Generatie van Haak Ischemie-Reperfusie Model met behulp van een driedaagse ontwikkelende kuiken embryo

Summary

Dit artikel beschrijft ischemie-reperfusie (I / R) modellering in een 3-daags kuikenembryo met behulp van een spinale naald aangepaste haak om de I / R-ontwikkeling en -behandeling beter te begrijpen. Dit model is eenvoudig, snel en goedkoop.

Abstract

Ischemie en reperfusie (I / R) aandoeningen, zoals myocardinfarct, beroerte en perifere vaatziekten, zijn enkele van de belangrijkste oorzaken van ziekte en overlijden. Veel in vitro en in vivo modellen zijn momenteel beschikbaar voor het bestuderen van het I/R-mechanisme in ziekte of beschadigde weefsels. Tot op heden is er echter geen in ovo I / R-model gemeld, wat een beter begrip van I / R-mechanismen en snellere screening van geneesmiddelen mogelijk zou maken. Dit artikel beschrijft I / R-modellering met behulp van een spinale naald aangepaste haak in een 3-daags kuikenembryo om I / R-ontwikkelings- en behandelingsmechanismen te begrijpen. Ons model kan worden gebruikt om afwijkingen op DNA-, RNA- en eiwitniveau te onderzoeken. Deze methode is eenvoudig, snel en goedkoop. Het huidige model kan onafhankelijk of in combinatie met bestaande in vitro en in vivo I/R-modellen worden gebruikt.

Introduction

Ischemie-reperfusie weefselbeschadiging is in verband gebracht met een aantal pathologieën, waaronder hartaanvallen, ischemische beroerte, trauma en perifere vaatziekten1,2,3,4,5. Dit is voornamelijk te wijten aan een gebrek aan een uitgebreid begrip van de ziekteprogressie en het ontbreken van een effectief onderzoeksmodel. Ischemische schade treedt op wanneer de bloedtoevoer naar een specifiek deel van het weefsel wordt afgesneden. Als gevolg hiervan necrotiseert ischemisch weefsel uiteindelijk, hoewel de snelheid varieert afhankelijk van het weefsel. Daarom kan het herstellen van de bloedtoevoer helpen om de schade te beperken. In sommige gevallen is echter waargenomen dat reperfusie meer weefselschade veroorzaakt dan ischemie alleen6,7,8. Daarom is het begrijpen van de moleculaire en cellulaire mechanismen van ischemie-reperfusie vereist om een effectieve therapeutische interventie te ontwikkelen. Momenteel is er geen effectieve behandeling voor I/R-letsels bekend. Deze ongelijkheid heeft geleid tot de creatie van nieuwe experimentele modellen, variërend van in vitro tot in vivo modellen, om het bestaande probleem aan te ^{pakken9,10,11,12,13}.

Kuikenembryo's (Gallus gallus domesticus) worden veel gebruikt in onderzoek vanwege hun gemakkelijke toegang, ethische aanvaardbaarheid, relatief grote omvang (in vergelijking met andere embryo's), lage kosten en snelle ^groei14. We gebruikten een kuikenembryo na 72 uur ontwikkeling om een in ovo I / R te creëren door de juiste vitelline-slagader af te sluiten en vrij te geven met behulp van een spinale naald. We noemden het het Hook-I/R ischemie-reperfusiemodel (figuur 1). Het model dat in deze studie wordt gebruikt, is in staat om alle stroomafwaartse processen nauwkeurig te simuleren, inclusief oxidatieve en inflammatoire routes, die vaak worden geassocieerd met I / R-schade15,16,17.

Protocol

De Institutional Animal Ethical Committee van Era's Lucknow Medical College and Hospital heeft een schriftelijke verklaring van afstand afgegeven waarin staat dat er geen formele goedkeuring nodig was om deze experimenten uit te voeren in overeenstemming met het Committee for the Purpose of Control and Supervision of Experiments on Animals (CPCSEA). Standaard operationele procedures werden echter gevolgd om elk potentieel voor embryonale nood te minimaliseren.

1. Buffervoorbereiding (tabel 1)

1. Bereid de oplossing van Ringer voor
   1. Los voor de bereiding van ringeroplossing 0,72 g NaCl (123 mM), 0,017 g _CaCl2 (1,53 mM), 0,037 g KCl (4,96 mM) op in 70 ml steriel gedestilleerd _H2O, met een eindvolume van 100 ml. Stel de pH in op 7,4. Laat het volledig oplossen en autoclaaf. Filter vervolgens door een filter van 0,22 μm, aliquot in hoeveelheden voor eenmalig gebruik (ongeveer 10 ml) en bewaar bij kamertemperatuur.
2. Bereid normale zoutoplossing (0,9% natriumchloride, NaCl).
   1. Los in 70 ml steriel gedestilleerd _H2O 0,9 g NaCl (154 mM) op. Maak het volume aan op 100 ml. Autoclaaf gedurende 15 min bij 121 °C. Stel de pH indien nodig in op 7,4 met 0,1 N HCl of 0,1 N NaOH. Maak 10 ml aliquots in een steriele centrifugebuis van 15 ml en bewaar bij kamertemperatuur.
3. Bereid 70% ethanol (v/v).
   1. Meng 70 ml zuivere ethanol (Mol. wt. 46,07 g/l) tot 30 ml steriel _H2O. Bereid indien nodig voor of bewaar bij kamertemperatuur. Steriliseren is niet nodig.
4. Bereid 1x fosfaatbufferzoutoplossing (1x PBS).
   1. Bereid 100 ml 1x PBS door 0,144 g _Na2HPO4·_7H2O (5,37 mM), 0,8 g NaCl (136,8 mM), 0,2 g KCl (26,8 mM), 0,2 g _KH2PO4 (14, 6 mM) toe te voegen aan 70 ml gedestilleerd water. Los het volume op en vul het aan tot 100 ml en autoclaaf gedurende 15 minuten bij 121 °C. Breng de pH op 7,4 en voeg indien nodig een paar druppels van 0,1 N HCl of 0,1 N NaOH toe. Maak aliquots van 10 ml in een steriele centrifugebuis van 15 ml en bewaar bij kamertemperatuur.

2. Dag 1

1. Schik alle gereedschappen die nodig zijn voor het steriliseren van eieren (70% ethanol, reinigingsdoekjes, een eierrek en een OHP-marker).
2. Reinig de eieren van 0 dagen met 70% ethanol met papieren doekjes. Gebruik alleen een ei van 0 dagen, omdat oudere eieren mogelijk geen aanleiding geven tot een embryo.
3. Schrijf de huidige datum op eieren met een OHP-marker.
4. Leg de eieren in een eierincuse die is ingesteld op een temperatuur van 36-37 °C en een vochtigheidsgraad van 60%-65%. Broed de eieren de volgende 24 uur uit.

3. Dag 2

1. Regel de benodigde apparatuur voor het opzuigen van 5-6 ml albumine (scherpe randschaar, 5 ml spuit, 18 G naald, spuit discarder en plakband).
2. Veeg de chirurgische schaar af met 70% ethanol of steriliseer met een autoclaaf na het afvegen met 70% ethanol.
3. Neem nu het ei uit de 37 °C eierincuse voor gelaagdheid.
4. Leg het ei op een schoon eierrek.
5. Bevestig een klein stukje plakband (grootte: ongeveer 1 inch lengte x breedte) aan de rand van het ei.
6. Maak een klein gaatje in de rand van de eierschaal met een scherppuntige schaar. Plaats een spuit van 5 ml onder een hoek van ongeveer 75°.
   OPMERKING: De spuit van 5 ml wordt geleverd met een naald van 24 G x 1 (steriel), maar het is goed om de naald van 24 G x 1 te vervangen door een naald van 18 G x 1,5 (steriel). De naald van 18 G x 1,5 is 1,25 x 38 mm breed. Daarom zal het de verwijdering van albumine vergemakkelijken.
7. Nadat u de naald in de dooierzak hebt ingebracht, trekt u langzaam 5-6 ml albumine terug.
   OPMERKING: Dit geeft het embryo een bed waarop het kan groeien. Het terugtrekken van albumine voorkomt overspill van albumine tijdens het opzetten van een venster. Ten slotte wordt het risico dat het embryo tijdens het vensteren wordt beschadigd, beperkt door 5-6 ml albumine te elimineren.
8. Na het verwijderen van het albumine, hersluit de opening met plakband en laat de eieren gedurende 48 uur uitbroeden bij 37 °C.

4. Dag 4

1. Bereid de Ringer-oplossing, 0,9% normale zoutoplossing en 1x PBS zoals beschreven in rubriek 1 van het protocol. Autoclaaf vervolgens de drie oplossingen. Plaats na het autoclaveren de betreffende oplossing op kamertemperatuur.
2. Haal het ei uit de 37 °C eierincuse en snijd de schaal in een ronde vorm. Voordat u de eierschaal snijdt, bedek u het te snijden gebied met plakband.
   OPMERKING: Het bedekken van het raamgebied met plakband voorkomt het breken van de eierschaal op ongewenste plaatsen. Als u echter op een ongewenste plaats breekt, sluit u het gebied af met het plakband. Het afdekken van de te snijden plaatsen met plakband voorkomt dat schelpstukken op de dooierzak vallen.
3. Maak een klein gaatje in de eierschaal met een scherppuntige randschaar op de plaats waar de raamopening gewenst is en begin met het snijden van een cirkelvormige opening. Dit proces staat bekend als windowing.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat de cirkelvormige snede groot genoeg is om gemakkelijk toegang te hebben tot het embryo vanuit elke richting. Verander indien nodig de positie van het ei om de positie van het embryo te accommoderen.
4. Zoek vervolgens met behulp van een stereo zoom chirurgische microscoop de juiste vitelline-slagader (RVA).
   OPMERKING: Kippenembryo's ondergaan normaal gesproken thoracale torsie (samen met cervicale flexie, enz.) terwijl ze zich ontwikkelen, zodanig dat de linkerkant van het hoofd tegen de dooier ligt in het 72 uur-stadium. Meer dichtgekit, waar de vitelline-slagaders het lichaam verlaten, is het embryo niet veel gedraaid en ligt dit deel van het lichaam ventrale kant naar beneden in de richting van de dooier. Dus, direct bekijkend, is het recht van het embryo rechts van de onderzoeker.
5. Zodra de RVA is gelokaliseerd, maakt u twee kleine gaatjes aan de linker- en rechterkant van de RVA met behulp van een naald van 26 G (figuur 2).
6. Plaats de Doppler bloedstroombeeldsonde boven de RVA. Zorg ervoor dat de Doppler-bloedstroombeeldvormingssonde op 5 ± 1 mm van de plaats van ischemie en in de richting van het distale uiteinde van de RVA wordt geplaatst. Neem een fluxmeting gedurende 2 min en 30 s (of langer indien gewenst). Dit zal de normoxische fase meting zijn.
7. In de tussentijd, met behulp van een neustang en getande tang, vorm de rand van de spinale naald handmatig in de vorm van een haak (figuur 3). Doe dit door de rand van de spinale naald ongeveer 1 mm te buigen. Een groter formaat maakt het moeilijker om de spinale naald in te brengen en te verwijderen tijdens de I / R-procedure.
8. Breng de spinale naald direct onder de rechter vitelline-slagader in met behulp van een micromanipulator.
   OPMERKING: Plaats de spinale naald met uiterste voorzichtigheid om beschadiging van de RVA of aangrenzende slagaders te voorkomen. De optimale techniek is om de op maat ontworpen haak van de spinale naald precies boven de rechterkant van het RVA-gat aan te passen, gevolgd door het geleidelijk inbrengen van de op maat ontworpen rand van de spinale naald in de dooierzak met behulp van een micromanipulator onder begeleiding van een stereo zoom chirurgische microscoop door het rechtergat. Zodra de haak van de spinale naald zich in de dooierzak bevindt, past u de haak geleidelijk aan onder de RVA aan, zodat de rand precies onder het linkergat wordt geplaatst. Nu is het tijd om de spinale naald op te tillen.
9. Til nu, met behulp van de micromanipulator, geleidelijk de slagader op totdat de Doppler-bloedstroomflux een minimale afname van 80% in de arteriële stroom aangeeft.
10. Zodra een daling van 80% of meer in dopplerflux is bereikt, laat u de spinale naald gedurende 5 minuten opgeheven (de slagader naar boven trekken). Dit wordt de periode van ischemie in de RVA.
    OPMERKING: Het is van cruciaal belang om de Doppler-flux te controleren tijdens de duur van ischemie. Als er een aanzienlijke hoeveelheid fluctuatie wordt gevonden, beëindigt u de tests.
11. Na de ischemieperiode van 5 minuten, laat de slagader geleidelijk los om de normale bloedstroomniveaus te herstellen. Zorg ervoor dat een Doppler-bloedstroommeter waarden weergeeft die vergelijkbaar zijn met die verkregen tijdens normoxie. Dit wordt de periode van reperfusie in de RVA (figuur 4).
12. Breng na de I / R-procedure een paar druppels (2-3) van 1x PBS aan op het embryo en bekijk het gedurende 2-3 minuten.
    OPMERKING: Het gebruik van 1x PBS helpt voorkomen dat het embryo uitdroogt.
13. Sluit ten slotte het raam opnieuw met plakband en plaats het ei gedurende 5 uur en 55 minuten terug in de eierincuse.
14. Neem na 5 uur en 55 minuten het ei uit de eierincuse, plaats het op het eierrek, open het raam en volg het stroomafwaartse behandelingsprotocol.

5. Behandelingen

1. Voor de behandeling van de slagaders met geneesmiddelen, activatoren of remmers, snijdt u de RVA na 1 uur van het I/R-proces weg.
2. Voor de stroomafwaartse onderzoeken verwijdert u eerst het embryo uit de eierschaal door het op een steriele petrischaal van 90 mm te plaatsen.
3. Zodra het embryo in de petrischaal is vrijgegeven, snijdt u de RVA weg met behulp van de oculaire iris onder begeleiding van een stereo zoom chirurgische microscoop.
4. Zorg ervoor dat de excisiemaat van RVA maximaal 15 ± 1 mm (distaal van de stam), 5 ± 1 mm elk aan de linker- en rechterkant van de slagader en 2 ± 1 mm naar de stam.
   OPMERKING: Een liniaal kan worden gebruikt om het te verwijderen gebied te meten (optioneel).
5. Na het uitpakken van de RVA, was het met 1x PBS in een steriel petrischaaltje met 1x PBS.
6. Plaats voor de gewenste behandelingen de slagader in een centrifugebuis van 1,5 ml (gesteriliseerd) gevuld met 500 μL Ringer's oplossing. Plaats de RVA in de centrifugebuis en plaats deze gedurende 5 uur en 55 min in een incubator van 37 °C.
   OPMERKING: Afhankelijk van de behandelingen, gebruik de Ringer's oplossing zonder enige behandeling, of behandeling met het gewenste volume en de gewenste concentratie van geneesmiddel, activator of remmer.
7. Haal na 5 uur en 55 min incubatie de RVA uit de laboratoriumincubator van 37 °C en ga verder met de gewenste behandelingen.

Results

De Doppler Blood Flow Imaging-techniek werd gebruikt om de effectiviteit van ons model te evalueren. Kortom, we vergeleken de gegevens van de controlegroep met de gegevens van de RVA-groep om het succes van onze creatie te bepalen. Figuur 4A toont een typische flux geassocieerd met het controledier, terwijl figuur 4B de resultaten van een RVA weergeeft. Het numerieke 1-8 vertegenwoordigt de verschillende gebeurtenissen die verband houden met I/R-fasen. Kortom, n...

Discussion

Het doel van ischemie-reperfusieonderzoek is om therapeutische strategieën te creëren die celdood voorkomen en herstel ^{bevorderen29,30}. Om de huidige beperkingen in I/R-onderzoek te overwinnen, hebben we een Hook I/R-kuikenembryomodel ontworpen om een betrouwbaar en reproduceerbaar I/R-model te produceren. Voor zover wij weten, is het onze het eerste I / R-model ooit gemaakt in een 3-daags kuikenembryo voor routinematige I / R-experimenten, naast het bestuderen v...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(-80°C) vriezer	Haier, China	-
1.5mL Centrifuge tube	TARSONS, India	500010X
100mm Petri dish (steriele)	Tarsons, India	460050
18G Needle (18G×1.5 (1.25×38mm)	Ramsons, India	13990
1mL Syringe	DISPO VAN	-
26G Needle (26G×1/2 (10.45x13mm)	DISPO VAN, india	30722D
37°C egincubator met instelbare luchtvochtigheidspercentage	Gentek, India	GL-100
37°C laboratorium incubator	SCIENCE TECH, India	CB 101-14
3-Methyladenine (3-MA)	Sigma Aldrich, USA	M9281
3mL Pasture Pipette	TARSONS, India	940050
50mL Beker	TARSONS, India	-
5mL Syringe	DISPO VAN, India	IP53
70% ethanol	Merck Millipore, United States	64-17-5
Kleedband/Cello tape	Sunrise, India	-
Ambra1 primers	Applied Biosystems, Foster city, USA	Hs00387943_m1
Anti-mouse IgG	Cell Signaling Technology, USA	7076S
Anti-Rabbit IgG	Jackson Immuno Research Laboratories, USA	711-035-152
Atg7	R&D Systems, USA	MAB6608
Atg7 primers	Applied Biosystems, Foster city, USA	Hs00893766_m1
Autoclave zak	Tarsons, India	550022
Autoclave Machine	Local made, Lucknow, India	-
Beclin-1	Proteintech, USA	66665-1-Ig
Beta Actin	ImmunoTag, USA	ITT07018
Bovine Serum Albumin	Himedia, Mumbai, India	TC194
Calcium Chloride	Himedia, Mumbai, India	GRM534
Catalase	ImmunoTag, USA	ITT5155
Reinigingsdoekjes	Kimberly-Clark, India	370080
Cleaved Caspase3	ImmunoTag, USA	ITT07022
di-Natriumwaterstoffosfaat heptahydraat	Himedia, Mumbai, India	GRM39611
Doppler bloedstroomsnelheidsmeter	Moors instrument, United Kingdom	moorVMS-LDF1
Eierrek	-	-
Eierrek	-	-
GAPDH	ImmunoTag, USA	M1000110
GAPDH primers	Applied Biosystems, Foster city, USA	Hs02758991_g1
Glycine	Himedia, Mumbai, India	MB013
Nierbekken	HOSPITO	-
LC3A/B	Cell Signaling Technology, USA	4108S
Methanol	Rankem laboratories, Mumbai, India	M0252
Micromanipulator	Narishige, Japan	M-152
N-acetyl-L-cysteïne (NAC)	Sigma Aldrich, USA	A7250
Naringenin	Sigma Aldrich, USA	67604-48-2
NF-kβ	Thermo Fisher Scientific, USA	51-0500
NLRP3	ImmunoTag, USA	ITT07438
Neustang	Local made, Lucknow, India	-
Oculair pincet	Stoelting, Germany	52106-40
Oculair iris	Tufft Surgical Instruments, Jaipur, India	Hard Age Vannas Micro Scissors Angled 8CM / 3 1/8"
OHP markerpen	Camlin, India	-
ORP-150	ImmunoTag, USA	ITT08329
Schaar met puntige scherpe rand	Stoelting, Germany	52132-11
Kaliumchloride	Himedia, Mumbai, India	MB043
Kaliumfosfaat monobasisch anhydrisch	Himedia, Mumbai, India	MB050
Protease-remmer	Abcam, United States	Ab65621
SOD-1	ImmunoTag, USA	ITT4364
Natriumchloride	Fisher Scientific, Mumbai, India	27605
Natriumdodecylsulfaat	Himedia, Mumbai, India	GRM886
Spinale naald 25GA; 3,50 IN (90,51 X 90mm)	Ramson, India	GS-2029
Stereo Zoom chirurgische microscoop	Olympus, Japan	SZ2-STU3
Spuitvernietiger	BIOHAZARD	882210
Tang met tanden	Stoelting, Germany	52102-30
Tris Base	G Biosciences, United States	RC1217
Tris Hydrochloridezuur	Himedia, Mumbai, India	MB030
Tween 20	G Biosciences, United States	RC1227
White Leghorn Chicken 0-daagse eieren	-	-
Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK	MP Biomedicals, LLC, USA	FK009