Efficiënte en kosteneffectieve elektroporatiemethode om primaire ciliumafhankelijke signaalroutes in de granulaatcelprecursor te bestuderen

Summary

Hier presenteren we een reproduceerbaar in vitro elektroporatieprotocol voor genetische manipulatie van primaire cerebellaire korrelcelprecursoren (GCP's) dat kosteneffectief, efficiënt en levensvatbaar is. Bovendien demonstreert dit protocol ook een eenvoudige methode voor de moleculaire studie van primaire cilium-afhankelijke egelsignaleringsroutes in primaire GCP-cellen.

Abstract

Het primaire cilium is een kritisch signaalorganel dat op bijna elke cel wordt aangetroffen en dat Egel (Hh) signaalprikkels van het celoppervlak transduceert. In de granulaatcelvoorloper (GCP) fungeert het primaire cilium als een cruciaal signaleringscentrum dat de proliferatie van voorlopercellen orkestreert door de Hh-signaalroute te moduleren. Het onderzoek van primaire cilium-afhankelijke Hh-signaleringsmachines wordt vergemakkelijkt door in vitro genetische manipulatie van de pathway-componenten om hun dynamische lokalisatie naar het primaire cilium te visualiseren. Transfectie van transgenen in de primaire culturen van GCP's met behulp van de momenteel bekende elektroporatiemethoden is echter over het algemeen kostbaar en resulteert vaak in een lage levensvatbaarheid van cellen en ongewenste transfectie-efficiëntie. Dit artikel introduceert een efficiënt, kosteneffectief en eenvoudig elektroporatieprotocol dat een hoge transfectie-efficiëntie van ~ 80-90% en optimale levensvatbaarheid van de cel aantoont. Dit is een eenvoudige, reproduceerbare en efficiënte genetische modificatiemethode die van toepassing is op de studie van de primaire ciliumafhankelijke egelsignaleringsroute in primaire GCP-culturen.

Introduction

Cerebellaire GCP's worden veel gebruikt om de machinerie van de Hh-signaleringsroute in neuronale voorloperceltypen te bestuderen vanwege hun hoge abundantie en hoge gevoeligheid voor de Hh-signaleringsroute in vivo1,2,3,4. In GCP's fungeert het primaire cilium als een cruciale Hh-signaaltransductiehub5 die de proliferatie van de voorlopercellen orkestreert6,7,8. In vitro visualisatie van Hh-signaleringscomp....

Protocol

Alle diergerelateerde procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor het hanteren van dieren en het protocol dat is goedgekeurd door het ministerie van Volksgezondheid, Hong Kong. Vergunningen voor dierproeven volgens de Animal (Control of Experiments) Ordinance (Cap. 340) werden verkregen van het ministerie van Volksgezondheid, de regering van Hong Kong. Het dierwerk werd uitgevoerd in overeenstemming met de ethiek van de dierveiligheid die is goedgekeurd door het HKBU Research Office en het Laboratory Safety Committee. Raadpleeg de tabel met materialen voor meer informatie over alle materialen die in dit protocol worden gebr....

Results

Met behulp van de Opti-MEM (zie de tabel met materialen) als universeel reagens, zou deze voorgestelde elektroporatiemethodologie een consistent hoge elektroporatie-efficiëntie kunnen bereiken bij ~ 80-90% (figuur 1). De elektroporatie-efficiëntie van de Smo-EGFP-vector werd bepaald bij DIV 2 na elektroporatie door kwantificering van het percentage groene fluorescentiepositieve cellen in alle gepaarde boxeiwit-6 (Pax6)-tot expressie brengende GCP-cellen. De elektroporatie-ef.......

Discussion

Transfectie van transgenen in primaire GCP-cultuur door elektroporatiemethode wordt meestal geassocieerd met een lage levensvatbaarheid van cellen en een slechte transfectie-efficiëntie9,10. Dit artikel introduceert een kosteneffectief en reproduceerbaar elektroporatieprotocol dat een hoge efficiëntie en levensvatbaarheid heeft aangetoond. Daarnaast demonstreren we ook een eenvoudige methode voor het bestuderen van de primaire ciliumafhankelijke Hh-signaleringsro.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
GCP Culture
B27 supplement	Life Technologies LTD	17504044
Cell strainer, 70 µm	Corning	352350
DNase I from bovine pancreas	Roche	11284932001
Earle’s Balanced Salt Solution	Gibco, Life Technologies	14155063
FBS, qualified	Thermo Scientific	SH30028.02
GlutamMAXTM-I ,100x	Gibco, Life Technologies	35050061	L-glutamine substitute
L-cysteine	Sigma Aldrich	C7352
Matrigel	BD Biosciences	354277	Basement membrane matrix
Neurobasal	Gibco, Life Technologies	21103049
Papain,suspension	Worthington Biochemical Corporation	LS003126
Poly-D-lysine Hydrobromide	Sigma Aldrich	P6407
SAG	Cayman Chemical	11914-1	Smoothened agonist
IF staining
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A7906
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
Primary antibody mix
Anti-GFP-goat ab	Rockland	600-101-215	Dilution Factor: 1 : 1000
Anti-Arl13b mouse monoclonal ab	NeuroMab	75-287	Dilution Factor: 1 : 1000
Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab	Covance	PRB-278P	Dilution Factor: 1 : 1000
Secondary antibody mix
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG	Invitrogen	A-11055	Dilution Factor: 1 : 1000
Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG	Invitrogen	A-31570	Dilution Factor: 1 : 1000
Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG	Invitrogen	A-31573	Dilution Factor: 1 : 1000
DAPI	Thermo Scientific	62247	Dilution Factor: 1 : 1000
Electroporation
CU 500 cuvette chamber	Nepagene	CU500
EPA Electroporation cuvette (2 mm gap)	Nepagene	EC-002
Opti-MEM	Life Technologies LTD	31985070	reduced-serum medium for transfection
pEGFP-mSmo	Addgene	25395
Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation	Nepagene	NEPA21	electroporator