Methodenartikel

Alizarine rode kleuring gebruiken om chemisch geïnduceerd botverlies bij zebravislarven te detecteren

DOI:

10.3791/63251

⸱

28 december 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Toxicology, School of Public Health, Jiangsu Key Laboratory of Preventive and Translational Medicine for Geriatric Diseases, Medical College of Soochow University, 2Department of Occupational Disease Prevention, Jiangsu Provincial Center for Disease Control and Prevention, 3Jiangsu Preventive Medicine Association, Nanjing, China

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier hebben we alizarine rode kleuring gebruikt om aan te tonen dat blootstelling aan loodacetaat een botmassaverandering veroorzaakt bij zebravislarven. Deze kleuringsmethode kan worden aangepast aan het onderzoek naar botverlies bij verlies van zebravislarven veroorzaakt door andere gevaarlijke toxische stoffen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chemisch geïnduceerd botverlies als gevolg van blootstelling aan lood (Pb) kan een reeks nadelige effecten op zowel menselijke als dierlijke skeletsystemen veroorzaken. De specifieke effecten en mechanismen bij zebravissen blijven echter onduidelijk. Alizarine rood heeft een hoge affiniteit voor calciumionen en kan helpen bij het visualiseren van het bot en het illustreren van de minerale massa van het skelet. In deze studie wilden we loodacetaat (PbAc) -geïnduceerd botverlies in zebravislarven detecteren door alizarine rode kleuring te gebruiken. Zebravisembryo's werden behandeld met een reeks PbAc-concentraties (0, 5, 10, 20 mg / L) tussen 2 en 120 uur na de bevruchting. Whole-mount skeletkleuring werd uitgevoerd op larven 9 dagen na de bevruchting en het totale gekleurde gebied werd gekwantificeerd met behulp van ImageJ-software. De resultaten gaven aan dat de gemineraliseerde weefsels rood gekleurd waren en dat het gekleurde gebied aanzienlijk afnam in de PbAc-blootstellingsgroep, met een dosisafhankelijke verandering in botmineralisatie. Dit artikel presenteert een kleuringsprotocol voor het onderzoeken van skeletveranderingen in PbAc-geïnduceerde botdefecten. De methode kan ook worden gebruikt bij zebravislarven voor de detectie van botverlies veroorzaakt door andere chemicaliën.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Recente studies hebben bevestigd dat osteoporose als gevolg van glucocorticoïden, aromataseremmers en overmatig alcoholgebruik vaak voorkomt 1,2. Lood (Pb) is een giftig metaal dat voorkomt in planten, bodem en aquatische omgevingen3. Hoewel de nadelige effecten van Pb op het menselijk lichaam veel aandacht hebben getrokken, moet de onomkeerbare impact ervan op het bot verder worden onderzocht. Loodintoxicatie veroorzaakt een breed scala aan pathologische veranderingen in zowel het zich ontwikkelende als het volwassen skelet, wat van invloed is op normale levensactiviteiten. Studies hebben een verband gevonden tussen chronische Pb-blootstelling en botschade4, waaronder aangetaste botstructuren 5,6, verminderde botmineraaldichtheid en zelfs een verhoogd risico op osteoporose7.

Gemineraliseerd weefsel is van groot belang voor botsterkte8, en botmineralisatiematrixafzetting is een kritische index van botvorming9. Alizarine rood heeft een hoge affiniteit voor calciumionen en alizarine rode kleuring is een standaardprocedure voor het beoordelen van botvorming10. Volgens deze methode wordt gemineraliseerd weefsel rood gekleurd, terwijl al het andere weefsel transparant blijft. Het bevlekte gebied wordt vervolgens gekwantificeerd door digitale beeldanalyse11.

Zebravis is een belangrijk modelorganisme dat veel wordt gebruikt in geneesmiddelenontdekkings- en ziektemodellen. Genetische studies bij zebravissen en mensen hebben overeenkomsten aangetoond in de onderliggende mechanismen van skeletmorfogenese op moleculair niveau12. Bovendien is high-throughput screening van geneesmiddelen of biomolecuulen haalbaarder in grote klauwen zebravissen dan muizenmodellen, waardoor de mechanistische studie van proosteogene of osteotoxische moleculenwordt vergemakkelijkt 13. Differentiële kleuring van het skelet in toto10 wordt vaak gebruikt bij het bestuderen van skeletdysplasie bij kleine gewervelde dieren en zoogdierfoetussen. Alizarine rode kleuring werd uitgevoerd om de botontwikkelingstoxiciteit van chemicaliën in zebravislarven te onderzoeken. Hierin gebruikten we lood als voorbeeld om een protocol te beschrijven voor het detecteren van door loodacetaat geïnduceerde botdefecten bij zebravislarven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierprocedures die hier worden beschreven, zijn beoordeeld en goedgekeurd door het Animal Care Institute van de ethische commissie van de Soochow University.

1. Vishouderij en embryocollectie 14

  1. Voer vis drie keer per dag; ervoor zorgen dat de zebravissen op 28,5 ± 0,5 °C worden gehouden met een licht/donkercyclus van 14:10 uur.
  2. Scheid de mannelijke en vrouwelijke volwassen vissen door isolatieborden in paaitanks in een 2: 1 man/vrouw verhouding in de avond.
  3. Verwijder de volgende ochtend om 9:00 uur de isolatieborden en haal de embryo's 2 uur later op.
  4. Plaats de embryo's vóór het experiment in een biochemische incubator die op 28,5 °C wordt gehouden.

2. Blootstelling aan chemische stoffen

  1. Bereid de moedervoorraad voor: weeg loodacetaattrihydraat (5 g) en los het op in ultrapuur water (50 ml) met roeren.
    LET OP: PbAc is giftig. Draag geschikte stofmaskers, beschermende kleding en handschoenen. Voer het experiment uit onder een zuurkast.
  2. Selecteer en verdeel zebravisembryo's willekeurig in schone 6-well-platen (30 embryo's per put in 3 ml zebravisbroedwater; zie tabel 1 voor de samenstelling). Behandel de embryo's met PbAc (0, 5, 10, 20 mg/L) van 2 tot 120 uur na de bevruchting (hpf).
    OPMERKING: De concentraties van PbAc werden gekozen op basis van de experimenten met het vinden van het dosisbereik. De resultaten toonden aan dat de LC50 van loodacetaat op zebravisembryo's 41,044 mg / L was bij 120 pkf. Daarom werd de hoogste concentratie ingesteld op de helft van de LC50 en een reeks oplossingen bereid door 2-voudige verdunning.
  3. Voer de larven twee keer per dag vanaf 5 dagen na de bevruchting (dpf). Houd de zebravisembryo's op 28,5 ± 0,5 °C met een licht/donkercyclus van 14:10 uur.
  4. Ververs het Pb-vrije medium (zebravisbroedwater) elke 24 uur tot 9 dpf.
    OPMERKING: Na voltooiing van de experimenten werden alle loodhoudende oplossingen in een aangewezen vloeistoftank gegoten en behandeld door het experimentmanagementcentrum.

3. Alizarine rode kleuring

OPMERKING: Draag geschikte stofmaskers, beschermende kleding en handschoenen tijdens het hele kleuringsproces. De samenstellingen van alle oplossingen zijn weergegeven in tabel 1.

  1. Specifieke kleuringsstappen
    OPMERKING: Het verfproces werd uitgevoerd in een 24-well plaat bij kamertemperatuur. Nadat elke oplossing is toegevoegd, plaatst u de 24-wells plaat op de schudtafel op een lage snelheid.
    1. Verwijder willekeurig 10 zebravislarven uit elke groep op 9 dpf en fixeer de vis in 1 ml 2% paraformaldehyde / 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing gedurende 2 uur.
    2. Decanteer de oplossing en was de zebravislarven met 100 mM Tris-HCl (pH 7,5)/10 mM MgCl2 gedurende 10 min.
    3. Decanteer de oplossing en incubeer de larven in de volgende oplossingen gedurende elk 5 minuten voor destaining: watervrije ethanol (EtOH) oplossing (80% EtOH/100 mM Tris-HCl (pH 7,5)/10 mM MgCl2, 50% EtOH/100 mM Tris-HCl (pH=7,5) en 25% EtOH/100mM Tris-HCl (pH=7,5).
    4. Decanteer de oplossing, verwijder het pigment door te bleken met een oplossing bestaande uit 3% H2O2 en 0,5% KOH en observeer eenmaal per 10 minuten totdat het pigment volledig is verwijderd.
    5. Spoel de zebravislarven meerdere keren af met 25% glycerine/0,1% KOH gedurende 10 minuten elk totdat er geen bubbels zijn.
      OPMERKING: Het is belangrijk om bubbels te vermijden; anders verschijnen de bubbels in het zebravislichaam als een zwart gezichtsveld onder de microscoop, wat van invloed zal zijn op waarnemingen en kwantitatieve analyse.
    6. Kleur de larven door 50 minuten in 1 ml 0,01% alizarine te weken.
    7. Decanteer de oplossing en voeg 1 ml 50% glycerine / 0,1% KOH toe gedurende 10 minuten om de achtergrond vrij te maken. Bewaar de vissen in verse 50% glycerine/0,1% KOH voor latere observatie.

4. Beeldacquisitie

  1. Breng elke keer één larve over op de glasglaas, waarbij de larve in het midden van de vloeistofdruppel blijft.
  2. Observeer de larven onder een stereomicroscoop.
  3. Schakel de camera in, open de software (zie de tabel met materialen) en behoud de standaardinstellingen.
  4. Klik op AE en kies een geschikte belichtingstijd (60 ms in dit experiment) om het beste beeld te verkrijgen.
  5. Leg alle afbeeldingen vast onder dezelfde instellingen. Sla de afbeeldingen op in .tif indeling voor latere analyse.

5. Beeldanalyse

OPMERKING: Zie het aanvullende bestand voor een voorbeeld met een set voorbeeldgrafieken voor beeldanalyse.

  1. Dubbelklik op het ImageJ-pictogram en analyseer de afbeeldingen die zijn opgeslagen in stap 4.5.
    1. Klik op Bestand | Open om de afbeeldingen te openen die zijn opgeslagen in stap 4.5.
    2. Klik op Afbeelding | Typ, selecteer 8-bits.
    3. Klik op Bewerken | Omkeren.
    4. Klik op Analyseren | Kalibreren, selecteer Ongekalibreerde OD in de pop-upinterface, vink Algemene kalibratie linksonder in de onderste interface aan en klik op OK.
    5. Klik op Analyseren | Schaal instellen | Klik op Schaal verwijderen in de pop-upinterface, vink hieronder Algemeen aan en klik op OK.
    6. Klik op Analyseren | Stel Metingen in, selecteer het itemgebied in de pop-upinterface, vink de limiet tot drempel hieronder aan (om alleen het geselecteerde bereik te meten) en klik op OK.
    7. Klik op Afbeelding | Aanpassen| Drempel, schuif de schuifregelaar in het midden van de pop-upinterface om de juiste drempel te selecteren (wijzig de drempel voor elke afbeelding) zodat alle doelen die in één afbeelding moeten worden getest, zijn geselecteerd en klik op Instellen.
    8. Klik op Analyseren | Meten. Noteer de datums van elke groep.
  2. Gebruik eenrichtings-ANOVA gevolgd door tukey's meervoudige vergelijkingstest om de verschillen te analyseren en stel het significantieniveau in op p < 0,001 (***).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alizarine rode kleuring is een gevoelige en specifieke methode voor het meten van veranderingen in botmineralisatie bij zebravislarven. In deze studie hebben we waargenomen dat PbAc nadelige effecten had op zebravislarven, waaronder dood, misvorming, verminderde hartslag en verkorting van de lichaamslengte. Bovendien werden de minerale skeletgebieden van zebravislarven geëvalueerd om PbAc-geïnduceerd botverlies te onderzoeken. Bij 9 dpf (figuur 1A) zijn veel botten van het hoofdskelet gemine...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De zebravis is een geschikt model voor het bestuderen van botmetabolismeziekte. In vergelijking met knaagdiermodellen zijn zebravismodellen relatief snel vast te stellen en is het meten van de ernst van de ziekte eenvoudiger. Bij wild-type zebravislarven treedt mineralisatie van het hoofdskelet op bij 5 dpf en het axiale skelet bij 7 dpf15. Schedelbotten zoals PS, OP, CB en NC zijn dus goed ontwikkeld met 9 dpf. Nadat de larven volledig waren vastgehouden en gebleekt, werden de zachte weefsels ver...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (81872646; 81811540034; 81573173) en de Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 M Tris-HCl (pH=7.5)Solarbio, Beijing, China21voor het vasthouden
4% Paraformaldehyde Fix SolutionBBI, Shanghai, China14voor het fixeren van weefsels
10x PBS bufferBBI, Shanghai, China15voor het fixeren
35% H2O2Yonghua, Jiangsu, China8pigmentverwijdering
50 mL Centrifuge tubeAKX, Jiangsu, China4
95% Anhydrous ethanolEnox, Jiangsu, China2ontkleuring
Alizarin red (Purity 99.5%)Solarbio, Beijing, China1kleuring
Biochemical incubatorYiheng, Shanghai, China3kweek van zebravis-embryo's
Electronic scaleSartorius, Duitsland5wegen van de vaste grondstoffen
Glycerin (Purity 99.5%)BBI, Shanghai, China7opslag van de gekleurde vissen
ImageJ (software)VS9digitale analyse
KOH (Purity 99.9%)Sigma, Amerika10bleekvloeistof
Lead acetate trihydrate (Purity 99.5%)Aladdin, Shanghai, China11
MgCl2 (Purity 99.9%)Aladdin, Shanghai, China12reinigingsvloeistof
NIS-Elements F (software)Nikon, Japan13waarnemen en foto's maken
PipeAKX, Jiangsu, China18verwijdering van embryo's en oplossing
plates (24-well)Corning, Amerika17container voor het kleuren van embryo's
plates (6-well)Corning, Amerika16container voor het fokken van embryo's
Shaking tableBeyotime, China19mengen van de oplossing
Stereo microscopeNikon, Japan20waarnemen en foto's maken
ZebrafishZebrafish Experiment Center of Soochow University, Suzhou, China22experimenteel dier

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Compston, J., et al. Recommendations for the registration of agents for prevention and treatment of glucocorticoid-induced osteoporosis: an update from the Group for the Respect of Ethics and Excellence in Science. Osteoporosis International. 19 (9), 1247-1250 (2008).
  2. Rachner, T. D., Gobel, A., Jaschke, N. P., Hofbauer, L. C. Challenges in preventing bone loss induced by aromatase inhibitors. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (10), (2020).
  3. Kataba, A., et al. Acute exposure to environmentally relevant lead levels induces oxidative stress and neurobehavioral alterations in larval zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 227, 105607(2020).
  4. Morin, S. N., et al. Differences in fracture prevalence and in bone mineral density between Chinese and White Canadians: the Canadian Multicentre Osteoporosis Study (CaMos). Archives of Osteoporosis. 15 (1), 147(2020).
  5. Lee, C. M., et al. Chronic lead poisoning magnifies bone detrimental effects in an ovariectomized rat model of postmenopausal osteoporosis. Experimental Toxicologic Pathology. 68 (1), 47-53 (2016).
  6. Theppeang, K., et al. Associations of bone mineral density and lead levels in blood, tibia, and patella in urban-dwelling women. Environmental Health Perspectives. 116 (6), 784-790 (2008).
  7. Sun, Y., et al. Osteoporosis in a Chinese population due to occupational exposure to lead. American Journal Industrial Medicine. 51 (6), 436-442 (2008).
  8. Guadalupe-Grau, A., Fuentes, T., Guerra, B., Calbet, J. A. L. Exercise and bone mass in adults. Sports Medicine. 39 (6), 439-468 (2009).
  9. Ottani, V., Raspanti, M., Ruggeri, A. Collagen structure and functional implications. Micron. 32 (3), 251-260 (2001).
  10. Kelly, W. L., Bryden, M. M. A modified differential stain for cartilage and bone in whole mount preparations of mammalian fetuses and small vertebrates. Stain Technology. 58 (3), 131-134 (1983).
  11. Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).
  12. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  13. Fernandez, I., Gavaia, P. J., Laize, V., Cancela, M. L. Fish as a model to assess chemical toxicity in bone. Aquatic Toxicology. 194, 208-226 (2018).
  14. Wang, L., et al. Role of GH/IGF axis in arsenite-induced developmental toxicity in zebrafish embryos. Ecotoxicology Environmental Safety. 201, 110820(2020).
  15. Bergen, D. J. M., Kague, E., Hammond, C. L. Zebrafish as an emerging model for osteoporosis: a primary testing platform for screening new osteo-active compounds. Frontiers in Endocrinology. 10, 6(2019).
  16. Charles, J. F., et al. Utility of quantitative micro-computed tomographic analysis in zebrafish to define gene function during skeletogenesis. Bone. 101, 162-171 (2017).
  17. Hammond, C. L., Moro, E. Using transgenic reporters to visualize bone and cartilage signaling during development in vivo. Frontiers in Endocrinology. 3, 91(2012).
  18. Bensimon-Brito, A., et al. Revisiting in vivo staining with alizarin red S--a valuable approach to analyse zebrafish skeletal mineralization during development and regeneration. BMC Developmental Biology. 16, 2(2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Detectie van botverliesblootstelling aan loodacetaatskeletkleuringbotmineralisatiechemische bottoxiciteitstereomicroscopieImageJ analyseosteoporosemodel

Gerelateerde artikelen