Visualiseren en kwantificeren van farmaceutische verbindingen in de huid met behulp van Coherent Raman Scattering Imaging

Samenvatting

Een coherente Raman scattering imaging methodologie om farmaceutische verbindingen in de huid te visualiseren en te kwantificeren wordt beschreven. Dit artikel beschrijft huidweefselpreparaat (mens en muis) en topische formuleringstoepassing, beeldacquisitie om spatiotemporale concentratieprofielen te kwantificeren en voorlopige farmacokinetische analyse om de toediening van topische geneesmiddelen te beoordelen.

Samenvatting

Cutane farmacokinetiek (cPK) na topische formuleringstoepassing is een onderzoeksgebied van bijzonder belang geweest voor wetenschappers op het gebied van regelgeving en geneesmiddelenontwikkeling om de actuele biologische beschikbaarheid (BA) mechanistisch te begrijpen. Semi-invasieve technieken, zoals tape-stripping, dermale microdialyse of dermale open-flow microperfusie, kwantificeren allemaal macroschaal cPK. Hoewel deze technieken enorme cPK-kennis hebben opgeleverd, mist de gemeenschap een mechanistisch begrip van de penetratie en permeatie van actieve farmaceutische ingrediënten (API) op cellulair niveau.

Een niet-invasieve benadering om cPK op microschaal aan te pakken, is coherente Raman-verstrooiingsbeeldvorming (CRI), die selectief intrinsieke moleculaire trillingen target zonder de noodzaak van extrinsieke labels of chemische modificatie. CRI heeft twee hoofdmethoden - coherente anti-Stokes Raman-verstrooiing (CARS) en gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS) - die gevoelige en selectieve kwantificering van API's of inactieve ingrediënten mogelijk maken. CARS wordt meestal gebruikt om structurele huidinformatie af te leiden of chemisch contrast te visualiseren. Daarentegen wordt het SRS-signaal, dat lineair is met moleculaire concentratie, gebruikt om API's of inactieve ingrediënten binnen huidstratificaties te kwantificeren.

Hoewel muisweefsel vaak is gebruikt voor cPK met CRI, moeten topische BA en bio-equivalentie (BE) uiteindelijk in menselijk weefsel worden beoordeeld voordat de regelgevende goedkeuring plaatsvindt. Dit artikel presenteert een methodologie voor het voorbereiden en in beeld brengen van ex vivo huid voor gebruik in kwantitatieve farmacokinetische CRI-studies bij de evaluatie van topische BA en BE. Deze methodologie maakt betrouwbare en reproduceerbare API-kwantificering mogelijk in de menselijke en muishuid in de loop van de tijd. De concentraties in lipidenrijke en lipidearme compartimenten, evenals de totale API-concentratie in de loop van de tijd worden gekwantificeerd; deze worden gebruikt voor schattingen van BA op micro- en macroschaal en, mogelijk, BE.

Inleiding

Methodologieën om cPK te beoordelen na toepassing van topische geneesmiddelen zijn uitgebreid van klassieke in vitro permeatietests (IVPT)^{studies 1,2,3,4,5} en tape-stripping ^6,7,8 tot aanvullende methodologieën zoals open-flow microperfusie of dermale microdialyse ^9,10,11, 12,13,14. Er zijn mogelijk verschillende lokale plaatsen van therapeutische actie, afhankelijk van de ziekte van belang. Daarom kan er een overeenkomstig aantal methodologieën zijn om de snelheid en mate te beoordelen waarmee een API op de beoogde lokale actielocatie terechtkomt. Hoewel elk van de bovengenoemde methodologieën zijn voordelen heeft, is het grootste nadeel het gebrek aan cPK-informatie op microschaal (d.w.z. het onvermogen om te visualiseren waar de API naartoe gaat en hoe deze doordringt).

Een niet-invasieve methodologie die van belang is om topische BA en BE te schatten, is CRI, die kan worden onderverdeeld in twee beeldvormingsmodaliteiten: CARS en SRS-microscopie. Deze coherente Raman-methoden maken chemisch specifieke beeldvorming van moleculen mogelijk via niet-lineaire Raman-effecten. In CRI worden twee laserpulstreinen scherpgesteld en gescand in een monster; het verschil in energie tussen de laserfrequenties is ingesteld op trillingsmodi die specifiek zijn voor de chemische structuren van belang. Omdat CRI-processen niet-lineair zijn, wordt een signaal alleen gegenereerd bij de microscoopfocus, waardoor driedimensionale farmacokinetische tomografische beeldvorming van het weefsel mogelijk is. In de context van cPK is CARS gebruikt om weefselstructurele informatie te verkrijgen, zoals de locatie van lipiderijke huidstructuren¹⁵. SRS daarentegen is gebruikt om de moleculaire concentratie te kwantificeren, omdat het signaal lineair is met de concentratie. Voor ex vivo huidmonsters is het voordelig om CARS uit te voeren in de epi-richting¹⁶ en SRS in transmissiemodus¹⁷. Daarom zullen weefselmonsters die dun zijn, SRS-signaaldetectie en kwantificering mogelijk maken.

Als modelweefsel biedt het naakte muisoor verschillende voordelen met kleine nadelen. Een voordeel is dat het weefsel al ~ 200-300 μm dik is en geen verdere monstervoorbereiding vereist. Bovendien worden verschillende huidstratificaties gezien door axiaal te focussen door één gezichtsveld (bijv. stratum corneum, talgklieren (SG's), adipocyten en onderhuids vet)^16,18. Dit maakt een voorlopige preklinische schatting van cutane permeatieroutes en actuele BA-schattingen mogelijk voordat naar menselijke huidmonsters wordt verplaatst. Het naaktmuismodel vertoont echter beperkingen zoals moeilijkheden bij extrapolatie naar in vivo scenario's als gevolg van verschillen in huidstructuur¹⁹. Hoewel het naakte muisoor een uitstekend model is om voorlopige resultaten te verkrijgen, is het menselijke huidmodel de gouden standaard. Hoewel er verschillende commentaren zijn geweest over de geschiktheid en toepasbaarheid van bevroren menselijke huid om in vivo permeatiekinetiek nauwkeurig samen te vatten 20,21,22, is het gebruik van bevroren menselijke huid een geaccepteerde methode voor de evaluatie van in vitro API-permeatiekinetiek 23,24,25 . Dit protocol visualiseert verschillende huidlagen in de muis- en menselijke huid en kwantificeert API-concentraties binnen lipiderijke en lipidearme structuren.

Hoewel CRI op tal van gebieden is gebruikt om specifiek verbindingen in weefsels te visualiseren, zijn er beperkte inspanningen geweest om de cPK van topisch aangebrachte geneesmiddelen te onderzoeken. Om de actuele BA / BE van actuele producten met behulp van CRI te evalueren, is het noodzakelijk om eerst een gestandaardiseerd protocol te hebben om nauwkeurige vergelijkingen te maken. Eerdere inspanningen met behulp van CRI voor medicijnafgifte aan de huid hebben variabiliteit binnen de gegevens aangetoond. Aangezien dit een relatief nieuwe toepassing van CRI is, is het opstellen van een protocol van cruciaal belang om betrouwbare resultaten te verkrijgen 18,26,27. Deze benadering richt zich slechts op één specifiek golfgetal in het biologische stille gebied van het Raman-spectrum. De meeste API's en inactieve ingrediënten hebben echter Raman-verschuivingen binnen het vingerafdrukgebied. Dit heeft eerder uitdagingen opgeleverd vanwege het inherente signaal dat afkomstig is van het weefsel in het vingerafdrukgebied. Recente laser- en computationele ontwikkelingen hebben deze barrière verwijderd, die ook kan worden gebruikt in combinatie met de hier gepresenteerde aanpak²⁸. Deze hier gepresenteerde aanpak maakt de kwantificering van een API mogelijk, die een Raman-verschuiving heeft in het stille gebied (2.000-2.300 ^cm-1). Dit is niet beperkt tot de fysiochemische eigenschappen van het geneesmiddel, wat het geval zou kunnen zijn voor sommige eerder genoemde cPK-monitoringmethoden²⁹.

Het protocol moet de variabiliteit van monster tot monster in huiddikte voor verschillende preparaten verminderen, omdat dikke menselijke huidmonsters een minimaal signaal produceren na het aanbrengen van het geneesmiddel als gevolg van lichtverstrooiing door het dikke monster. Een doel van dit manuscript is om een weefselvoorbereidingsmethodologie te presenteren die reproduceerbare beeldvormingsstandaarden garandeert. Bovendien is het CRI-systeem ingesteld zoals beschreven om potentiële foutbronnen te verminderen en signaal-ruis te minimaliseren. Dit artikel zal echter niet ingaan op de leidende principes en technische verdiensten van de CRI-microscoop, omdat dit eerder is behandeld³⁰. Ten slotte wordt de uitgebreide data-analyseprocedure onderzocht om interpretatie van de resultaten mogelijk te maken om het succes of falen van een experiment te bepalen.

Protocol

Het gebruik van naakt muisoorweefsel werd goedgekeurd door het Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), terwijl het gebruik van menselijk huidweefsel werd goedgekeurd door de Massachusetts General Hospital Institutional Review Board (IRB). Volgens IACUC-protocollen werden vers geëuthanaseerde muizen verkregen van medewerkers met naakte muizenkolonies. Menselijk weefsel werd verkregen uit electieve abdominoplastiekprocedures in het Massachusetts General Hospital via een goedgekeurd protocol. Daarnaast werden specifieke weefseltypen anders dan buikhuid verkregen via een instantie voor lichaamsdonatie, ook via een IRB-goedgekeurd protocol.

1. Bereiding van weefsel

1. Bereiding van naakt muis oor huidweefsel
   1. Na het verkrijgen van vers geoogste naaktmuislichamen, verwijdert u de oren met een tang en een microchirurgische schaar. Plaats één oor in een kleine petrischaal (d.w.z. 35 mm x 10 mm). Plaats het naaktmuislichaam in een biohazard-zak die moet worden weggegooid in overeenstemming met de lokale IACUC-protocollen.
   2. Spoel elk muizenoor af met fosfaatgebuufferde zoutoplossing (PBS) en dep het voorzichtig droog met een taakwisser. Herhaal dit tweemaal om achtergebleven vuil of vuil op het oor te verwijderen dat de beeldkwaliteit kan beïnvloeden (zie figuur 1).
   3. Als het oor binnen 24 uur moet worden gebruikt, plaatst u het in een kleine petrischaal (d.w.z. 35 mm x 10 mm) met verse PBS in een koelkast (2-8 °C). Als het oor na 24 uur oogsten wordt gebruikt, plaats het dan in een petrischaal (35 mm x 10 mm) zonder PBS, bedek de schaal met parafilm en plaats het in een vriezer van -20 °C.
2. Bereiding van menselijk huidweefsel
   1. Na de verkrijging van menselijk weefsel, plaats het in een grote petrischaal (d.w.z. 60 mm x 15 mm) in een biologische kap om voldoende ruimte te bieden voor monstervoorbereiding.
   2. Plaats de laag corneumzijde naar beneden zodat het onderhuidse vet toegankelijk is.
   3. Gebruik een tang en een microchirurgische schaar en begin voorzichtig het onderhuidse vet te verwijderen. Zodra onderhuids vet niet langer met de schaar kan worden verwijderd, schakelt u over op een wegwerp scalpel met 10 messen (of gelijkwaardig) om het resterende onderhuidse vet te verwijderen. Gebruik het scalpel in een hoek van 45° ten opzichte van de huid terwijl u de huid stilhoudt met een tang (zie figuur 1).
      OPMERKING: Om SRS-beelden van hoge kwaliteit te hebben, moeten de monsters zo dun mogelijk zijn zonder te worden doorboord.

Figuur 1: Afbeeldingen van ideale dikte voor het afbeelden van muizen en menselijke huid. (A) De oorhuid van de muis houdt zich op tegen licht, dat zichtbaar licht kan doorlaten. (B) Ideale menselijke huid die na de bereiding tegen licht wordt gehouden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Snijd de menselijke huid in stukken van 1 cm x 1 cm.
   OPMERKING: Verse huid, kan tot 24 uur worden gebruikt zonder het gebruik van een agarose-gelbed, zoals eerder beschreven³¹. Een frisse huid kan echter langer worden gebruikt als deze op een agarose-gelbed wordt bewaard. Als de huid later moet worden gebruikt, wordt de huid in een transportzak van het monster geplaatst en vervolgens in een vriezer van -20 °C geplaatst. Bevroren huid moet worden ontdooid met behulp van de onderstaande procedure voor optimale resultaten (zie stap 3.1.2).

2. Laser en microscoop setup

1. Schakel ongeveer 30 minuten voorafgaand aan de beeldvorming de breed instelbare ultrasnelle laser (hierna de laser genoemd) in en laat deze opwarmen. Schakel het laserwaarschuwingsbord/-vergrendelingssysteem in om personeel buiten potentieel gevaar bij binnenkomst te waarschuwen.
   OPMERKING: Goede brillen moeten altijd worden gedragen bij het werken met klasse IV lasers. Voor de specifieke laser die hier wordt gebruikt, is de aanbevolen juiste bril OD ≥ 6 voor het werkbereik van de laser 800-1.300 nm.
2. Terwijl de laser opwarmt, schakelt u de resterende hardware in voor microscoopbesturing, CARS-detectie en SRS-detectie.
3. Lijn de microscoop goed uit om een optimale beeldvorming te garanderen. Klik in het venster Image Acquisition Control in de microscoopbesturingssoftware (hierna MC-software) op de transmissielamp om licht uit de transilluminatielamp van de microscoop te laten komen.
4. Zorg voor de juiste Köhler-verlichting om de microscoop langs de verticale as uit te lijnen: sluit de iris zodat er een minimale hoeveelheid licht door het oogstuk³² wordt gezien.
5. Terwijl u door het oculair kijkt, opent u de iris om te zien of de veelhoek alle zijden tegelijkertijd raakt. Pas de hoogte van de condensor aan als er geen polygoonvorm kan worden gezien voordat de iris wordt geopend.
6. Als de veelhoekvorm niet alle zijden tegelijk raakt, past u de uitlijningspositie van het diafragma aan met behulp van de instelknoppen.
   OPMERKING: Zie Sanderson et ^al.33 voor een diepgaande microscoopstelling.
7. Plaats een microscoopglaasje met een coverslip en dubbelzijdige hechtafstandhouder met daarin een oliemonster (bijv. Olijfolie, omdat er veel -CH₂- bindingen in oliën zitten) op de microscooptraphouder.
8. Zoek in het venster Acquisitie-instellingen van de MC-software het vervolgkeuzemenu microscoop en stel het microscoopobjectief in op 20x.
9. Controleer of het CARS-detectiefilter (645 nm/50 nm) in staat is om het epiCARS-signaal langs de fotomultiplicatorbuis van de microscooppoort te visualiseren en te meten.
   OPMERKING: Dit specifieke filter is geselecteerd voor het afbeelden van lipiden als het anti-Stokes CARS-signaal gegenereerd bij 652 nm voor een pompgolflengte van 803 nm en een Stokes-golflengte van 1.040 nm (zie Eq. (1)).
   (1)
   Wanneer de variabelen λ eenheden van nm hebben; λ_pomp is de golflengte van de pompbundel; en λ_Stokes is de Stokes-bundelgolflengte.
10. Kijk door het oculair om de rand van het oliemonster te vinden, dat zal worden gebruikt om de uitlijning van het systeem te verifiëren.
11. Zorg ervoor dat de rand in Z-focus is met behulp van de focusknoppen op de microscoop en pas de podiumcontroller aan om XY-focus te verkrijgen.
12. Nadat de laser is opgewarmd, stelt u de pompstraal in op 803 nm met de motorfine-instelling ingesteld op 50,0 in de grafische gebruikersinterface van de laser. De exacte motorfintuning die wordt gebruikt, kan van installatie tot instelling verschillen.
    OPMERKING: De pompstraal is de enige bundel met een instelbare golflengte op deze laser, aangezien de stokesstraalgolflengte is vastgesteld op 1.040 nm. Deze configuratie richt zich op de CH-trilling op 2850 ^cm-1 (zie Eq. (2) om de pompgolflengte voor golfnummertargeting te berekenen).
    (2)
    Waar heeft eenheden van relatief golfgetal (cm⁻¹), en λ variabelen hebben eenheden in cm.
13. Controleer de uitlijning van de laser in de microscoop voorafgaand aan de beeldvorming; zie figuur 2 voor de weergave van het laserpad. Installeer tijdens de eerste installatie van de microscoop twee irissen in het straalpad als geleiders voor de juiste uitlijning in de microscoop. Omdat het optische pad van de laser in de loop van de tijd kan drijven, moet u ervoor zorgen dat de laserstraalpaden het midden van de irissen doorkruisen, zodat ze correct de microscoop binnenkomen.
14. Sluit met behulp van de IR-viewer alle irissen volledig en zorg ervoor dat de straal op beide is gecentreerd: eerst op de iris die het dichtst bij de laser staat en ten slotte bij de toegangspoort van de microscoop.
15. Controleer eerst de pompstraal om er zeker van te zijn dat de straal recht in de microscoop gaat. Zodra de pomp is uitgelijnd, controleert u of de Stokes-straal ook correct in de microscoop gaat.
    1. Als de balken niet door de irissen zijn uitgelijnd, loopt u de balken iteratief door de irissen met behulp van de x- en y-instelknoppen van de twee spiegelbevestigingen voor de pomp en Stokes-beampathen.
16. Zodra de bundelvlekken elkaar overlappen voordat u de microscoop binnengaat, controleert u of ze de microscoop correct doorkruisen.
    1. Klik in het venster Image Acquisition Control van de MC-software op het TD-kanaal voor transmissie, ALG1 (analoog kanaal 1) voor het coherente anti-Stokes Raman-kanaal en ALG2 (analoog kanaal 2) voor het gestimuleerde Raman-verstrooiingskanaal. Gebruik de volgende instellingen (zoals in dit protocol): versterking van 1 en een offset van -1 voor ALG1, winst van 1,25 en offset van -2 voor ALG2.
       OPMERKING: Afhankelijk van de systeemconfiguratie kunnen analoge kanalen een verschillende nummering hebben voor afzonderlijke beeldkanalen. Als de SRS-detector op zijn plaats is, zal er geen transmissiesignaal zijn omdat er geen licht doorheen kan komen (d.w.z. men kan geen beelden met TD en ALG2 tegelijkertijd visualiseren in deze opstelling).

Figuur 2: Schematische lay-out voor coherent Raman laser imaging pad. Bundels worden onafhankelijk geconditioneerd voor spotgrootte en afgestemd via tijdvertragingsfase om coherente Raman-verstrooiing in monsters te genereren voor de gewenste afstemmingsfrequentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

17. Schakel de vermogensmeter in en meet met behulp van een krachtige thermische vermogenssensor het vermogen van de pomp en Stokes-balken afzonderlijk voor het experiment.
    OPMERKING: In dit specifieke voorbeeld was het pompstraalvermogen 80 mW, terwijl het Stokes-straalvermogen 180 mW was voorafgaand aan de ingang van de microscoop.
18. Klik in het venster Image Acquisition Control op de knop Focus x2 om de afbeelding in de MC-software te bekijken.
19. Controleer in het venster Acquisitie-instellingen of de pixelverhouding en de verblijftijd zijn ingesteld op de gewenste parameters voor het experiment.
    OPMERKING: Een pixelverhouding van 1.024 x 1.024 en een verblijftijd van 2 μs/pixel werden in dit protocol gebruikt.
20. Bevestig de laseruitlijning ten opzichte van de microscoop door de pompstraal te deblokkeren en naar het TD-kanaal te kijken.
    OPMERKING: De laser is correct uitgelijnd als de straal gecentreerd in het beeld wordt gezien met de juiste detectorinstellingen.
21. Gebruik anders X- en Y-instelknoppen op de periscoop om de bundel naar het midden van de afbeelding te verplaatsen.
22. Bevestig de uitlijning van laser en microscoop door hetzelfde beeld te zien in zowel het CARS- als het SRS-kanaal.
23. Om de uitlijningsafbeelding te verkrijgen, klikt u op de XY-scanknop in het venster Image Acquisition Control met de juiste filtermodusset (bijv. Kalman Line 3).
24. Sla deze set afbeeldingen op met een beschrijvende bestandsnaam om in de loop van de tijd te vergelijken en de systeemprestaties/uitlijning te bevestigen.

3. Lipide beeldvorming

1. Muizenoor en menselijk weefsel
   1. Als u vers weefsel gebruikt, slaat u stap 3.1.2 over.
   2. Verwijder de oorhuid van de muis uit de vriezer van -20 °C en plaats deze gedurende 10 minuten in een incubatiekamer (32 °C). Verwijder het muizenoor uit de incubatiekamer.
      OPMERKING: Zie stap 1.1.2. voor de voorbereiding van de muizenoorhuid. Ruwe behandeling of schrapen van het weefsel kan leiden tot mechanische afbraak, vernietiging of verstoring van het weefsel, met name het stratum corneum.
   3. Als u een nude muisoor gebruikt, plaatst u het voorste deel van het oor naar de glazen bodem van een 35 mm, nr. 0 schaal. Als u menselijke huid gebruikt, plaats deze dan met het stratum corneum naar beneden, omdat dit de kwantificering van geneesmiddelen van de oppervlakkige lagen naar de diepere lagen mogelijk maakt (figuur 1).
      OPMERKING: Het achterste deel van het naakte muisoor is gevoeliger voor onvolkomenheden van de behuizing. Als de menselijke huid niet wordt geplaatst met de laag corneumzijde naar beneden gericht op de omgekeerde microscoop, zal men niet in staat zijn om voorbij de dermis te kijken omdat er een behoorlijke hoeveelheid licht wordt verstrooid en het medicijn dat in het stratum corneum doordringt niet kan worden gezien.
   4. Zodra het weefsel op de glazen bodem is gecentreerd, gebruikt u een applicator met katoenpunt om ervoor te zorgen dat de huid plat is en volledig contact heeft met het dekvloeroppervlak van de glazen bodemschaal.
      OPMERKING: Dit is een stap die problemen kan veroorzaken bij het afbeelden van de huid als deze niet volledig plat is.
   5. Plaats een wasmachine op de huid om beweging tijdens het fotograferen te voorkomen. Zorg ervoor dat het weefsel zichtbaar is door het middelste gat van de wasmachine voor SRS-transmissiedetectie.
   6. Verwijder de dia-inzet en vervang deze door de incubatiekamer, die de enkele schotelinzet heeft.
   7. Plaats de schaal met glazen bodem met het huidweefsel in de enkele schotelbevestiging van de incubatiekamer.
      OPMERKING: U kunt ook een plaat met 6 putten gebruiken om meerdere huidmonsters en formuleringen tegelijk af te beelden.
   8. Verlaag de pixelverhouding in het venster Acquisitie-instellingen van de MC-software (bijvoorbeeld van 1.024 x 1.024 naar 512 x 512) voor een snellere galvo-scansnelheid terwijl de Z-diepte wordt gewijzigd om het stratum corneum te vinden (zie Figuur 3A voor muis of Figuur 3E voor mens).
   9. Nadat het stratum corneum is gevonden, registreert u die axiale positie als de nulpositie in het venster Acquisitie-instellingen en wijzigt u de pixelverhouding voor elk specifiek experiment (bijvoorbeeld 1.024 x 1.024).

Figuur 3: Voorbeeld huiddiepten verkregen met behulp van SRS. De bovenste set afbeeldingen zijn van naakte muisoorhuid met het volgende: (A) stratum corneum, (B) talgklieren, (C) adipocyten, (D) onderhuids vet. De onderste set afbeeldingen is verkregen van menselijke huid met de volgende afbeelding: (E) stratum corneum, (F) papillaire dermis en (G) een talgklier. Schaalbalken = 100 μm. Zowel muis- als menselijke huidbeelden werden verkregen met behulp van een 20x-objectief op 1024 pixels x 1024 pixels; de menselijke SG werd genomen op 512 x 512 pixels. Afkortingen: SRS = gestimuleerde Raman-verstrooiing; SG = talgklier. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Toepassing van topische formulering

1. Pipetteer de vooraf bepaalde formuleringsdosis op de huid (bijv. 10 μL/cm²).
   OPMERKING: De viscositeit van de formulering speelt een rol bij de pipetkeuze. Het gebruik van een verdringerpipet voor viskeuze formuleringen, zoals crèmes of gels, en een luchtverplaatsingsppet voor oplossingen wordt aanbevolen. In dit experiment was ruxolitinib de modelverbinding in een eenvoudige oplossing van propyleenglycol (propaan-1,2-diol).
2. Gebruik de zuigerpunt van een spuit of een gehandschoende vinger om de formulering gedurende 30 s met de klok mee te wrijven. Noteer het tijdstip waarop de formulering wordt toegepast voor latere cPK-analyse (zie stappen 6.15-6.17 hieronder).
   OPMERKING: De duur van de toepassing is afhankelijk van het experiment; elk kan anders zijn.
3. Nadat de toegewezen tijd voor de formulering om door te dringen is verstreken, verwijdert u de overtollige formulering en plaatst u de huid met de formuleringszijde naar de schotel met glazen bodem.
   OPMERKING: De formulering wordt verwijderd met behulp van een delicate taakwisser of een kleine (~ 1 inch) 3D-geprinte wisser in een enkele richting (bijvoorbeeld van noord naar zuid).

5. Experimentele opstelling voor het kwantificeren van geneesmiddelen

1. Stel de pompbundel in op 803 nm. Controleer de pomp- en Stokes-bundelvermogens met de fotodiode om er zeker van te zijn dat dit de gewenste krachten zijn voor het experiment. Deblokkeer elke balk afzonderlijk om het vermogen te meten en de balken opnieuw te blokkeren.
   OPMERKING: In dit specifieke voorbeeld was het pompstraalvermogen 100 mW, terwijl het Stokes-straalvermogen 180 mW was.
2. Plaats de schotel met glazen bodem in een incubatiekamer met een inzetstuk voor één schotel met glazen bodem. Zet de schotel vast met clips om beweging tijdens het beeld te voorkomen.
3. Schakel het transmissielampje in de MC-software in. Kijk door het oculair en pas de axiale focus aan met de instelknop om ervoor te zorgen dat het weefsel scherp is.
4. Deblokkeer zowel de pomp als de Stokes balken. Zorg ervoor dat ALG1- en ALG2-kanalen zijn ingeschakeld en klik vervolgens op Focus x2 in de MC-software om de skin in de CARS- en SRS-kanalen te visualiseren. Zorg ervoor dat de SRS-fotodiode zich boven de condensor bevindt.
5. Klik in het vervolgkeuzemenu Apparaat op Matl (Multi Area Time Lapse). Zoek naar een XY Stage Warning om te verschijnen; wanneer het werkgebied beweegt om de mechanische oorsprong te vinden, klikt u op OK.
6. Ga in de MATL-module naar Weergeven en klik vervolgens op Lijst met geregistreerde punten in de MC-software. Begin met het toevoegen van 1) specifieke diepten in de huid (d.w.z. stratum corneum, SG's, adipocyten, onderhuids vet zoals bepaald tijdens live beeldvorming met lipidengetuned contrast) of 2) XY-posities als volledige dieptestapels moeten worden genomen. Zie figuur 3 voor voorbeelden.
   1. Zodra het stratum corneum is geïdentificeerd, bladert u door de axiale focus (of z-focus) om specifieke weefselstratificaties te identificeren die hierboven zijn genoemd. Zie figuur 3 voor voorbeelden in de huid van mensen en muizen.
   2. In het geval van beeldspecifieke diepten in tegenstelling tot volledige Z-dieptestapels, klikt u voor elke huidstratificatie op Punt registreren om het toe te voegen aan de MATL-wachtrij. Voor stapels met volledige diepte klikt u op Punt registreren voor elke XY-positie met diepteselectie in het venster met acquisitieparameters .
   3. Zodra alle gewenste XY -posities (volledige Z-dieptestapels) of XYZ-posities (specifieke huidstratificaties) zijn geregistreerd in de MATL-software, wijzigt u de bestandsmap en naam op een manier die consistent is tijdens de experimenten voor beeld- en cPK-analyses (zie stappen 6.15- 6.17).
7. Stel het aantal herhalingen in op 1 in de MATL-module en klik op Gereed. Wacht tot Play is veranderd van een grijze in een zwarte pijl, wat aangeeft dat de software klaar is. Druk op Play om te beginnen met het afbeelden van de voorlopige lipidenstapel (hierna Lipid Images).
   OPMERKING: Dit zal worden gebruikt om lipiderijke en lipidearme regio's van individuele weefselstratificaties tijdens de analyse te scheiden. De cyclus en de totale tijd worden rechtsonder in de lijst met geregistreerde punten aangegeven.
8. Zodra de cyclus is voltooid, blokkeert u zowel de pomp- als de Stokes-balken. Wijzig de golflengte op de grafische lasergebruikersinterface in de gewenste golflengte op basis van het beoogde golfnummer of Raman-trilling.
   OPMERKING: Bijvoorbeeld, 843 nm voor de pompbundel wordt gebruikt om 2.250 ^cm-1 te richten met Eq. (2), en de motor fijnafstelling wordt gewijzigd in 50.1. Het hier gepresenteerde voorbeeldgeneesmiddel, ruxolitinib, bevat een nitril dat kan worden gericht op 2.250 ^cm-1. Het golfnummer gericht op huidstructuur zal altijd hetzelfde zijn (2.850 ^cm-1); Het golfnummer voor een API kan echter elk golfnummer zijn, maar moet a priori bekend of berekend zijn.
9. Pas de handmatige tijdvertragingsfase (figuur 2) aan om overlapping in tijd voor de nieuwe golflengte en het pompbundelvermogen te garanderen. Zorg ervoor dat dezelfde krachten worden gebruikt voor zowel lipide- als API-beeldvorming, die a priori worden vastgesteld.
10. Gebruik de duur per cyclus om het totale aantal vereiste herhalingen per experiment te berekenen. Deel eenvoudig het totale gewenste tijdsverloop van het experiment door dat van de cyclusduur.
    OPMERKING: De cyclusduur is een functie van de afbeeldingsgrootte, pixelverblijftijd, Kalman-gemiddelde en het aantal afbeeldingen per cyclus. Optimalisatie van deze parameters zal de cyclustijd verkorten, waardoor de temporele resolutie toeneemt.
11. Zodra het totale aantal cyclusherhalingen is gekozen, deblokkeert u de pompstraal, controleert u het vermogen met behulp van de fotodiode en zorgt u ervoor dat het overeenkomt met dat van het gewenste vermogen. Deblokkeer ten slotte de Stokes-straal om beeldvorming mogelijk te maken.
12. Druk op Afspelen om te beginnen met het automatisch afbeelden van de instelpunten.
13. Nadat de MATL-beeldvorming is voltooid, schakelt u de pompstraal terug naar 803 nm en past u het vermogen weer aan op het oorspronkelijke lipidebeeldvermogen dat in stap 5.1 werd gebruikt.
14. Net als in eerdere stappen wijzigt u de bestandsnaam om consistent te zijn voor afbeeldingen na het experiment gedurende het onderzoek.
15. Stel het aantal herhalingen in op 1.
16. Klik op Gereed | Speelknop om een post-time-course lipid stack te verkrijgen en ervoor te zorgen dat er geen weefselbeweging is geweest tijdens de beeldvorming (figuur 4).

Figuur 4: Weefselbeweging in naakte muisoorhuid gedemonstreerd door het visualiseren van talgklieren. Voorbeeld van beperkte weefselbeweging wordt afgebeeld in A en B, terwijl substantiële weefselbeweging wordt afgebeeld in C en D. (A) toont de talgklieren op het moment van formuleringstoepassing en (B) dezelfde diepte op 120 minuten na het aanbrengen. (C) Talgklieren van muizen op het moment van formuleringstoepassing en (D) 120 min na het aanbrengen van de formulering; de talgklieren zijn nauwelijks zichtbaar, wat erop wijst dat dit experiment de opname in de talgklieren gedurende de gehele experimentele duur niet heeft gemeten. Schaalbalken = 100 μm. Afbeeldingen zijn 1024 pixels x 1024 pixels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Data-analyse

1. Verkrijg afbeeldingen als . OIB (of . OIR afhankelijk van de microscoop en MC-software) bestandstypen waarbij elke XYZ-positie een aparte submap heeft.
2. Compileer lipidebeelden met API-kanaalafbeeldingen door lipideafbeeldingen te hernoemen met de volgende _lipid.oib.
3. Voer de volgende stappen uit bij elke huidstratificatie (hier gedemonstreerd met alleen de SG-stratificatie omwille van de eenvoud; zie figuur 3B).
   1. Importeer een SG-lipideafbeelding in ImageJ (of Fiji)³⁴ en vink het vakje gesplitste kanalen aan om het bestand te splitsen in de CARS- en SRS-kanalen.
      OPMERKING: Fiji splitst het bestand op in het aantal afbeeldingen dat tijdens het experiment is verkregen over het aantal kanalen.
   2. Open de roi-manager (region of interest) door te klikken op | Gereedschap | ROI-manager.
   3. Gebruik het SRS-kanaal (bijvoorbeeld C = 1) om een SG in de afbeelding af te bakenen.
      OPMERKING: SG's zijn de heldere locaties als gevolg van gerichte -CH₂- trillingen.
   4. Voeg dit toe aan de ROI-manager door te klikken op Toevoegen [t] in de ROI-manager of door op t op het toetsenbord te drukken. Herhaal dit proces voor elke SG in de afbeelding.
   5. Als u lipiderijke regio's wilt maskeren, selecteert u elke ROI en klikt u op het tabblad Meer | OF (Combineren) | Voeg toe aan ROI-manager.
   6. Om lipidearme gebieden te maskeren, gebruikt u het rechthoekgereedschap in het FIJI-menu en tekent u een vierkant rond de hele afbeelding. Voeg dit toe aan de ROI-manager.
   7. Klik op de nieuw toegevoegde vierkante ROI naast de ROI die alle lipidenrijke regio's in de ROI-manager selecteert. Selecteer onder Meer de optie XOR om een masker van de lipidearme regio's te genereren en toe te voegen aan de ROI-manager.
4. Laad de API-afbeeldingen in Fiji.
5. Voeg de afbeeldingen samen in numerieke volgorde (d.w.z. Image0001, Image0002, Image0003, enz.) met behulp van de volgende menuvolgorde: Afbeelding | Stapels | Gereedschap | Aaneenschakeling.
   1. U kunt deze afbeeldingen ook importeren door een van de afbeeldingen in Fiji te laden en vervolgens een optie te selecteren met de naam Groepsbestanden met vergelijkbare namen op de opstartpagina .
      OPMERKING: Dit biedt de mogelijkheid om alle afbeeldingen met een vergelijkbare bestandsnaam te importeren en ze automatisch samen te voegen.
6. Terwijl u de aaneengeschakelde afbeelding actief hebt, gaat u naar de ROI-manager, selecteert u de lipidenrijke gebieden (d.w.z. de SG), klikt u op Meer en selecteert u Multi-meten. Wacht tot het venster Resultaten wordt weergegeven.
7. Zoek naar Gebied, Gemiddelde, Min, Max en Mediaan in de standaard meetinstellingen. Als andere statistieken gewenst zijn voor analyse, schakelt u deze opties in door het relevante selectievakje in te schakelen in het venster Metingen instellen (| Stel metingen in...).
8. Exporteer de gegevens uit het venster Resultaten naar een spreadsheet en voeg een kolom met de titel Regio toe.
9. Voeg lipidenrijk toe aan elke rij gegevens voor de lipidenrijke regio's. Voeg lipide-arm toe aan regio's die buiten de lipiden lagen.
10. Voeg een laag met kolomtitel toe en voeg de betreffende laag toe die is geanalyseerd (aanvullende tabel S1).
11. Herhaal stap 6.5 - 6.7 voor de lipidearme regio's terwijl de juiste ROI is geselecteerd.
12. Om de gegevens te visualiseren, slaat u de spreadsheet op en importeert u deze in JupyterLab (pakket matplotlib)³⁵ of in R (pakket ggplot2)³⁶. Zet de gegevens uit als een functie van het beeldgetal versus de gemiddelde intensiteit om de concentratie-tijdgegevens te schatten. (Figuur 5).
13. Importeer de spreadsheet in RStudio om niet-aanvullende analyse (NCA) uit te voeren voor de farmacokinetische analyse van de CRI-gegevens.
14. Voeg een kolom met de titel tijd toe.
15. Bereken voor Image0001 de duur tussen de formuleringstoepassing en de eerste afbeelding.
    OPMERKING: Dit is het eerste tijdspunt. De cyclusduur wordt gebruikt om de resterende beelden (en dus tijdspunten) te berekenen die in de loop van de tijd toenemen. Als de tijd sinds de toepassing bijvoorbeeld 30 minuten is, heeft Image0001 een tijdspunt van 30 minuten en met een cyclusduur van 8 minuten heeft Image0002 een tijdspunt van 38 minuten, Image0003 een tijdspunt van 46 minuten enzovoort.
16. Voer NCA uit in RStudio (met het noncompart-pakket)³⁷ op de intensiteitstijdgegevens die uit de spreadsheet zijn geïmporteerd, met de volgende aanroep voor één laag/gebied:
    sNCA(x = tijd, y = gemiddelde, dosis = 1, tijdEenheid = "s", dosisUnit ="mg")
    Waar x verwijst naar tijdspunten, y verwijst naar intensiteit en de dosis kan als één worden gelaten, berekend als de mM-dosis van het geneesmiddel in de formulering of de productdosis.
    OPMERKING: De NCA-uitgang biedt parameters zoals C_max en AUC_allemaal. Omdat dit echter ex vivo huid is, zijn deze parameters in feite J_max en AUC_flux-all.
17. Vergelijk J_max en AUC_flux-all metrics visueel door ze uit te zetten (figuur 6) naast statistische vergelijkingen tussen experimentele omstandigheden. Zie figuur 6 voor een voorbeeld van de analyse van ex vivo CRI-studies.
    OPMERKING: De juiste statistische test(en) zijn afhankelijk van elke specifieke dataset. Het is ook belangrijk op te merken dat alle farmacokinetische parameters log-normaal verdeeld zijn en dat eventuele vergelijkingen de log-getransformeerde (natural log of log10) gegevens moeten gebruiken.

Figuur 5: Intensiteit vs. tijdprofielen. (A) Een voorbeeld van fluxprofielen die verzadiging hebben bereikt en dus alleen een afname van de intensiteit wordt gezien. Elke ROI heeft een ander fluxprofiel om de heterogeniteit aan te tonen in de gegevens die men zou kunnen verwerven. (B) Een voorbeeld van concentraties die toenemen nadat de beeldvorming is begonnen. Elke ROI is een ander gezichtsveld (aangegeven door de verschillende kleursporen) binnen hetzelfde weefsel van hetzelfde experiment. Naast globale concentraties is er de mogelijkheid om op te helderen welke lokale omgeving een API / formulering verkiest, zoals aangegeven door lipiderijke en lipidearme regio's. De profielen in A geven aan dat er geen absorptie van het geneesmiddel in het weefsel is, omdat de API al is doorgedrongen en het weefsel begint te verlaten zodra de beeldvorming is begonnen. In B heeft het weefsel echter geen verzadiging bereikt en is er nog steeds absorptie van de API gevolgd door eliminatie. De segmentatie van afbeeldingen in lipidenrijk en lipidearm zal helpen bij de opheldering van de lokalisatie van de API (of inactieven) en de permeatieroutes in de huid (d.w.z. stratum corneum). Een hogere concentratie binnen de lipiderijke regio's geeft aan dat de API lokaliseert binnen de lipidestructuur van de onderzochte laag, wat helpt bij gerichte informatie over medicijnafgifte. Afkortingen: ROI = regio van belang; API = actief farmaceutisch ingrediënt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resultaten

Beeldvorming wordt als succesvol beschouwd als het weefsel na voltooiing van het experiment niet significant in axiale (<10 μm) of laterale richting is bewogen (figuur 4). Dit is een directe indicatie als de SRS-meting voor de API van belang niet representatief is voor de initiële diepte, waarvoor de kwantificering laagspecifiek is. Dit wordt verzacht door z-stacks in beeld te brengen voor elke XY-positie van belang, waarbij de afweging de temporele resolutie is. Als in deze onderzoeken bevr...

Discussie

De evaluatie van topische BA/BE is een onderzoeksgebied dat een veelzijdige aanpak vereist, aangezien geen enkele methode in vivo cPK volledig kan karakteriseren. Dit protocol presenteert een methodologie voor de evaluatie van de BA/BE van een topisch geneesmiddel op basis van coherente Raman-beeldvorming. Een van de eerste punten die over het hoofd kan worden gezien, is hoe dun de huidmonsters moeten zijn, vooral voor kwantitatieve transmissie SRS-beeldvorming. Als de huid te dik is (d.w.z. dat licht e...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Weefselvoorbereiding
Autoclaveerbare biogevaren zakken	FisherBrand	22-044562	Zoals vermeld in de tekst: biogevaren zakken https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-polyethylene-biohazard-autoclave-bags-without-sterilization-indicator-8/22044562?searchHijack=true&searchTerm= 22044562&searchType=RAPID& matchedCatNo=22044562
Celcultuur buffers: Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x	Corning	MT21030CV	Zoals vermeld in de tekst: PBS https://www.fishersci.com/shop/products/corning-cellgro-cell-culture-buffers-dulbecco-s-phosphate-buffered-salt-solution-1x-8/MT21030CV?searchHijack=true&searchTerm= 21-030-cv&searchType= RAPID&matchedCatNo=21-030-cv
Wegwerp scalpels	Exel International	14-840-00	Zoals vermeld in de tekst: scalpel https://www.fishersci.com/shop/products/exel-international-disposable-scalpels-3/1484000?keyword=true
Hoge precisie 45° hoek brede punt pincet/forceps	Fisherbrand	12-000-132	Zoals vermeld in de tekst: forceps https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-45-angle-broad-point-tweezers-forceps/12000132#?keyword=
Kimwipes delicate taakdoekjes, 1-laags	Kimberly-Clark Professional Kimtech Science	06-666	Zoals vermeld in de tekst: taakdoekje https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/06666
Parafilm M laboratorium inpakfolie	Bemis	13-374-12	Zoals vermeld in de tekst: parafilm https://www.fishersci.com/shop/products/curwood-parafilm-m-laboratory-wrapping-film-4/1337412
Petrischaal (35 mm x 10 mm)	Fisherbrand	FB0875711YZ	Zoals vermeld in de tekst: kleine petrischaal https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-specialty-6/FB0875711YZ?keyword=true
Petrischaal (60 mm x 15 mm)	Fisherbrand	FB0875713A	Zoals vermeld in de tekst: grote petrischaal https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/FB0875713A?keyword=true
Chirurgische schaar	Roboz	NC9411473	Zoals vermeld in de tekst: schaar https://www.fishersci.com/shop/products/scissors-327/NC9411473?searchHijack=true&searchTerm= RS-5915SC&searchType=RAPID& matchedCatNo=RS-5915SC
Laser/microscoop
650/60 nm BrightLine enkele-band bandpass filter	Semrock		Zoals vermeld in de tekst: CARS filter - CH2 vibraties (645nm/60nm filter)
Controlebox IX2-UCB	Olympus		Zoals vermeld in de tekst: Controlebox
D700/30m	Chroma		Zoals vermeld in de tekst: CARS filter - gedeutereerd band https://www.chroma.com/products/parts/d700-30m
DeepSee Insight	Spectra-Physics		Zoals vermeld in de tekst: Laser https://www.spectra-physics.com/f/insight-x3-tunable-laser
Digitaal handbediend optisch vermogens- en energiemeterconsole	ThorLabs	PM100D	Zoals vermeld in de tekst: vermogensmeter https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341
Fluoview Software	Olympus		Zoals vermeld in de tekst: Microscoopbesturingssoftware
Mat glazen microscoopglazen	FisherBrand		Zoals vermeld in de tekst: microscoopglazen https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/22265446
FV1000	Olympus		Zoals vermeld in de tekst: Microscoop
Incubatiekamer	Tokai Hit	GM-800	Zoals vermeld in de tekst: incubatiekamer
Integrerende sfeer fotodiode vermogenssensor	ThorLabs	S142C	Zoals vermeld in de tekst: fotodiode https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341
Voeding FV31-PSU	Olympus		Zoals vermeld in de tekst: voeding
Precisie 4063, 80MHz dubbelkanaals functiegenerator	BK Precision		Zoals vermeld in de tekst: functiegenerator
ProScan – Precisie Microscoop Automatisering	Prior Scientific Instruments		Zoals vermeld in de tekst: stage controller https://www.prior.com/microscope-automation/inverted-microscope-systems/proscan-linear-stage-highest-precision-microscope-automation
SecureSeal beeldruimte afstandshouders	Grace Biolabs	654004	Zoals vermeld in de tekst: afstandshouder https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654004/
SRS detectiekit	APE		Zoals vermeld in de tekst: SRS detector
UPLSAPO 20X NA:0.75	Olympus		Zoals vermeld in de tekst: 20X objectief https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/uplsapo/
Lipide/geneesmiddelbeeldvorming
35 mm Schaal, nr. 0 ongecoat dekglas, 14 mm glazen diameter	MatTek Corporation	NC9711297	Zoals vermeld in de tekst: glazen bodemschaal https://www.fishersci.com/shop