Isolatie en karakterisering van intact fycobilisoom in cyanobacteriën

Summary

Het huidige protocol beschrijft de isolatie van fycobilisomen uit cyanobacteriën door centrifugering door middel van een discontinue sucrosedichtheidsgradiënt. De fracties van intacte fycobilisomen worden bevestigd door 77K fluorescerend emissiespectrum en SDS-PAGE-analyse. De resulterende fycobilisoomfracties zijn geschikt voor negatieve kleuring van TEM en massaspectrometrie-analyse.

Abstract

In cyanobacteriën is fycobilisoom een vitaal antenne-eiwitcomplex dat licht oogst en energie overbrengt naar fotosysteem I en II voor fotochemie. Het bestuderen van de structuur en samenstelling van fycobilisoom is van groot belang voor wetenschappers omdat het de evolutie en divergentie van fotosynthese in cyanobacteriën onthult. Dit protocol biedt een gedetailleerde en geoptimaliseerde methode om cyanobacteriële cellen tegen lage kosten te breken door een kralenklopper efficiënt. Het intacte fycobilisoom kan vervolgens uit het celextract worden geïsoleerd door sucrose gradiënt ultracentrifugatie. Deze methode heeft aangetoond geschikt te zijn voor zowel model- als niet-modelcyanobacteriën met verschillende celtypen. Een stapsgewijze procedure wordt ook aangeboden om de integriteit en eigenschap van fycobiliproteïnen te bevestigen door 77K fluorescentiespectroscopie en SDS-PAGE gekleurd door zinksulfaat en Coomassie Blue. Het geïsoleerde fycobilisoom kan ook worden onderworpen aan verdere structurele en compositorische analyses. Over het algemeen biedt dit protocol een nuttige startgids waarmee onderzoekers die niet bekend zijn met cyanobacteriën snel intact fycobilisoom kunnen isoleren en karakteriseren.

Introduction

Fycobilisoom (PBS) is een enorm in water oplosbaar pigmenteiwitcomplex dat zich hecht aan de cytoplasmatische kant van de fotosystemen in de thylakoïde membranen van cyanobacteriën1. PBS bestaat voornamelijk uit gekleurde fycobiliproteïnen en kleurloze linkereiwitten1,2. De fycobiliproteïnen kunnen worden onderverdeeld in vier hoofdgroepen: phycoerythrin, phycoerythrocyanine, phycocyanine en allophycocyanin3. De vier belangrijkste groepen absorberen verschillende golflengten van lichtenergie in het bereik van 490-650 nm, die chlorofylen inefficiënt

Protocol

De Synechocystis sp. PCC 6803, de model glucosetolerante stam, werd verkregen van Dr. Chu, Hsiu-An bij Academia Sinica, Taiwan. Leptolyngbya sp. JSC-1, de niet-model filamenteuze, werd verkregen van Dr. Donald A. Bryant aan de Pennsylvania State University, VS.

1. Celkweek en oogsten

1. Ent Syn6803- of JSC-1-cellen met behulp van een metallische inentingslus in een erlenmeyer van 100 ml met 50 ml B-HEPES-medium28. Kweek de cellen bij 30 °C onder 50 μmol fotonen ^{m-2 s-1} (witlicht-LED) in 1% (v/v) _CO2 met constant roeren door een magneetroerder ....

Results

De Syn6803- en JSC-1-cellen werden gekweekt in kegelkolven met constant roeren in B-HEPES-medium bij 30 °C, onder een LED-wit licht (50 μmol fotonen ^m-2s-1) in een groeikamer gevuld met 1% (v/v) _CO2. In de exponentiële groeifase (_OD750 = ~0,5) werden de cellen gesubcultureerd tot vers medium met een uiteindelijke optische dichtheid _OD750 = ~0,2. Na het bereiken van de late exponentiële groeifase (_OD750 = 0,6-0,8) werden de culturen verzameld en gecentrifug.......

Discussion

Dit protocol beschrijft een eenvoudige en standaardmethode voor het isoleren van intacte PBS in twee soorten cyanobacteriën, eencellig model Syn6803 en filamenteuze niet-model JSC-1. De kritische stappen van het protocol zijn celhomogenisatie en ultracentrifugatie op een discontinue dichtheidsgradiënt van sucrose. Over het algemeen is de verstoring van filamenteuze cellen gecompliceerder dan eencellige cellen. Het verhogen van de hoeveelheid uitgangsmateriaal (het natte gewicht van de celkorrel) en de herhaling van het k.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 mm glass beads	BioSpec	11079101	for PBS extraction
13 mL centrifugation tube	Hitachi	13PA	ultracentrifugation
40 mL centrifugation tube	Hitachi	40PA	ultracentrifugation
Acetic acid	Merck	8.1875.2500	for Coomassie Blue staining
B-HEPES medium			A modified cyanobacterial medium from BG-11 medium
Brilliant Blue R-250	Sigma	B-0149	for Coomassie Blue staining
Bromophenol blue	Wako pure chemical industries	2-291	protein loading buffer
Electronic balance	Radwag	WLC 2/A2/C/2	for the wet weight measurement of cell pellets
Fluorescence spectrophotometer	Hitachi	F-7000	Spectrophotometer
Glycerol	BioShop	Gly001.500	protein loading buffer
High-Speed refrigerated centrifuge	Hitachi	CR22N	for buffer exchange
Leptolyngbya sp. JSC-1			from Dr. Donald A. Bryant at Pennsylvania State University, USA.
Low temperature measurement accessory	Hitachi	5J0-0112	The accessory includes a transparent Dewar container for 77K fluorescence spectroscopy.
Methanol	Merck	1.07018,2511	for Coomassie Blue staining
Microcentrifuge	Thermo Fisher	Pico 21	for PBS extraction
Mini-Beadbeater-16	BioSpec	Model 607	for PBS extraction
Potassium phosphate dibasic	PanReac AppliChem	121512.121	for PBS extraction
Potassium phosphate monobasic	PanReac AppliChem	141509.121	for PBS extraction
Screw cap vial	BioSpec	10832	for PBS extraction
SmartView Pro Imager	Major Science	UVCI-2300	for Znic staining signal detection
Sodium dodecyl sulfate	Zymeset	BSD101	protein loading buffer
Sucrose	Zymeset	BSU101	for PBS isolation
Synechocystis sp. PCC 6803			glucose-tolerant strain from Dr. Chu, Hsiu-An at Academia Sinica, Taiwan
Tris	BioShop	TRS 011.1	protein loading buffer
Triton X-100	BioShop	TRX 506.500	for PBS extraction
Ultra 10 K membrane centrifugal filter	Millipore	UFC901024	for buffer exchange
Ultra 3 K membrane centrifugal filter	Millipore	UFC500324	for buffer exchange
Ultracentrifuge	Hitachi	CP80WX	ultracentrifugation
UV/Vis spectrophotometer	Agilent	Cary 60	Spectrophotometer
Zinc sulfate	PanReac AppliChem	131787.121	for Znic staining
β-Mercaptoethanol	BioBasic	MB0338	protein loading buffer