Hier presenteren we een reproduceerbaar in vitro elektroporatieprotocol voor genetische manipulatie van primaire cerebellaire korrelcelprecursoren (GCP's) dat kosteneffectief, efficiënt en levensvatbaar is. Bovendien demonstreert dit protocol ook een eenvoudige methode voor de moleculaire studie van primaire cilium-afhankelijke egelsignaleringsroutes in primaire GCP-cellen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Efficiënte en kosteneffectieve elektroporatiemethode om primaire ciliumafhankelijke signaalroutes in de granulaatcelprecursor te bestuderen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het primaire cilium is een kritisch signaalorganel dat op bijna elke cel wordt aangetroffen en dat Egel (Hh) signaalprikkels van het celoppervlak transduceert. In de granulaatcelvoorloper (GCP) fungeert het primaire cilium als een cruciaal signaleringscentrum dat de proliferatie van voorlopercellen orkestreert door de Hh-signaalroute te moduleren. Het onderzoek van primaire cilium-afhankelijke Hh-signaleringsmachines wordt vergemakkelijkt door in vitro genetische manipulatie van de pathway-componenten om hun dynamische lokalisatie naar het primaire cilium te visualiseren. Transfectie van transgenen in de primaire culturen van GCP's met behulp van de momenteel bekende elektroporatiemethoden is echter over het algemeen kostbaar en resulteert vaak in een lage levensvatbaarheid van cellen en ongewenste transfectie-efficiëntie. Dit artikel introduceert een efficiënt, kosteneffectief en eenvoudig elektroporatieprotocol dat een hoge transfectie-efficiëntie van ~ 80-90% en optimale levensvatbaarheid van de cel aantoont. Dit is een eenvoudige, reproduceerbare en efficiënte genetische modificatiemethode die van toepassing is op de studie van de primaire ciliumafhankelijke egelsignaleringsroute in primaire GCP-culturen.
Inleiding
Cerebellaire GCP's worden veel gebruikt om de machinerie van de Hh-signaleringsroute in neuronale voorloperceltypen te bestuderen vanwege hun hoge abundantie en hoge gevoeligheid voor de Hh-signaleringsroute in vivo1,2,3,4. In GCP's fungeert het primaire cilium als een cruciale Hh-signaaltransductiehub5 die de proliferatie van de voorlopercellen orkestreert6,7,8. In vitro visualisatie van Hh-signaleringscomp....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle diergerelateerde procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor het hanteren van dieren en het protocol dat is goedgekeurd door het ministerie van Volksgezondheid, Hong Kong. Vergunningen voor dierproeven volgens de Animal (Control of Experiments) Ordinance (Cap. 340) werden verkregen van het ministerie van Volksgezondheid, de regering van Hong Kong. Het dierwerk werd uitgevoerd in overeenstemming met de ethiek van de dierveiligheid die is goedgekeurd door het HKBU Research Office en het Laboratory Safety Committee. Raadpleeg de tabel met materialen voor meer informatie over alle materialen die in dit protocol worden gebr....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Met behulp van de Opti-MEM (zie de tabel met materialen) als universeel reagens, zou deze voorgestelde elektroporatiemethodologie een consistent hoge elektroporatie-efficiëntie kunnen bereiken bij ~ 80-90% (figuur 1). De elektroporatie-efficiëntie van de Smo-EGFP-vector werd bepaald bij DIV 2 na elektroporatie door kwantificering van het percentage groene fluorescentiepositieve cellen in alle gepaarde boxeiwit-6 (Pax6)-tot expressie brengende GCP-cellen. De elektroporatie-ef.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Transfectie van transgenen in primaire GCP-cultuur door elektroporatiemethode wordt meestal geassocieerd met een lage levensvatbaarheid van cellen en een slechte transfectie-efficiëntie9,10. Dit artikel introduceert een kosteneffectief en reproduceerbaar elektroporatieprotocol dat een hoge efficiëntie en levensvatbaarheid heeft aangetoond. Daarnaast demonstreren we ook een eenvoudige methode voor het bestuderen van de primaire ciliumafhankelijke Hh-signaleringsro.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door HKBU Seed Fund en Tier-2 Start-up Grant (RG-SGT2/18-19/SCI/009), Research Grant Council-Collaborative Research Fund (CRF-C2103-20GF) aan C.H.H. Hor.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| GCP Cultuur | |||
| B27 supplement | Life Technologies LTD | 17504044 | |
| Celzeef, 70 µm | Corning | 352350 | |
| DNase I uit bovien pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Earle’s Balanced Salt Solution | Gibco, Life Technologies | 14155063 | |
| FBS, gekwalificeerd | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| GlutamMAXTM-I,100x | Gibco, Life Technologies | 35050061 | L-glutamine vervanger |
| L-cysteïne | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | Basaalmembraanmatrix |
| Neurobasal | Gibco, Life Technologies | 21103049 | |
| Papaïne, suspensie | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407 | |
| SAG | Cayman Chemical | 11914-1 | Smoothened agonist |
| IF-kleuring | |||
| Rund Serum Albumine | Sigma Aldrich | A7906 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Primaire antilichaammix | |||
| Anti-GFP-geit ab | Rockland | 600-101-215 | Verdunningsfactor: 1 : 1000 |
| Anti-Arl13b muis monoklonaal ab | NeuroMab | 75-287 | Verdunningsfactor: 1 : 1000 |
| Anti-Pax6 konijn polyklonaal ab | Covance | PRB-278P | Verdunningsfactor: 1 : 1000 |
| Secundaire antilichaammix | |||
| Alexa Fluor 488 ezel anti-geit IgG | Invitrogen | A-11055 | Verdunningsfactor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 555 ezel anti-muis IgG | Invitrogen | A-31570 | Verdunningsfactor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 647 ezel anti-konijn IgG | Invitrogen | A-31573 | Verdunningsfactor: 1 : 1000 |
| DAPI | Thermo Scientific | 62247 | Verdunningsfactor: 1 : 1000 |
| Elektroporatie | |||
| CU 500 cuvetkamer | Nepagene | CU500 | |
| EPA Elektroporatie cuvet (2 mm opening) | Nepagene | EC-002 | |
| Opti-MEM | Life Technologies LTD | 31985070 | gereduceerd serum medium voor transfectie |
| pEGFP-mSmo | Addgene | 25395 | |
| Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro en In Vivo Elektroporatie | Nepagene | NEPA21 | elektroporator |
Referenties
- Chang, C. H., et al. Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation. Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).
- Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic Hedgehog regulates the....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
