Methodenartikel

Bacteriële expressie en zuivering van humane matrix metalloproteinase-3 met behulp van affiniteitschromatografie

DOI:

10.3791/63263

⸱

30 maart 2022

 ,  , 
1Department of Chemical & Materials Engineering, University of Nevada, Reno

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

His-tag zuivering, dialyse en activering worden gebruikt om de opbrengst van oplosbare, actieve matrix metalloproteinase-3 katalytische domein eiwitexpressie in bacteriën te verhogen. Eiwitfracties worden geanalyseerd via SDS-PAGE gels.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Matrix metalloproteinases (MMP's) behoren tot de familie van metzincineproteasen met centrale rollen in extracellulaire matrix (ECM) afbraak en remodellering, evenals interacties met verschillende groeifactoren en cytokines. Overexpressie van specifieke MMP's is verantwoordelijk voor verschillende ziekten zoals kanker, neurodegeneratieve ziekten en hart- en vaatziekten. MMP's zijn onlangs het middelpunt van de aandacht geweest als doelwitten om therapeutica te ontwikkelen die ziekten kunnen behandelen die gecorreleerd zijn aan MMP-overexpressie.

Om het MMP-mechanisme in oplossing te bestuderen, zijn meer gemakkelijke en robuuste recombinante eiwitexpressie- en zuiveringsmethoden nodig voor de productie van actieve, oplosbare MMP's. Het katalytische domein van de meeste MMP's kan echter niet worden uitgedrukt in Escherichia coli (E. coli) in oplosbare vorm vanwege een gebrek aan posttranslationele machines, terwijl zoogdierexpressiesystemen meestal duur zijn en lagere opbrengsten hebben. MMP-inclusielichamen moeten het vervelende en moeizame proces van uitgebreide zuivering en hervouwen ondergaan, waardoor de opbrengst van MMP's in inheemse conformatie aanzienlijk wordt verminderd. Dit artikel presenteert een protocol met behulp van Rosetta2(DE3)pLysS (hierna R2DP) cellen om matrix metalloproteinase-3 katalytisch domein (MMP-3cd) te produceren, dat een N-terminale His-tag bevat gevolgd door pro-domein (Hisx6-pro-MMP-3cd) voor gebruik in affiniteitszuivering. R2DP-cellen verbeteren de expressie van eukaryote eiwitten door middel van een chlooramfenicol-resistent plasmide met codons die normaal zeldzaam zijn in bacteriële expressiesystemen. Vergeleken met de traditionele cellijn bij uitstek voor recombinante eiwitexpressie, BL21 (DE3), verbeterde zuivering met behulp van deze nieuwe stam de opbrengst van gezuiverde Hisx6-pro-MMP-3cd. Na activering en ontzouting wordt het pro-domein samen met de N-terminal His-tag gesplitst, waardoor actieve MMP-3cd wordt geleverd voor onmiddellijk gebruik in talloze in vitro toepassingen. Deze methode vereist geen dure apparatuur of complexe fusie-eiwitten en beschrijft de snelle productie van recombinante menselijke MMP's in bacteriën.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De meeste complexe eukaryote eiwitten ondergaan uitgebreide posttranslationele modificaties na expressie, waarbij zeer geassisteerde eiwitvouwing en co-factoren functioneel moeten zijn1. Het produceren van grote hoeveelheden oplosbaar menselijk eiwit in een bacteriële gastheer blijft een aanzienlijke uitdaging vanwege de hoge kosten en het gebrek aan robuuste expressie- en zuiveringsmethoden, zelfs voor kleinschaligere laboratoriumexperimenten2,3. MMP's, menselijke endopeptidasen met een groot molecuulgewicht, worden gewoonlijk uitgedrukt als onoplosbare inclusielichamen wanneer ze worden uitgedrukt in E. coli. Extractie van oplosbare menselijke MMP's leidt vaak tot een moeizaam, tijdrovend oplos- en hervouwproces4.

MMP's spelen een cruciale rol in zowel fysiologische als pathogene processen. Menselijke MMP's zijn een familie van 23 zink endopeptidasen, gecategoriseerd naar structuur en substraatspecificiteit, en differentieel uitgedrukt ondanks een sterk geconserveerd katalytisch domein5,6. MMP's worden uitgescheiden als inactieve zymogenen, gereguleerd via posttranslationele activering en hun endogene remmers, weefselremmers van metalloproteinasen (TIMPs)7,8,9,10. Hoewel aanvankelijk erkend voor hun rol in ecm-omzet, zijn MMP's ook betrokken geweest bij ontwikkeling, morfogenese, weefselherstel en remodellering8. Ontregeling van MMP's is met name in verband gebracht met kanker, samen met neurodegeneratieve, cardiovasculaire en fibrotische ziekten, naast andere ziekten5,7.

De ontwikkeling van robuuste grootschalige MMP-productiemethoden is van cruciaal belang om het succes van toekomstige studies van MMP-mechanismen door middel van biochemische en celgebaseerde assays te garanderen. Verschillende MMP's zijn eerder tot expressie gebracht in bacteriën11, waaronder Hisx6-gelabelde MMP's, zonder de MMP-activiteit12,13,14,15 te veranderen. Deze methoden omvatten echter vervelende, lange stappen die moeilijk te repliceren kunnen zijn.

Zoogdiercellen kunnen ook worden gebruikt om veel verschillende menselijke eiwitten tot expressie te brengen en tegelijkertijd de juiste posttranslationele modificaties te garanderen16. Hoewel het expressiesysteem van zoogdieren een ideale keuze is om recombinante menselijke eiwitten te produceren met de juiste posttranslationele modificaties, zijn de belangrijkste nadelen van deze methode aanvankelijk lage opbrengsten, dure groeimedia en reagentia, lange tijdlijnen om stabiele expressielijnen te bereiken en het risico op besmetting met andere soorten zoals schimmels of bacteriën2,11 . Bovendien levert MMP-productie in cellijnen van zoogdieren onzuiverheden op van geassocieerde cellulaire eiwitten zoals TIMPs of fibronectines11. In tegenstelling tot de langzame celgroei die wordt waargenomen in zoogdiercellen, biedt het bacteriële expressiesysteem grootschalige eiwitproductie in een korte periode, samen met eenvoudigere media en groeivereisten. Vanwege het gebrek aan andere geassocieerde cellulaire eiwitten (d.w.z. TIMPs) in bacteriële expressiesystemen, zijn actieve MMP's in hogere concentraties echter onderhevig aan afbraak door autoproteolyse, wat resulteert in een slechte MMP-opbrengst17.

Dit artikel beschrijft een gedetailleerde methode voor bacteriële expressie, zuivering en activering van recombinant Hisx6-pro-MMP-3cd met behulp van E. coli als expressiegastheer vanwege de betaalbaarheid, eenvoud en het succes bij het produceren van hogere opbrengsten van MMP's2,3,18. Aangezien E. coli de eiwitvouwingsmachines en posttranslationele verwerking mist die nodig zijn voor recombinante MMP's en andere complexe eiwitten, zijn veel E. coli-stammen ontworpen om deze beperkingen te overwinnen, waardoor E. coli een geschiktere gastheer is voor expressie van recombinant humaan MMP-3cd,19,20 . De R2DP-stam die in deze studie wordt gebruikt, verbetert bijvoorbeeld de eukaryote expressie door een chlooramfenicol-resistent plasmide te leveren dat codons bevat die zelden worden gebruikt in E. coli.

Zoals beschreven in dit protocol, worden hisx6-pro-MMP-3 katalytische domein (MMP-3cd) eiwitten geëxtraheerd en gedenatureerd4 na overexpressie van relatief zuivere inclusielichamen van de pET-3a-vector (figuur 1) in R2DP-cellen. Hisx6-pro-MMP-3cd3,19 werd gezuiverd met behulp van affiniteitstagchromatografie. Bij hervouwen en dialyse werd de pro-MMP-3cd (zymogeen) geactiveerd door 4-aminofenylkwikacetaat (APMA) en SDS-PAGE-analyse wordt gebruikt om de opbrengsten en de noodzaak van verdere zuivering te evalueren5,21. Dit protocol beschrijft expressie, zuivering en activering van oplosbare MMP-3cd als voorbeeld. Het kan echter ook worden gebruikt als leidraad voor de expressie van andere MMP's en menselijke proteasen met vergelijkbare expressie en activeringsmechanismen (figuur 2). Voor andere eiwitten dan MMP-3cd wordt de lezer geadviseerd om optimale buffersamenstellingen en methoden voor hun doeleiwit te bepalen voordat dit protocol wordt geprobeerd.

figure-introduction-1
Figuur 1: Plasmidekaart van het pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd plasmide. De pET-3a vector bevat een ampicilline resistentie gen. Een N-terminal Hisx6-tag-sequentie wordt gekloond in de pET-3a-gebaseerde vector, inclusief pro-MMP-3cd, om de pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd-constructie onder controle van T7-promotor tussen BamHI- en NdeI-beperkingslocaties te verkrijgen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-introduction-2
Figuur 2: Bacteriële expressie van pro-MMP-3cd, zuivering, hervouwen en activering. 1.1: pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd plasmide werd omgezet in BL21(DE3) of R2DP Cellen. 1.2: Pro-MMP-3cd eiwitexpressie werd geïnduceerd met behulp van IPTG. 1.3: Chemische lysis en ultrasoonapparaat worden gebruikt om Hisx6-pro-MMP-3cd-eiwitten te extraheren die voornamelijk onoplosbaar zijn en worden aangetroffen in de inclusielichamen. Ureum werd gebruikt om eiwitten uit inclusielichamen te denatureren en op te lossen. 2.1. Gedenatureerd Hisx6-pro-MMP-3cd eiwit werd gezuiverd via affiniteitschromatografiezuivering. 3. De geëlueerde Hisx6-pro-MMP-3cd werd langzaam opnieuw gevouwen tijdens dialyse door geleidelijke verwijdering van ureum uit de buffer. 4. Ten slotte werd het opnieuw gevouwen MMP-3cd-eiwit geactiveerd met APMA door het N-terminale pro-peptidedomein te verwijderen. APMA wordt later uit de oplossing verwijderd door ontzouting. De nummers komen overeen met protocolsecties waarin deze stappen worden beschreven. Afkortingen: MMP-3cd = Matrix metalloproteinase-3 catalytic domain; APMA = 4-aminofenylkwikacetaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. MMP-expressie

  1. Klonen en transformatie van pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd in R2DP-cellen
    1. Verteer het pET-3a plasmide (zie de Tabel van Materialen) met NdeI en BamHI restrictie-enzymen in Digest Buffer (zie de Tabel met Materialen). Voeg in een totaal reactievolume van 40 μL 4 μL Digest Buffer, 33 μL 100 ng/μL plasmide en 1,5 μL van elk restrictie-enzym toe en laat de reactie ~2 uur duren totdat deze bij 37 °C is voltooid.
    2. Voer een PCR-reactie uit op de MMP-3cd-reeks om een N-terminal His-tag in te voegen. Gebruik 25 μL PCR Mix (zie de tabel met materialen), 2,5 μL van 10 μM primers (aanvullende figuur S1) en 1,25 μL van de 100 ng/μL insertsequentie. Voeg steriel water toe aan een eindreactievolume van 50 μL.
    3. Voer het PCR-product en de verteerde vector uit op een 1% agarose-gel. Zuiver de gelbanden met behulp van een Gel Recovery Kit (zie de tabel met materialen) volgens het protocol van de fabrikant.
    4. Kloon het versterkte PCR-product in de verteerde vector tussen de NdeI- en BamHI-restrictieplaatsen met behulp van DNA Assembly Mix (zie de tabel met materialen). Gebruik online tools om het vereiste volume van de insert en snijvector te bepalen voor een totaal reactievolume van 15 μL.
    5. Ontdooi een aliquot van 50 μL cellen met een hoogtransformatie-efficiëntie (zie de tabel met materialen) op ijs totdat het ontdooid is. Prewarm SOC Growth Medium (zie de tabel met materialen) tot 37 °C en LB-ampicilline (LB Amp) platen (zie de tabel met materialen).
    6. Voeg 1-2 μL van de pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd assemblagereactie toe aan de 50 μL aliquot. Incubeer op ijs gedurende 30 min.
    7. Hitteschok de cellen door te broeden bij 42 °C gedurende 30 s. Incubeer op ijs gedurende 2 min.
    8. Voeg 950 μL SOC-groeimedium toe aan elk transformatormengsel. Schud gedurende 1 uur bij 250 tpm en 37 °C.
    9. Plaat 100 μL van de transformanten op LB Amp platen en incubeer 's nachts bij 37 °C.
    10. Ent elke geïsoleerde kolonie in 10 ml LB Amp medium. Schud een nacht bij 250 rpm en 37 °C.
    11. Extract plasmide DNA per protocol van de fabrikant voor de miniprep kit (zie de tabel met materialen). Bevestig de volgorde van de constructie met behulp van T7 voorwaartse en omgekeerde primers (aanvullende figuur S1).
      OPMERKING: Het pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd construct DNA kan worden opgeslagen bij -20 °C. Als u klaar bent, gaat u verder met de transformatie in R2DP-cellen.
    12. Ontdooi één aliquot van 20 μL R2DP-cellen (zie de tabel met materialen) op ijs gedurende 2-5 minuten. Voorwarm SOC groeimedium tot kamertemperatuur en LB Amp CamR platen tot 37 °C (zie de Tabel met Materialen).
    13. Voeg 1 μL van 100 ng/μL sequentie-bevestigde pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd toe aan de 50 μL aliquot. Roer voorzichtig om te mengen en breng de buis terug naar ijs.
    14. Incubeer de buis op ijs gedurende 5 min.
    15. Hitteschok de cellen door te broeden bij 42 °C gedurende precies 30 s. Niet schudden.
    16. Leg de cellen 2 min.
    17. Voeg 80 μL SOC-medium bij kamertemperatuur toe aan het mengsel van de transformator. Schud gedurende 1 uur bij 250 tpm en 37 °C.
    18. Plaats de transformatoren op LB Amp CamR-platen en incubeer een nacht bij 37 °C.
  2. Groei en inductie
    1. Ent een enkele, geïsoleerde kolonie R2DP pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd-transformator uit een LB Amp CamR-plaat in 10 ml LB Amp CamR-media bij 37 °C. Schud 's nachts bij 250 tpm (~ 16 uur). Bewaar aliquots van elke cultuur en bereid 40% (v / v) glycerol (zie de tabel met materialen) indien gewenst.
    2. Ent per nachtkweek een kolf van 1 L met 500 ml LB Amp CamR-medium tot een optische dichtheid bij 600 nm (OD600) van 0,05-0,1.
      OPMERKING: Dit zou de cellen moeten terugbrengen naar logaritmische groei.
    3. Meet de OD600 op verschillende tijdstippen, meestal gedurende 3-4 uur, totdat deze tussen 0,4 en 0,6 valt.
    4. Vóór inductie aliquoteert u een fractie van de cultuur in een microfugebuis van 1,5 ml (zie de tabel met materialen) en labelt u deze als niet-geïnduceerde fractie. Bewaar het bij -80 °C voor gelanalyse. Als u geen SDS-PAGE-gel gebruikt, slaat u deze stap over en gaat u verder met stap 1.2.5.
    5. Induceer de culturen tot een eindconcentratie van 1 mM met behulp van 1 M isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) voorraad (zie de tabel met materialen). Blijf incuberen in de 37 °C shaker voor nog eens 3-4 uur.
      OPMERKING: Tijdens de expressie moet de lezer de optimale OD600 bepalen op het moment van inductie en de IPTG-concentratie. Als de opbrengst na zuivering aanzienlijk daalt, moet de imidazoolconcentratie in zuiveringsbuffers mogelijk worden aangepast of moet de celpellet mogelijk verder worden gesoniseerd.
    6. Voordat de culturen worden gecentrifugeerd, aliquoteert u een fractie van de cultuur in een tweede 1,5 ml microfugebuis en labelt u deze geïnduceerde fractie. Bewaar het bij -80 °C voor gelanalyse. Als u geen SDS-PAGE-gel gebruikt, slaat u deze stap over en gaat u verder met stap 1.2.7.
    7. Centrifugeer de celcultuur in conische flessen van 250 ml (zie de tabel met materialen) met maximale snelheid en 4 °C gedurende 10 minuten.
    8. Herhaal stap 1.2.7 totdat de culturen volledig zijn gepelletiseerd.
      OPMERKING: PAUZE: Celkorrels kunnen worden ingevroren bij -80 °C en later worden ontdooid voor verdere verwerking. Sla anders deze stap over en ga verder met stap 1.3.1.
  3. Inclusief lichaamsextractie en oplosbaarheid
    OPMERKING: Bereid vers 10 M ureum, bij voorkeur niet eerder dan een dag van tevoren, grondig roerend tot het volledig is opgelost. Verwarm of autoclaaf ureum niet; bewaar het bij kamertemperatuur.
    1. Resuspend de pellet (vanaf stap 1.2.8) in lysisbuffer (zie de tabel met materialen). Voeg per gram pellet 3 ml lysisbuffer toe en resuspend door vortexing of pipetteren. Schud een nacht bij 4 °C.
    2. Voeg 1,25 ml 10% (w/v) natriumdeoxycholaat (zie de tabel met materialen) toe per 1 l cultuur. Schud bij kamertemperatuur gedurende 30 min bij 150 rpm.
    3. Voeg 10 μL DNase I (zie de tabel met materialen) toe per 1 l cultuur. Schud bij kamertemperatuur gedurende 30 min bij 150 rpm.
    4. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 13.000 × g en 4 °C.
    5. Zet een fractie van Lysed MMP opzij voor gelanalyse. Bewaren bij -80 °C. Als u geen gelanalyse uitvoert, gaat u verder met stap 1.3.6.
      OPMERKING: Na het centrifugeren kan de pellet draadachtig zijn en niet compact verpakt, waardoor het riskant is om het supernatant weg te gooien. Als dit het geval is, slaat u stap 1.3.6 over en gaat u verder met stap 1.3.7.
    6. Gooi het supernatant uit de gecentrifugeerde monsters.
      OPMERKING: Het protocol kan op dit punt worden gepauzeerd en de celkorrels worden ingevroren bij -80 °C en later worden ontdooid. Sla anders deze stap over en ga verder met stap 1.3.7.
    7. Resuspend de pellet in 100 ml/l cultuur van inclusielichaambuffer (zie de tabel met materialen) door op en neer te pipetteren.
    8. Houd tijdens het ultrasoonapparaat de monsters op ijs om oververhitting te voorkomen. Soniceer elk monster gedurende 6 cycli van 15 s, output 5 en 50% puls. Houd rekening met 15 s rusttijden voor afkoeling tussen de cycli.
      OPMERKING: Breng indien nodig de monsters over in conische buizen van 50 ml voor verdere centrifugering (zie de tabel met materialen). Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 13.000 × g en 4 °C.
    9. Zet een fractie sonicated MMP opzij voor gelanalyse. Bewaren bij -80 °C. Als u geen gelanalyse uitvoert, gaat u verder met stap 1.3.11.
    10. Controleer de pellet. Als u stringy bent, herhaalt u stap 1.3.8-1.3.10. Als de pellet compact is, gooit u het supernatant weg en gaat u verder met stap 1.3.12.
      OPMERKING: Sonicatie in Inclusion Body Buffer kan worden herhaald om meer eiwitten uit het gelyseerde celafval te herstellen. Te veel ultrasoonapparaat kan echter scheren veroorzaken, wat de MMP-opbrengst schaadt. Het protocol kan in dit stadium worden gepauzeerd en de celkorrels kunnen worden ingevroren bij -80 °C en later worden ontdooid.
    11. Resuspend elke pellet uit een 1 L-cultuur in 5 ml oplosbaarheidsbuffer (zie de tabel met materialen) door pipetteren. Incubeer minstens 30 minuten op ijs om de eiwitten te laten oplossen.
    12. Zet een fractie van Solubilized MMP opzij voor gelanalyse. Bewaren bij -80 °C. Als u geen gelanalyse uitvoert, gaat u verder met stap 1.3.14.
    13. Centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten bij 13.000 × g en 4 °C. GOOI HET SUPERNATANT NIET WEG.
    14. Als zich na centrifugeren een pellet vormt/blijft, giet het supernatant dan in een aparte conische buis van 50 ml. Resuspend de pellet in nog eens 5 ml oplosbuffer (per 1 l cultuur) door op en neer te pipetteren.
    15. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 13.000 × g en 4 °C. GOOI HET SUPERNATANT NIET WEG.
    16. Herhaal de stappen 1.3.13 en 1.3.14 totdat er na het centrifugeren weinig tot geen pellet ontstaat of er alleen grijs neerslag overblijft. Pool de supernatants. Gooi de pellet weg of bewaar deze bij -80 °C voor extra ultrasoonapparaat.

2. MMP zuivering en hervouwen

  1. His-tag (HT) affiniteitszuivering
    1. Vul volgens het protocol van de fabrikant een zwaartekrachtstroomkolom (zie de tabel met materialen) met goed gemengde Ni-NTA-hars (zie de tabel met materialen). Laat de hars bezinken en scheiden van de opslagbuffer, zodat er een duidelijke lijn ontstaat tussen de twee lagen.
      OPMERKING: Laat de hars nooit drogen, omdat lucht de hars zal binnendringen en de eiwitopbrengst zal schaden. Voer tussen het gebruik door de in punt 2.2 beschreven harsregeneratieprocedure uit.
    2. Laat de opslagbuffer leeglopen. Vul de kolom met twee harsbedvolumes HT Equilibration Buffer.
    3. Giet de HT Equilibration Buffer af en gooi weg. Terwijl de kolom leegloopt, centrifugeer je het eiwitextract gedurende 1 minuut op 13.000 × g en filtersteriliseer je met een filter van 0,22 μm (zie de tabel met materialen).
    4. Verwissel de afvalcontainer voor een conische buis van 50 ml met het label HT Flowthrough. Voeg het bereide eiwitextract toe aan de kolom.
    5. Pas de flowthrough opnieuw toe om de binding te maximaliseren.
    6. Zet een fractie van flowthrough fraction opzij voor gelanalyse. Bewaren bij -80 °C. Als u geen gelanalyse uitvoert, gaat u verder met stap 2.1.7.
    7. Was de hars onmiddellijk met 15 ml HT-wasbuffer (zie de tabel met materialen). Verzamel de doorstroming in 15 ml conische buizen (zie de tabel met materialen) met het label HT Wash.
      OPMERKING: Absorptiewaarden bij 280 nm (A280) werden verkregen via spectrofotometrie en gebruikt samen met het molecuulgewicht en de extinctiecoëfficiënt, ε, om eiwitconcentraties te schatten. Voor gedenatureerde Hisx6-pro-MMP-3cd is het molecuulgewicht 29,86 kDa en ε 34,38 M-1 cm-1.
    8. Blanking tegen HT Wash Buffer, meet en registreer de A280. Herhaal stap 2.1.7 en 2.1.8 met extra wasfracties. Zodra de A280 de basislijn nadert en onzuiverheden zijn geminimaliseerd, gaat u verder met stap 2.1.9.
    9. Zet een fractie van wash fraction opzij voor gelanalyse. Herhaal dit voor meerdere wasfracties. Bewaar de fracties bij -80 °C. Als u geen gelanalyse uitvoert, gaat u verder met stap 2.1.10.
    10. Eluteer onmiddellijk His-tagged eiwitten door 5 ml HT Elution Buffer toe te voegen (zie de tabel met materialen). Verzamel de doorstroming als 0,5-1 ml fracties in microfugebuizen met het label HT Elution.
    11. Zet een fractie van de elutiedractie opzij voor gelanalyse. Herhaal dit voor meerdere elutiedracties. Bewaar de fracties bij -80 °C. Als u geen gelanalyse uitvoert, gaat u verder met stap 2.1.12.
    12. Als de A280 >0,3 mg/ml is, verdunt u de fractie met HT Equilibration Buffer (zie de tabel met materialen).
      OPMERKING: De geëlueerde fractie moet worden verdund tot een A280 van 0,3 mg / ml of minder om neerslag tijdens dialyse te voorkomen. Het protocol kan hier worden gepauzeerd en de gepoolde fracties worden ingevroren bij -80 °C en later ontdooid. Sla anders deze stap over en ga verder met stap 2.2.1.
  2. Harsregeneratie
    1. Was de hars met tien harsbedvolumes HT Regeneration Buffer (zie de tabel met materialen) en tien harsbedvolumes steriel water.
    2. Bewaar de hars als 50% drijfmest in 20% (v/v) ethanol in water.

3. Eiwit hervouwen

OPMERKING: Voor kleinere volumes kunnen dialysecassettes worden gebruikt met een lager risico op monsterverlies. Dialysebuizen zijn vereist als grotere volumes worden gebruikt (zie de tabel met materialen).

  1. Dialyse
    OPMERKING: De optimale eiwitconcentratie voor dialyse is ~ 0,3 mg / ml. Als er significante neerslag optreedt tijdens dialyse, verlaag dan de ureumconcentratiegradiënt tussen elke dialyse met behulp van een stapsgewijze dialysemethode en voeg meer tussenstappen toe (bijvoorbeeld van 6 M tot 5 M en vervolgens 5 M tot 4 M, in plaats van de 5 M-fase over te slaan). Omdat vries-dooicycli de cellulaire en eiwitstructuur beschadigen, is het van vitaal belang om pauzes in het protocol te minimaliseren.
    1. Gebruik volgens het protocol van de fabrikant de juiste hoeveelheid dialysebuizen volgens het volume van de Elution Fraction-monsters .
    2. Dompel de geëlueerde MMP-fracties onder in dialysebuizen in 1 L dialysebuffer 1 (zie de tabel met materialen). Roer de slang en de inhoud ervan op een magneetroerder gedurende ten minste 8 uur bij 4 °C.
    3. Breng over op 1 L dialysebuffer 2 (zie de tabel met materialen). Roer de slang en de inhoud ervan op een magneetroerder gedurende ten minste 8 uur bij 4 °C.
    4. Breng over naar 1 L dialysebuffer 3 (zie de tabel met materialen). Roer de slang en de inhoud ervan op een magneetroerder gedurende ten minste 8 uur bij 4 °C.
    5. Breng het monster over in nieuwe conische buizen van 50 ml en label ze als gedialyseerd MMP.
    6. Onderzoek de buis op neerslag. Indien neerslag is gevormd, centrifugeer het monster gedurende 1 minuut bij 13.000 × g en 4 °C.
    7. Breng het supernatant over in nieuwe conische buizen van 15 ml en label ze als revouwen MMP.
    8. Zet een fractie opzij voor gelanalyse en label deze als Refolded MMP. Bewaren bij -80 °C. Als u geen gelanalyse uitvoert, gaat u verder met stap 3.1.9.
      OPMERKING: Als de opbrengst laag is, kan het neerslag worden opgelost in HT Equilibration Buffer en de stappen in rubriek 3.1 worden herhaald met dialysebuizen. Als er geen gelanalyse moet worden uitgevoerd of als het protocol hier moet worden gepauzeerd, vriest u de monsters in bij -80 °C en ontdooit u ze later. Als de opbrengsten binnen het gewenste bereik liggen, gaat u verder met stap 3.2.1.
  2. Herconcentratie
    OPMERKING: De extinctiecoëfficiënten voor hergevouwen en gedenatureerde Hisx6-pro-MMP-3cd zullen naar verwachting hetzelfde zijn; daarom worden A280-berekeningen niet beïnvloed.
    1. Reconcentreer het monster tot 0,5 mg/ml. Gebruik een geroerde cel van 400 ml (zie de tabel met materialen) om het monster te concentreren tot 15 ml. Om schuimvorming te voorkomen, gebruikt u een reconcentiebuis van 50 ml om indien nodig verder te concentreren.
      OPMERKING: Als zich een neerslag vormt, kan deze worden gepelletiseerd en opgelost in HT Equilibration Buffer. Herhaal vervolgens paragraaf 3.1 en stap 3.2.1. Ga anders verder met stap 3.2.2.
    2. Zet een fractie opzij voor gelanalyse en label deze als Geconcentreerd MMP.
      OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd en de monsters worden ingevroren bij -80 °C en later worden ontdooid.

4. Activering

  1. 4-Aminofenylkwik acetaat (APMA) activering
    OPMERKING: APMA is zeer giftig. Maak een verse voorraadoplossing van 20 mM APMA vóór activering en werk altijd onder een zuurkast bij gebruik van APMA. Gooi het APMA-afval weg in de container.
    1. Voeg per 1 ml MMP (1 mg/ml) 50 μL 20 mM APMA (zie de tabel met materialen) toe om een uiteindelijke APMA-concentratie van 1 mM te bereiken. Incubeer 's nachts bij 37 °C.
    2. Als zich een neerslag vormt, centrifugeer het dan met maximale snelheid gedurende 10 minuten bij 4 °C. Bewaar het supernatant in een microfugebuis van 1,5 ml met het label Geactiveerd MMP. Gooi het neerslag weg in een container die is gemarkeerd voor APMA-afval.
    3. Zet een fractie opzij voor gelanalyse en label het geactiveerde MMP.
      OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd en de monsters worden ingevroren bij -80 °C en later worden ontdooid. Als u geen gelanalyse uitvoert, gaat u verder met stap 4.2.1. Na activering zijn het molecuulgewicht en de extinctiecoëfficiënt van MMP-3cd respectievelijk 19,40 kDa en 28,42 M-1 cm-1.
  2. Ontzouten
    1. Verwijder APMA uit het geactiveerde MMP-3cd-monster met een ontzoutingskolom van 2 ml (zie de tabel met materialen), volgens het protocol van de fabrikant.
    2. Zet een fractie opzij voor gelanalyse en label het Ontzout MMP. Bewaren bij -80 °C. Als u geen gelanalyse uitvoert, gaat u verder met rubriek 4.3 met de resterende monsters.
      OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd en de monsters worden ingevroren bij -80 °C en later worden ontdooid.
  3. De SDS-PAGE gels gebruiken
    1. Voer alle eiwitfracties uit op SDS-PAGE-gels: niet-geïnduceerde fractie, geïnduceerde fractie, gelyseerde MMP, gesonificeerde MMP, opgeloste MMP, flowthrough fraction, wasfractie, elutiedractie, gevouwen MMP, geconcentreerd mmp, geactiveerd mmp en ontzout mmp.
  4. Langdurige opslag van MMP-3
    1. Voeg 0,05% (v/v) niet-ionogene oppervlakteactieve stof (zie de tabel met materialen) toe aan de ontzoute MMP-3cd-monsters en bewaar ze bij -80 °C.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bij het uitvoeren van monsters op SDS-PAGE, omdat het eiwit tot expressie wordt gebracht in de vorm van onoplosbare inclusielichamen, moeten de gelyseerde en gesonificeerde fracties weinig tot geen Hisx6-pro-MMP-3cd-extract bevatten, omdat het eiwit nog niet is opgelost in ureum. Figuur 3 vergelijkt de His-tag zuiveringsemissiefracties van Hisx6-pro-MMP-3cd van BL21(DE3)-cellen en R2DP-cellen. Elutiedracties werden afzonderlijk gepoold voor zowel BL21(DE3) als R2DP-cellen vóór dialyse. Fract...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De grootschalige productie van oplosbare, menselijke, recombinante MMP's blijft een uitdagende taak. Zoogdiercellen kunnen functionele MMP's tot expressie brengen tegen hoge kosten en lange wachttijden, terwijl E. coli snel grote hoeveelheden MMP-inclusielichamen produceert die moeten worden gezuiverd en opnieuw moeten worden gevouwen11,16. R2DP-cellen verhogen de opbrengst van MMP-inclusielichamen aanzienlijk, waardoor een kosteneffectiever en productie...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen Dr. Evette Radisky en Alexandra Hockla van de Mayo Clinic in Jacksonville, Florida, bedanken voor het leveren van het pET-3a-pro-MMP-3cd plasmide als sjabloon voor het klonen van het Hisx6pro-MMP-3cd-gen, en hun opmerkingen, samen met Dr. Paul Hartley van het Nevada Genomics Center aan de Universiteit van Nevada, Reno, voor DNA-sequencing. De auteurs willen ook Cassandra Hergenrader bedanken voor het helpen met een deel van de eiwitexpressie. M.R.-S. wil graag de NIH-P20 GM103650-COBRE Integrative Neuroscience grant en de UNR R&D mICRO SEED Grant Award bedanken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.22 µm steriel filterSigma AldrichSLGP033RSWord gebruikt om een aantal verontreinigingen uit het eiwitextract te verwijderen vóór zuivering, en om te voorkomen dat de Ni-NTA kolom verstopt raakt
1 L Erlenmeyer kolvenThermo Fisher ScientificS76106Fn/a
1 L glazen flessenThermo Fisher Scientific06-414-1Dn/a
1.5 mL microfuge buizenThermo Fisher Scientific02-682-002n/a
15 mL conische buizenThermo Fisher Scientific339650n/a
18 G, 1-in. afgeschuinde naaldAmazonB07S7VBHM2Wordt gebruikt in combinatie met de dialyse cassette
2 mL ontziltingskolomThermo Fisher Scientific89890Verwijdert APMA na activering
2-(N-Morpholino)ethaansulfonzuur (MES)Thermo Fisher ScientificAAA1610422n/a
250 mL conische fleskussentjesThermo Fisher Scientific05-538-53AStabiliseert conische flessen tijdens centrifugatie van grote volumes
250 mL conische flessenThermo Fisher Scientific05-538-53n/a
400 mL geroerde celSigma AldrichUFSC40001Concentreert opnieuw een veel groter volume dan de centrifugale filterunit. Rosetta2(DE3)pLysS cellen produceren hoge volumes eiwit die de 15 mL limiet van de centrifugale filterunit kunnen overschrijden
4-aminofenylmercurischacetaat (APMA)Sigma AldrichA9563-5GActiveert MMP-3 door het propeptide af te breken
5 mL spuitThermo Fisher ScientificNC0829167Wordt gebruikt in combinatie met de dialyse cassette
50 mL conische buizenThermo Fisher Scientific339650Wordt gebruikt voor opslag in veel zuiveringsstappen
50 mL herconcentratiebuisSigma AldrichUFC901024DWordt gebruikt voor het opnieuw concentreren van eiwitmonsters na dialyse of het verwijderen van verontreinigingen
AgarThermo Fisher ScientificBP1423-500Bufferingrediënt dat geautoclaveerde LB media bij afkoeling verstevigt
AmpicillineThermo Fisher ScientificBP1760-25Antibioticum dat wordt gebruikt met pET3a vector; wordt gebruikt op 100 µg/mL in LB media
BamHINEBR3136SBeperkingsenzym dat wordt gebruikt met de pET3a vector
Calciumchloride (CaCl2)Thermo Fisher Scientific600-30-23Het calciumion stabiliseert de MMP structuur
CelverspreidersThermo Fisher Scientific50-189-7544Kan worden gebruikt om cellen over een petrischaal te verspreiden na transformatie
ChloramfenicolThermo Fisher Scientific22-055-125GMAntibioticum dat wordt gebruikt met pET3a vector; wordt gebruikt op 34 µg/mL in LB media
Dialyse Buffer 1n/an/a20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 µM ZnCl2, 4 M Urea.
Dialyse Buffer 2n/an/a20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 µM ZnCl2, 2 M Urea.
Dialyse Buffer 3n/an/a20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 µM ZnCl2.
DialyseclipsThermo Fisher Scientific68011Wordt gebruikt in combinatie met slangenhuid dialysebuizen
DialysebuizenThermo Fisher Scientific88243Alternatieve dialysemethode die veel grotere monstervolumes kan bevatten, maar met een hoger risico op monstersverlies
VerteringsbufferNEBB7204SBuffer die wordt gebruikt bij de vertering van de pET3a vector
Weggeef cuvettesThermo Fisher Scientific21-200-257Wordt gebruikt om de OD van de bacteriecultuur te meten tijdens groei en expressie
Dithiothreitol (DTT)Thermo Fisher ScientificD107125GHelpt bij eiwitdenaturatie door het reduceren van eventuele disulfidebindingen
DNA samenstellingsmixNEBE2621SWordt gebruikt om het Hisx6-pro-MMP-3cd PCR product en de gedigesteerde pET3a vector te ligeren
DNase INEBM0303SEndonuclease voor het degraderen van ongunstige DNA verontreinigingen die later de eiwitzuivering kunnen beïnvloeden
EthanolThermo Fisher ScientificA995-4n/a
Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)Thermo Fisher ScientificJ15694-AEWordt gebruikt bij denaturatie. Voorkomt oxidatie en de daaropvolgende vorming van disulfidebindingen
Gel herstelkitPromegaA9281Isoleert en zuivert DNA uit agarose gels
GlycerolThermo Fisher ScientificG33-500Wordt gebruikt voor het maken van glycerolstocks, die worden bevroren bij -80 °C
ZwaartekrachtkolomBioRad7321010Wordt gebruikt voor Ni-NTA zuivering van recombinant His-gelabelde eiwitten
Hoge transformatie-efficiëntie cellenNEBC2987Hoge transformatie-efficiëntie cellen met een grotere kans op succes voor het klonen van de N-terminale His-tag in de pET3a-pro-MMP-3cd construct
HT Elutie Buffern/an/a20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M ureum, 250 mM imidazool. Breng pH naar 7.4
HT Equilibratie Buffern/an/a20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M ureum. Breng pH

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Portolano, N., et al. Recombinant protein expression for structural biology in HEK 293F suspension cells: A novel and accessible approach. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51897(2014).
  2. Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53568(2015).
  3. Nilvebrant, J., Alm, T., Hober, S. Orthogonal protein purification facilitated by a small bispecific affinity tag. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3370(2012).
  4. Yang, Z., et al. Highly efficient production of soluble proteins from insoluble inclusion bodies by a two-step-denaturing and refolding method. PLoS One. 6 (7), 22981(2011).
  5. Hu, X., Beeton, C. Detection of functional matrix metalloproteinases by zymography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2445(2010).
  6. Radisky, E. S., Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., Radisky, D. C. Therapeutic potential of matrix metalloproteinase inhibition in breast cancer. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (11), 3531-3548 (2017).
  7. Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., Do, L. D., Hritz, B. G. Metalloproteinases and their inhibitors: Potential for the development of new therapeutics. Cells. 9 (5), 1313(2020).
  8. Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs. Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).
  9. Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., et al. Directed evolution of the metalloproteinase inhibitor TIMP-1 reveals that its N- and C-terminal domains cooperate in matrix metalloproteinase recognition. Journal of Biological Chemistry. 294 (24), 9476-9488 (2019).
  10. Batra, J., et al. Matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) interaction with tissue inhibitors of metalloproteinases TIMP-1 and TIMP-2. Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15935-15946 (2012).
  11. Singh, K. K., Jain, R., Ramanan, H., Saini, D. K. Expression and purification of matrix metalloproteinases in Escherichia coli. Matrix Metalloproteases. Galea, C. A. , Humana Press. New York, NY. 3-16 (2017).
  12. Manka, S. W., et al. Structural insights into triple-helical collagen cleavage by matrix metalloproteinase 1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12461-12466 (2012).
  13. Gomis-Ruth, F. X., et al. Mechanism of inhibition of the human matrix metalloproteinase stromelysin-1 by TIMP-1. Nature. 389 (6646), 77-81 (1997).
  14. Shirian, J., et al. Converting a broad matrix metalloproteinase family inhibitor into a specific inhibitor of MMP-9 and MMP-14. FEBS Letters. 592 (7), 1122-1134 (2018).
  15. Li, C., et al. Purification of recombinant histidine-tagged catalytic domain of MMP-13 in one step using affinity column and renaturation of it with histidine tag. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 37 (15), 2118-2130 (2014).
  16. Aydin, H., Azimi, F. C., Cook, J. D., Lee, J. E. A convenient and general expression platform for the production of secreted proteins from human cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4041(2012).
  17. McNiff, M. L., Haynes, E. P., Dixit, N., Gao, F. P., Laurence, J. S. Thioredoxin fusion construct enables high-yield production of soluble, active matrix metalloproteinase-8 (MMP-8) in Escherichia coli. Protein Expression and Purification. 122, 64-71 (2016).
  18. Maity, R., et al. GST-His purification: A two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50320(2013).
  19. Stefan, A., Ceccarelli, A., Conte, E., Montón Silva, A., Hochkoeppler, A. The multifaceted benefits of protein co-expression in Escherichia coli. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52431(2015).
  20. Yadavalli, R., Sam-Yellowe, T. HeLa based cell free expression systems for expression of Plasmodium rhoptry proteins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (100), e52772(2015).
  21. Zeytuni, N., Zarivach, R. Purification of the M. magneticum strain AMB-1 magnetosome associated protein MamAΔ41. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (37), e1844(2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Zuivering van recombinant eiwitE coli expressierefolding van inclusion bodiesHis tag zuiveringeiwitdialyseSDS PAGE analyseR2DP cellen

Gerelateerde artikelen