Necrotiserende enterocolitis (NEC) is de ernstigste gastro-intestinale (GI) ziekte die vaak voorkomt bij premature baby's, vooral baby's met een zeer laag geboortegewicht, met een hoge mortaliteit en onduidelijke pathogenese. De oorzaak van NEC kan verband houden met inflammatoire immuunregulerende systeemafwijkingen. Een NEC-diermodel is een onmisbaar hulpmiddel voor nec-ziekte-immuunonderzoek. NEC-diermodellen gebruiken meestal C57BL / 6J neonatale muizen; BALB/c neonatale muizen worden zelden gebruikt. Gerelateerde studies hebben aangetoond dat wanneer muizen geïnfecteerd zijn, Th2-celdifferentiatie overheersend is bij BALB / c-muizen in vergelijking met C57BL / 6J-muizen. Studies hebben gesuggereerd dat het optreden en de ontwikkeling van NEC geassocieerd zijn met een toename van T-helper type 2 (Th2) cellen en over het algemeen gepaard gaan met infectie. Daarom gebruikte deze studie neonatale BALB / c-muizen om een NEC-model te induceren met vergelijkbare klinische kenmerken en intestinale pathologische veranderingen als die waargenomen bij kinderen met NEC. Verder onderzoek is gerechtvaardigd om te bepalen of dit diermodel kan worden gebruikt om Th2-celresponsen in NEC te bestuderen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een neonatale BALB / c muismodel van necrotiserende enterocolitis
* These authors contributed equally
In dit artikel
Erratum-melding
Samenvatting
Samenvatting
Necrotiserende enterocolitis (NEC) is de ernstigste gastro-intestinale (GI) ziekte die vaak voorkomt bij premature baby's, vooral baby's met een zeer laag geboortegewicht, met een hoge mortaliteit en onduidelijke pathogenese. De oorzaak van NEC kan verband houden met inflammatoire immuunregulerende systeemafwijkingen. Een NEC-diermodel is een onmisbaar hulpmiddel voor nec-ziekte-immuunonderzoek. NEC-diermodellen gebruiken meestal C57BL / 6J neonatale muizen; BALB/c neonatale muizen worden zelden gebruikt. Gerelateerde studies hebben aangetoond dat wanneer muizen geïnfecteerd zijn, Th2-celdifferentiatie overheersend is bij BALB / c-muizen in vergelijking met C57BL / 6J-muizen. Studies hebben gesuggereerd dat het optreden en de ontwikkeling van NEC geassocieerd zijn met een toename van T-helper type 2 (Th2) cellen en over het algemeen gepaard gaan met infectie. Daarom gebruikte deze studie neonatale BALB / c-muizen om een NEC-model te induceren met vergelijkbare klinische kenmerken en intestinale pathologische veranderingen als die waargenomen bij kinderen met NEC. Verder onderzoek is gerechtvaardigd om te bepalen of dit diermodel kan worden gebruikt om Th2-celresponsen in NEC te bestuderen.
Inleiding
Necrotiserende enterocolitis (NEC), de ernstigste gastro-intestinale (GI) ziekte, komt voor bij de meeste premature baby's (>90%), vooral die met een zeer laag geboortegewicht (VLBW)1. Bij VLBW-zuigelingen varieert de incidentie van de ziekte van 10% tot 12% en de mortaliteit van kinderen met de diagnose NEC ligt tussen 20% en 30%2,3. De oorzaak van NEC kan verband houden met mucosale verwondingen, invasie door pathogene bacteriën en darmvoeding, wat kan leiden tot ontstekingsreacties en de inductie van darmletsels bij gevoelige gastheren3. De pathogenese van NEC is onduidelijk. Relevant onderzoek toont aan dat de immuunrespons van het getroffen kind abnormaal is en dat genetische gevoeligheid, microvasculaire spanning en intestinale bacteriële veranderingen een belangrijke rol kunnen spelen bij de ziekte3.
Het NEC diermodel is een onmisbaar instrument voor onderzoek naar de pathogenese van NEC. De diersoorten die worden gebruikt voor NEC-modellen zijn varkens, ratten en muizen. Vanwege de lange draagtijd, groeicycli en hoge kosten zijn varkens de afgelopen jaren echter niet de eerste keuze geweest voor NEC-modellen en zijn ze vervangen door ratten of muizen4. Omdat er verschillen zijn in de immuunachtergrond van verschillende muizenstammen5, moeten verschillende studies verschillende muizenstammen gebruiken om NEC-diermodellen vast te stellen. BALB/c muizen hebben een belangrijk kenmerk; wanneer ze geïnfecteerd zijn of omgaan met externe schade, is de polarisatie van TH2-cellen tijdens infectie bij muizen aanzienlijk sterker dan die bij andere muizenstammen6,7,8. T-helpercellen spelen een cruciale rol in het optreden en de progressie van NEC, met name de ontwikkeling van TH2-cellen3,9,10,11. Daarom gebruikte deze studie BALB / c-muizen om het NEC-model vast te stellen, wat nuttig kan zijn voor NEC-ziekteonderzoek op T-cellen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dit onderzoek werd goedgekeurd door de Medical Ethics Committee van Guangzhou Women and Children's Medical Center (NO. 174A01) en de Animal Ethical Committee van het Guangzhou Forevergen Biosciences Laboratory Animal Center (IACUC-G160100). Alle dieren werden gefokt in dezelfde ruimte in een specifieke pathogeenvrije (SPF) omgeving en experimenten werden uitgevoerd in een conventionele omgeving. De muizen die voor de fokkerij werden gebruikt, waren 7-8 weken oud; de muizen voor het induceren van NEC (n = 72) werden op dag 4 van de dam gescheiden en de dammen (n = 14) werden in de oorspronkelijke kooi gehouden en verzorgden de controlegroepmuizen (Vervolg) (n = 24).
1. Bereiding van reagentia en hulpmiddelen
- Bereid de melkvervanger voor de BALB/c-muizen in de overeenkomstige verhouding (premature babymelkpoeder: geitenmelkpoeder = 2:1).
OPMERKING: De uiteindelijke voedingssamenstellingen van formulemelk12 zijn weergegeven in tabel 1. - LPS-oplossing (2,5 mg/ml)
- Los in totaal 10 mg LPS-poeder op in 4 ml gesteriliseerd dubbel gedestilleerd water, meng goed en bewaar in een koelkast bij -20 °C na aliquotering.
OPMERKING: De LPS-oplossing wordt in het donker bewaard bij 2-8 °C voor onmiddellijk gebruik of bij -20 °C voor langdurige opslag.
- Los in totaal 10 mg LPS-poeder op in 4 ml gesteriliseerd dubbel gedestilleerd water, meng goed en bewaar in een koelkast bij -20 °C na aliquotering.
2. Induceer necrotiserende enterocolitis bij neonatale BALB/c muizen
- Voer de neonatale muizen.
- Houd de neonatale muizen in dezelfde kooi als de moeder, verpleegd door de moeder op dag 0-4.
- In de nacht van dag 4 (wanneer de neonatale muizen 2,5-3 g wegen), scheidt u de neonatale muizen in de NEC-groep van de moeder om NEC te induceren, houdt u ze in een dierenincubator en voedt u ze met formule. De Cont. groep mag echter bij de dam blijven en gevoed worden door de dam.
OPMERKING: Neonatale muizen die van de moeder zijn gescheiden, moeten in een couveuse worden grootgebracht vanwege hun zwakke lichaamstemperatuurregulatie.
- Bereid de gavagebuis voor door deze gedurende 1-2 minuten in 75% alcoholcontainers te weken en was ze twee keer in schoon, dubbel gedestilleerd water.
OPMERKING: Om kruisbesmetting tussen de muizen te voorkomen, moet het bovenstaande proces worden uitgevoerd na het voeren van elke muis. - Induceer het NEC-model.
- Neem de neonatale muizen van de dam op dag 4 en vast ze voor één nacht.
- Gavage de muizen met LPS (20-30 μL per keer) en voed ze met formule op dag 5 (40-50 μL per keer).
- Vanaf dag 5 onderwerpen de muizen twee keer per dag gedurende 5 dagen aan een hypoxie-reoxygenatie-koude-shockcyclus. Plaats de muizen in een hypoxie-apparaat op 5% O2 gedurende 90 s en reoxygeneer ze gedurende 3 minuten; herhaal dit proces vijf keer. Plaats de muizen vervolgens gedurende 15 minuten in een omgeving van 4 °C en breng ze vervolgens over naar een incubator. Zie figuur 1A,B voor het inductieproces.
OPMERKING: Een cyclus van hypoxie-reoxygenatie-koude stimulatie werd eenmaal in de ochtend en eenmaal in de middag uitgevoerd. In de container werd een mengsel van 5% O2 met 95% N2 bereid en de concentratie werd gemeten met een zuurstofdetector.
- Observeer alle muizen nauwkeurig, weeg ze elke dag, registreer de overleving van de muizen tijdens de inductieperiode en noteer de ontlastingskenmerken (met of zonder kleverige ontlasting / bloederige ontlasting).
OPMERKING: Het gevestigde NEC-model duurt 5 dagen. - Op dag 10 of eerder, wanneer de muizen NEC-symptomen vertonen (ileus, hematochezie, diarree)13, euthanaseer de muizen door inhalatie-anesthesie met isofluraan en verzamel vervolgens onmiddellijk het darmweefsel. Verzamel geen weefsels van de muizen die spontaan stierven.
OPMERKING: In deze studie werd het eindpunt van muiseutthenasie aangepast wanneer de muis hematochezie en cyanose van het hele lichaam vertoonde.
3. Gavage de muis
- Bevestig de muiskop en houd de maagsonde in de rechterhand. Plaats de maagsonde vanuit de linkerhoek van de mond van de muis.
OPMERKING: Het hoofd werd met de wijsvinger op het hoofd van de muis bevestigd en zachtjes naar achteren en naar beneden gedrukt om te voorkomen dat de muis tijdens de operatie naar voren buigt en het inbrengen van de maagsonde beïnvloedt. - Beweeg de buis langzaam naar het midden van de mond. Na het inbrengen van de buis ongeveer 2-3 cm, duw 40-50 μL formule of 20-30 μL LPS in het spijsverteringskanaal. Zie figuur 2A,B voor de maagsonde.
OPMERKING: Onder normale omstandigheden wordt de maagsonde soepel in het spijsverteringskanaal ingebracht. Als de muis een sterke braakreflex heeft, is de maagsonde per ongeluk in de luchtpijp ingebracht. De maagsonde moet voorzichtig worden uitgetrokken en de muis moet een tijdje rusten voordat hij opnieuw probeert te plassen. Bovendien wordt de maagsondeprocedure gebruikt om het model van NEC te induceren voorafgaand aan euthanasie van muizen.
4. Verzamel verse darmweefselmonsters voor hematoxyline en eosine (H & E) kleuring
- Dompel het verse ileumweefsel van de muis gedurende 24 uur onder in 10% formaline.
- Sluit de weefsels in paraffine in en snijd ze in secties van 4 μm.
- Deparaffiniseer de secties in xyleen en rehydrateer ze achtereenvolgens in absolute ethanol, 95% ethanol, 80% ethanol, 70% ethanol en gedestilleerd water, waarbij ze in elke stap 5 minuten worden geweekt. Kleur de secties gedurende 5 minuten met hematoxyline-oplossing en onderscheid ze in 1% zoutzuur in 75% alcohol gedurende 5 s. Kleur ze ten slotte gedurende 1 minuut met eosine-oplossing.
OPMERKING: Na kleuring met hematoxyline-oplossing moet het worden gedifferentieerd met 1% zoutzuur in ethanol om overmatig gebonden hematoxyline-oplossing en cytoplasmatische hematoxylinekleurstof te verwijderen. De concentratie van 1% zoutzuur is geschikt voor darmweefsel. - Onderzoek de histopathologie van het darmweefsel bij 40x vergroting.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het BALB/c muis NEC-model werd geïnduceerd door kunstvoeding, LPS-voeding, hypoxie en koudestimulatie. Tijdens de inductieperiode werden de muizen geobserveerd op darmpathologie, ontlastingskenmerken, veranderingen in lichaamsgewicht en dagelijkse overleving. Representatieve beelden van de dunne darm tijdens NEC-inductie; de getallen op de foto vertegenwoordigen de intestinale pathologiescore van 0 (normaal epitheel) tot 4 (de ernstigste) (figuur 3A). De intestinale pathologiescore was signi...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
NEC is de meest voorkomende gastro-intestinale systeem noodsituatie voor pasgeborenen, met een hoge incidentie en mortaliteit, vooral bij premature baby's1,2,3. De pathogenese is echter nog steeds onduidelijk. Er wordt momenteel aangenomen dat mucosale schade, pathogene invasie en enterale voeding risicofactoren zijn voor NEC3. Tot op heden zijn de dieren die voor het NEC-model worden gebruikt voornamelij...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs bedanken de Clinical Biological Resource Bank van Guangzhou Women and Children's Medical Center voor het verstrekken van het klinische monster en Guangzhou Forevergen Biosciences Laboratory Animal Center voor het leveren van muizen. Dit onderzoek werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China grant 81770510 (R.Z.).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Absolute ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD. | 100092683 | |
| Geitenmelkpoeder | Petag | 71795558417 | |
| HE kleurstofoplossing | Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD. | G1003 | |
| Isofluraan | RWD, Shenzhen Reward Life Technology Co., LTD. | R510 | |
| LPS | Sigma-Adrich | L2880 | |
| Medische zuurstof | verscheidene | verscheidene | |
| Microscoop | NIKON | NIKON beeldvormingssysteem (DS-Ri2) | |
| Neutrale hars | Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD. | 10004160 | |
| Paraffine | verscheidene | verscheidene | |
| Premature babymelkpoeder | Abbott | 57430 | |
| XYleen | Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD. | 10023418 | |
| 1% Zoutzuuroplossing | verscheidene | verscheidene | |
| 10% Formaline | LEAGENE | DF0110 |
Referenties
- Horbar, J. D., et al. Mortality and neonatal morbidity among infants 501 to 1500 grams from 2000 to 2009. Pediatrics. 129 (6), 1019-1026 (2012).
- Stoll, B. J., et al. Neonatal outcomes of extremely preterm infants from the NICHD Neonatal Research Network. Pediatrics. 126 (3), 443-456 (2010).
- Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. New England Journal of Medicine. 364 (3), 255-264 (2011).
- Sangild, P. T., et al. Invited Review: The preterm pig as a model in pediatric gastroenterology. Journal of Animal Science. 91 (10), 4713-4729 (2013).
- Cancro, M. P., Sigal, N. H., Klinman, N. R. Differential expression of an equivalent clonotype among BALB/c and C57BL/6 mice. Journal of Experimental Medicine. 147 (1), 1-12 (1978).
- Kuroda, E., Yamashita, U. Mechanisms of enhanced macrophage-mediated prostaglandin E2 production and its suppressive role in Th1 activation in Th2-dominant BALB/c mice. Journal of Immunology. 170 (2), 757-764 (2003).
- Fornefett, J., et al. Comparative analysis of clinics, pathologies and immune responses in BALB/c and C57BL/6 mice infected with Streptobacillus moniliformis. Microbes and Infection. 20 (2), 101-110 (2018).
- Rosas, L. E., et al. Genetic background influences immune responses and disease outcome of cutaneous L. mexicana infection in mice. International Immunology. 17 (10), 1347-1357 (2005).
- Sproat, T., Payne, R. P., Embleton, N. D., Berrington, J., Hambleton, S. T cells in preterm infants and the influence of milk diet. Frontiers in Immunology. 11, 1035(2020).
- Nanthakumar, N., et al. The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: an immature innate immune response. PLoS One. 6 (3), 17776(2011).
- Afrazi, A., et al. New insights into the pathogenesis and treatment of necrotizing enterocolitis: Toll-like receptors and beyond. Pediatric Research. 69 (3), 183-188 (2011).
- Auestad, N., Korsak, R. A., Bergstrom, J. D., Edmond, J. Milk-substitutes comparable to rat's milk; their preparation, composition and impact on development and metabolism in the artificially reared rat. British Journal of Nutrition. 61 (3), 495-518 (1989).
- Liu, Y., et al. Lactoferrin-induced myeloid-derived suppressor cell therapy attenuates pathologic inflammatory conditions in newborn mice. Journal of Clinical Investigation. 129 (10), 4261-4275 (2019).
- MohanKumar, K., et al. A murine neonatal model of necrotizing enterocolitis caused by anemia and red blood cell transfusions. Nature Communications. 10 (1), 3494(2019).
- He, Y. M., et al. Transitory presence of myeloid-derived suppressor cells in neonates is critical for control of inflammation. Nature Medicine. 24 (2), 224-231 (2018).
- Cho, S. X., et al. Characterization of the pathoimmunology of necrotizing enterocolitis reveals novel therapeutic opportunities. Nature Communications. 11 (1), 5794(2020).
- Halpern, M. D., et al. Decreased development of necrotizing enterocolitis in IL-18-deficient mice. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 294 (1), 20-26 (2007).
- Wu, N., et al. MAP3K2-regulated intestinal stromal cells define a distinct stem cell niche. Nature. 592 (7855), 606-610 (2021).
- Nino, D. F., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. Necrotizing enterocolitis: new insights into pathogenesis and mechanisms. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 13 (10), 590-600 (2016).
- Chuang, S. L., et al. Cow's milk protein-specific T-helper type I/II cytokine responses in infants with necrotizing enterocolitis. Pediatric Allergy & Immunology. 20 (1), 45-52 (2009).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Erratum
Formal Correction: Erratum: A Neonatal BALB/c Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis
Posted by JoVE Editors on 3/07/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: A Neonatal BALB/c Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis. The Representative Results section was updated.
Figure 1 was updated from:
Figure 1: Induction of the BALB/c NEC model process. (A) The mice in the NEC group were separated from the dam at birth until they were 4 days old (on Day 4) and fasted that night. The NEC model was induced from Day 5 onwards after birth and lasted for 5 days. Intestinal tissue specimens were collected on Day 10 or earlier. The mice in the Cont. group were housed with and nursed by the dam. (B) The sequence of operations for each day after inducing the NEC model. Abbreviations: Cont. = control; NEC = necrotizing enterocolitis; LPS = lipopolysaccharide. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 1: Induction of the BALB/c NEC model process. (A) The mice in the NEC group were separated from the dam at birth until they were 4 days old (on Day 4) and fasted that night. The NEC model was induced from Day 5 onwards after birth and lasted for 5 days. Intestinal tissue specimens were collected on Day 10 or earlier. The mice in the Cont. group were housed with and nursed by the dam. (B) The sequence of operations for each day after inducing the NEC model. Abbreviations: Cont. = control; NEC = necrotizing enterocolitis; LPS = lipopolysaccharide. Please click here to view a larger version of this figure.
