met chemoattractanten met verschillende concentratiegradiënten werd in de pipetpunt van 100 μL ingebracht. Na incubatie bij kamertemperatuur gedurende 3 uur werd de naald van de spuit verwijderd, de inhoud werd verdund en op het medium verguld. De bacteriële accumulatie in de spuit werd weergegeven door kolonievormende eenheden (CFU's) in de platen. De experimentele fout binnen replicaties voor de capillair-achtige methode was echter groot. Een andere methode gebruikte een microfluïdisch SlipChip-apparaat11. Kortom, runderserumalbumine (BSA) oplossing werd in alle kanalen geïnjecteerd en verwijderd met behulp van een vacuüm. De oplossingen die verschillende chemoattractanten bevatten (1 mM concentratie alleen voor kwalitatieve detectie), bacteriële cellen gesuspendeerd in fosfaat-gebufferde zoutoplossing en fosfaat gebufferde zoutoplossingbuffer (negatieve controle) werden toegevoegd aan respectievelijk de bovenste, middelste en onderste microwells. Incubatie werd vervolgens uitgevoerd in een donkere omgeving bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. De bacteriële cellen werden vervolgens gedetecteerd in de microwells. Het microfluïdische SlipChip-apparaat was echter duur. Daarom had elk van de hierboven beschreven methoden voor- en nadelen.
We hebben een verbeterde chemotaxis-test vastgesteld voor de snelle identificatie van rhizobacteriële chemoattractanten in wortelexsudaten met behulp van steriele glasglaasjes zonder ingewikkelde stappen. In deze studie, door middel van meerdere vergelijkingen van experimentele resultaten, overwon de methode meerdere tekortkomingen van traditionele bacteriële chemotaxismethoden. De methode verminderde de fout van het tellen van platen en verkortte de experimentele cyclus. Daarom kan deze nieuwe methode, indien gebruikt om een chemoattractante stof te identificeren, 2-3 dagen besparen en de kosten van experimentele materialen verlagen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Materialen en uitrusting
OPMERKING: Bacillus altitudinis LZP02 (CP075052) werd voor deze studie geïsoleerd uit de rhizosfeer van rijst in het noordoosten van China12,13.
- Cultuur B. altitudinis LZP02 in Luria-Bertani (LB) medium (pepton, 10 g L-1; NaCl, 8 g L-1 en gistextract, 5 g L-1) gedurende 10 uur. Verzamel cellen door centrifugering bij 9.569 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C. en bewaar met 15% glycerol bij -80 °C.
OPMERKING: Voor dit experiment werden rijstzaden (Oryza sativa Longgeng 46) geleverd door het Rice Research Institute van de Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences.
2. Verzameling van wortelexsudaten
- Verdeel rijstzaden willekeurig in een groeikamer.
OPMERKING: Rijstzaden werden gesteriliseerd met 30% H2O2 gedurende 30 minuten en 's nachts in water gedrenkt. De omstandigheden waren als volgt: de gecontroleerde lichtcyclus (16/8 uur licht/donker cyclus), temperatuur (22 ± 2 °C) en relatieve vochtigheid (͂70%). - Kweek rijstzaden gedurende een week en voeg twee keer steriel water toe.
- Selecteer rijstzaailingen van vergelijkbare grootte en plant in 50 ml Murashige en Skoog (MS) vloeibaar medium. Incubeer gedurende 48 uur bij 22 °C onder aseptische omstandigheden.
OPMERKING: Rijstwortelexsudaten worden vrijgegeven in het MS-medium14,15,16.
3. Vloeistofchromatografie-massaspectrometrie analyse van wortelexsudaten
- Verzamel 100 μL van het monster (MS-medium dat wortelexsudaten bevat) in een centrifugebuis van 1,5 ml. Voeg 20 μL van het extractiemiddel toe (acetonitril-methanol-water, 2:2:1, inclusief interne standaard). Homogeniseer het monster op 45 Hz gedurende 4 minuten, gevolgd door ultrasone trillingen op ijs gedurende 5 minuten in een waterbad.
- Herhaal de homogenisatie en ultrasone cyclus drie keer. Incubeer het monster bij -20 °C gedurende 1 uur, gevolgd door centrifugeren bij 133.778 x g en 4 °C gedurende 15 minuten.
- Breng het resulterende supernatant over naar LC-MS injectieflacons en bewaar bij -80 °C tot UHPLC-QE-analyse. Bereid de QC-monsters (Quality Control) voor door gelijke delen van het supernatant van alle monsters te mengen.
OPMERKING: Elk monstervolume was 600 μL (zes replicaties per experiment) in het gepresenteerde experiment. - Voer LC-MS/MS-analyses uit met behulp van het UHPLC-systeem, de UPLC HSS T3-kolom (2,1 mm x 100 mm, 1,8 μm) en Q Exactive12.
- Gebruik 0,1% mierenzuur waterige oplossing en 5 mmol/L ammoniumacetaat waterige oplossing als mobiele fase A en acetonitril als mobiele fase B. Gebruik mierenzuur en ammoniumacetaat als respectievelijk positieve en negatieve ionmodi.
- Stel de elutiedriënt als volgt in: 0 min, 1% B; 1 min, 1% B; 8 min, 99% B. 10 min, 99% B. 10,1 min, 1% B; 12 min, 1% B. Stel het debiet en het injectievolume in op respectievelijk 0,5 ml/min en 2 μL.
OPMERKING: Het macromolecuul (>1.000 Dalton) kan niet worden gedetecteerd.
4. Chemotaxis assay
- Bereid de chemoattractante waterige oplossing. Zorg ervoor dat het steriel is. Filter de chemoattractieve oplossing met een bacteriefilter van 0,22 μm.
OPMERKING: De chemoattractante waterige oplossing was de enige stof die werd verkregen uit de LC-MS-onderzoeken opgelost in water. De concentratie en het volume kunnen op de juiste manier worden aangepast volgens verschillende onderzoeken. Citroenzuuroplossing werd als voorbeeld gebruikt. Alle acties moeten aan de zijkant van een lamp worden uitgevoerd. - Markeer de middelste positie van de glasplaat met een interval van 1 cm. Zorg ervoor dat de glasplaat meerdere keren op de vlam wordt gesteriliseerd.
- Voeg de 30 μL chemoattractieve oplossing toe aan de linkerkant van de glasplaat. Zorg ervoor dat bacteriën werden gekweekt tot het logaritmische stadium (2 x 108 CFU / ml) in LB-medium. Voeg 30 μL van de bacteriële oplossing toe aan de rechterkant van de glasplaat.
OPMERKING: Bereid een negatieve controlegroep voor met een gelijk volume steriel water. De zoutoplossing (0,9% NaCI) werd gebruikt als positieve controle om de veranderingen veroorzaakt door intermoleculaire kracht op het experiment te elimineren. - Steriliseer een entlus meerdere keren op de vlam. Gebruik de entlus om de chemoattractante waterige oplossing aan te sluiten op de bacteriële oplossing en houd deze gedurende 20 minuten op kamertemperatuur op een schone bank.
OPMERKING: Het experiment moet worden uitgevoerd in een windstille omgeving. Pas de tijd voordat u de verbindingslijn loskoppelt voor stammen met verschillende atletische vermogens op de juiste manier aan. - Koppel na 20 minuten de verbindingsleiding los met filterpapier.
- Zorg ervoor dat de centrifugebuis van 1,5 ml steriel is. Verzamel de chemoattractante waterige oplossing aan de linkerkant van de glasplaat. Breng de oplossing over in de steriele centrifugebuis van 1,5 ml.
- Voeg het juiste volume safranine toe aan de centrifugebuis. Verzamel na 2 minuten de mengbare vloeistoffen voor het tellen van bacteriën en microscopische observatie met een bloedtelkamer.
5. Resultaten analyse
- Bepaal het aantal levensvatbare micro-organismen dat wordt aangetrokken met behulp van de volgende vergelijking:
waarbij NBC: Totaal aantal bacteriecellen; N: Aantal bacteriën in 80 roosters.
OPMERKING: Statistische analysesoftware werd gebruikt voor gegevensanalyse. De fout was gebaseerd op drie verschillende gerepliceerde experimentele waarden en werd berekend met behulp van eenrichtings-ANOVA gevolgd door de post-hoc analyse van Turkije. P ≤ 0,05 werd als significant beschouwd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In totaal werden 584 en 937 bekende metabolieten gedetecteerd in respectievelijk de positieve en negatieve ionenindices. Eerdere studies hebben aangetoond dat chemoattractanten meestal organische zuren, aminozuren en koolhydraten zijn17,18.
In deze studie werden 16 soorten chemoattractanten uit de LC-MS studies in de rijst rhizosfeer exsudaten geselecteerd voor latere experimenten (tabel 1). Met behulp van de zwemplaat...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Toenemend onderzoek wijst uit dat interacties tussen plant en bacteriën voornamelijk in de rhizosfeer voorkomen en worden beïnvloed door wortelexsudaten20,21,22,23,24. Plantenwortelexsudaten omvatten een breed scala aan primaire metabolieten, waaronder fenolzuren, organische zuren en aminozuren, evenals complexere secundaire verbindingen25,26,27.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nrs. 31870493), de belangrijkste onderzoeks- en ontwikkelingsprojecten in Heilongjiang, China (GA21B007) en de basisonderzoekskosten van universiteiten in de provincie Heilongjiang, China (nr. 135409103).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 490-79-9 | |
| Acetonitrile | CNW Technologies | 75-05-8 | |
| Ammonium acetate | CNW Technologies | 631-61-8 | |
| Caffeïnezuur | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 331-39-5 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Fresco17 | |
| Citroenzuur | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 77-92-9 | |
| Schone werkbank | Shanghai Boxun Industrial Co., Ltd. | BJ-CD | |
| Ferulinezuur | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 1135-24-6 | |
| Mierenzuur | CNW Technologies | 64-18-6 | |
| Fructose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 57-48-7 | |
| Galactose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 59-23-4 | |
| Glycine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 56-40-6 | |
| Maalmolen | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. | JXFSTPRP-24 | |
| Histidine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 71-00-1 | |
| Interne standaard: 2-Chloro-L-phenylalanine | Shanghai Hengbai Biotech C.,Ltd. | 103616-89-3 | |
| Leucine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 61-90-5 | |
| Appelzuur | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 6915-15-7 | |
| Mannose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 3458-28-4 | |
| Massaspectrometer | Thermo Fisher Scientific | Q Exactive Focus | |
| Methanol | CNW Technologies | 67-56-1 | |
| Optische microscoop | Olympus | BX43 | |
| Phenylalanine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 63-91-2 | |
| Proline | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 147-85-3 | |
| Weegschalen | Sartorius | BSA124S-CW | |
| Serine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 56-45-1 | |
| Threonine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 72-19-5 | |
| UHPLC | Agilent | 1290 UHPLC | |
| Ultrasone instrument | Shenzhen Leidebang Electronics Co., Ltd. | PS-60AL | |
| Valine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 7004-03-7 |
Referenties
- Belas, R. Biofilms, flagella, and mechanosensing of surfaces by bacteria. Trends in Microbiology. 22 (9), 517-527 (2014).
- Haichar, Z., Santaella, C., Heulin, T., Achouak, W. Root exudates mediated interactions belowground. Soil Biology and Biochemistry. 77 (7), 69-80 (2014).
- Zhang, N., et al. Effects of different plant root exudates and their organic acid components on chemotaxis, biofilm formation and colonization by beneficial rhizosphere-associated bacterial strains. Plant and Soil. 374 (1-2), 689-700 (2014).
- Zhang, N., et al. Whole transcriptomic analysis of the plant-beneficial rhizobacterium Bacillus amyloliquefaciens SQR9 during enhanced biofilm formation regulated by maize root exudates. BMC Genomics. 16 (1), 685(2015).
- Lui, Y., et al. Induced root-secreted D-galactose functions as a chemoattractant and enhances the biofilm formation of Bacillus velezensis SQR9 in an mcpa-dependent manner. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (17), 785-797 (2020).
- Vora, S. M., Joshi, P., Belwalkar, M., Archana, G. Root exudates influence chemotaxis and colonization of diverse plant growth-promoting rhizobacteria in the Cajanus cajan - Zea mays intercropping system. Rhizosphere. 18 (12), 100331(2021).
- Sampedro, I., et al. Effects of halophyte root exudates and their components on chemotaxis, biofilm formation and colonization of the halophilic bacterium halomonas anticariensis FP35T. Microorganisms. 8 (4), 575(2020).
- Liu, X. L., Raza, W., Ma, J. H., Huang, Q. W., Shen, Q. R. A dual role amino acid from sesbania rostrata seed exudates in the chemotaxis response of Azorhizobium caulinodans ORS571. Molecular Plant-Microbe Interactions. 32 (9), 1134-1147 (2019).
- Ling, N., Raza, W., Ma, J. H., Huang, Q. W., Shen, Q. R. Identification and role of organic acids in watermelon root exudates for recruiting Paenibacillus polymyxa SQR-21 in the rhizosphere. European Journal of Soil Biology. 47 (6), 374-379 (2011).
- Rudrappa, T., Czymmek, K. J., Pare, P. W., Bais, H. P. Root-secreted malic acid recruits beneficial soil bacteria. Plant Physiology. 148 (3), 1547-1556 (2008).
- Shen, C., et al. Bacterial chemotaxis on Slipchip. Lab on a Chip. 14 (16), 3074-3080 (2014).
- Liu, H., et al. Bacillus pumilus LZP02 promotes rice root growth by improving carbohydrate metabolism and phenylpropanoid biosynthesis. Molecular Plant-Microbe Interactions. 33 (10), 1222-1231 (2020).
- Goswami, M., Deka, S. Isolation of a novel rhizobacteria having multiple plant growth promoting traits and antifungal activity against certain phytopathogens. Microbiological Research. 240, 126516(2020).
- Kaiira, M., Chemining'Wa, G., Ayuke, F., Baguma, Y., Nganga, F. Profiles of compounds in root exudates of rice, cymbopogon, desmodium, mucuna and maize. Journal of Agricultural Sciences Belgrade. 64 (4), 399-412 (2019).
- Shi, Y., et al. Effect of rice root exudates and strain combination on biofilm formation of Paenibacillus polymyxa and Paenibacillus macerans. African Journal of Microbiology Research. 6 (13), 3343-3347 (2012).
- Lee, H. W., Ghimire, S. R., Shin, D. H., Lee, I. J., Kim, K. U. Allelopathic effect of the root exudates of K21, a potent allelopathic rice. Weed Biology and Management. 8 (2), 85-90 (2008).
- Belimov, A. A., et al. Rhizobacteria that produce auxins and contain 1-amino-cyclopropane-1-carboxylic acid deaminase decrease amino acid concentrations in the rhizosphere and improve growth and yield of well-watered and water-limited potato (Solanum tuberosum). Annals of Applied Biology. 167 (1), 11-25 (2015).
- Ankati, S., Podile, A. R. Metabolites in the root exudates of groundnut change during interaction with plant growth promoting rhizobacteria in a strain-specific manner. Journal of Plant Physiology. 243, 153057(2019).
- Gordillo, F., Chavez, F., Jerez, C. A. Motility and chemotaxis of Pseudomonas sp. B4 towards polychlorobiphenyls and chlorobenzoates. FEMS Microbiology Ecology. 60 (2), 322-328 (2007).
- Bais, H. P., Weir, T. L., Perry, L. G., Gilroy, S., Vivanco, J. M. The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms. Annual Review of Plant Biology. 57, 233-266 (2006).
- Badri, D. V., Vivanco, J. M. Regulation and function of root exudates. Plant Cell Environment. 32 (6), 666-681 (2009).
- Badri, D. V., Weir, T. L., Lelie, D., Vivanco, J. M. Rhizosphere chemical dialogues: plant-microbe interactions. Curr Opin Biotech. Current Opinion in Biotechnology. 20 (6), 642-650 (2009).
- Kamilova, F., Kravchenko, L. V., Shaposhnikov, A. I., Makarova, N., Lugtenberg, B. Effects of the tomato pathogen Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici and of the biocontrol bacterium Pseudomonas fluorescens WCS365. Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (10), 1121-1126 (2006).
- Kamilova, F., et al. Organic acids, sugars, and L-tryptophane in exudates of vegetables growing on stonewool and their effects on activities of rhizosphere bacteria. Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (3), 250-256 (2006).
- Badri, D. V., Vivanco, J. M. Regulation and function of root exudates. Plant Cell Environment. 32 (6), 666-681 (2009).
- Hao, W. Y., Ren, L. X., Ran, W., Shen, Q. R. Allelopathic effects of root exudates from watermelon and rice plants on Fusarium oxysporum f.sp. Niveum. Plant and Soil. 336 (1-2), 485-497 (2010).
- Hao, Z. P., Wang, Q., Christie, P., Li, X. L. Allelopathic potential of watermelon tissues and root exudates. Scientia Horticulturae. 112 (3), 315-320 (2007).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
