Methodenartikel

Spatiotemporale subcellulaire manipulatie van het microtubulecytoskelet in het levende pre-implantatiemuismyo met behulp van photostatinen

DOI:

10.3791/63290

⸱

30 november 2021

 ,  ,  ,  , 
1Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University, 2School of BioSciences, The University of Melbourne

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Typische microtubuleremmers, die veel worden gebruikt in fundamenteel en toegepast onderzoek, hebben verstrekkende effecten op cellen. Onlangs ontstonden fototatinen als een klasse van fotoschakelbare microtubuleremmers, in staat tot onmiddellijke, omkeerbare, spatiotemporaal nauwkeurige manipulatie van microtubuli. Dit stapsgewijze protocol beschrijft de toepassing van fototatinen in een 3D live pre-implantatiemuismyo.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het microtubule cytoskelet vormt het raamwerk van een cel en is fundamenteel voor intracellulair transport, celdeling en signaaltransductie. Traditionele farmacologische verstoring van het alomtegenwoordige microtubulinetwerk met behulp van bijvoorbeeld nocodazol kan verwoestende gevolgen hebben voor elke cel. Reversibel fotoschakelbare microtubuleremmers hebben het potentieel om de beperkingen te overwinnen door medicijneffecten op een spatiotemporaal gecontroleerde manier te implementeren. Een dergelijke familie van geneesmiddelen is de op azobenzeen gebaseerde fototatinen (PST's). Deze verbindingen zijn inactief in donkere omstandigheden en bij verlichting met UV-licht binden ze zich aan de colchicine-bindingsplaats van β tubuline en blokkeren ze microtubule polymerisatie en dynamische omzet. Hier is de toepassing van PST's in het 3-dimensionale (3D) levende pre-implantatiemuismyo bedoeld om het microtubulinetwerk op subcellulair niveau te verstoren. Dit protocol biedt instructies voor de experimentele opstelling, evenals lichtactiverings- en deactiveringsparameters voor PST's met behulp van live-cell confocale microscopie. Dit zorgt voor reproduceerbaarheid en stelt anderen in staat om deze procedure toe te passen op hun onderzoeksvragen. Innovatieve fotoschakelaars zoals PST's kunnen evolueren als krachtige hulpmiddelen om het begrip van het dynamische intracellulaire microtubulinetwerk te vergroten en het cytoskelet in realtime niet-invasief te manipuleren. Bovendien kunnen PST's nuttig zijn in andere 3D-structuren zoals organoïden, blastoïden of embryo's van andere soorten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De microtubule-architectuur varieert sterk tussen verschillende celtypen om verschillende functies te ondersteunen 1,2. De dynamische aard van groei en krimp maakt een snelle aanpassing aan extra- en intracellulaire signalen mogelijk en om te reageren op de steeds veranderende behoeften van een cel. Daarom kan het worden beschouwd als de "morfologische vingerafdruk" die een sleutelrol speelt in de cellulaire identiteit.

Farmacologische targeting van het microtubule cytoskelet met behulp van kleine molecuulremmers heeft geleid tot een overvloed aan fundamentele ontdekkingen in ontwikkelingsbiologie, stamcelbiologie, kankerbiologie en neurobiologie 3,4,5,6,7. Deze aanpak, hoewel onmisbaar, brengt verschillende beperkingen met zich mee, zoals toxiciteit en off-target effecten. Een van de meest gebruikte microtubule-targeting middelen, nocodazol, is bijvoorbeeld een krachtig microtubule-depolymeriserend medicijn8. Kleine-molecuulremmers zoals nocodazol zijn echter actief vanaf het moment van toepassing en, gezien de essentiële aard van het microtubule cytoskelet voor veel kritieke cellulaire functies, kan wereldwijde depolymerisatie van microtubuli off-target effecten veroorzaken, die mogelijk ongeschikt zijn voor veel toepassingen. Bovendien is de behandeling met nocodazol onomkeerbaar, tenzij monsters vrij van het geneesmiddel worden gewassen, waardoor continue live beeldvorming en dus nauwkeurige tracking van individuele microtubulifilamenten wordt voorkomen.

De ontwikkeling van lichtgeactiveerde verbindingen begon met de creatie van foto-onopgeloste moleculen en heeft een nieuw tijdperk ingeluid in het richten en monitoren van de effecten van microtubuligroeiremming op een nauwkeurige en spatiotemporaal gecontroleerde manier. Een familie van reversibel fotoschakelbare geneesmiddelen, fototatinen (PST's), werden ontwikkeld door de stilbeencomponent van combretastatine A-4 te vervangen door azobenzeen9. PST's zijn inactief tot verlichting met UV-licht, waarbij de inactieve transconfiguratie wordt omgezet in de actieve cis-configuratie door omkeerbare isomerisatie. Cis-PST's remmen de polymerisatie van microtubuli door zich te binden aan de colchicine-bindingsplaats van β-tubuline, waardoor de interface met β-tubuline wordt geblokkeerd en dimerisatie wordt voorkomen die nodig is voor de groei van microtubuli10. Onder een cohort van PST's is PST-1P naar voren gekomen als een loodverbinding omdat het de hoogste potentie heeft, volledig in water oplosbaar is en een snel begin van bioactiviteit vertoont na verlichting.

De meest effectieve trans- naar cis-isomerisatie van PST's vindt plaats op golflengten tussen 360-420 nm, wat dubbele opties voor PST-activering mogelijk maakt. Een 405 nm laserlijn op een typische confocale microscoop kan worden toegediend voor een optimale ruimtelijke targeting van microtubuligroeiremming. De mogelijkheid om de locatie en timing van PST-activering te lokaliseren door middel van 405 nm laserverlichting vergemakkelijkt nauwkeurige temporele en ruimtelijke controle, waardoor verstoring van de microtubuledynamica op subcellulair niveau mogelijk is, binnen subseconde respons maal9. Als alternatief zorgt een betaalbaar LED UV-licht ervoor dat de verlichting van het hele organisme de microtubule-architectuur in het hele organisme verstoort. Dit kan een kosteneffectief alternatief zijn voor onderzoekers voor wie het nauwkeurig getimede begin van remming, in plaats van ruimtelijke targeting, het doel is. Een ander kenmerk van PST's is hun on-demand inactivatie door groen licht toe te passen van een golflengte in het bereik van 510-540 nm9. Dit maakt het traceren van microtubule filamenten voor, tijdens en na PST-gemedieerde groeiremming mogelijk.

PST's, hoewel nog steeds een relatief recent ontwerp, zijn gebruikt in tal van in vitro toepassingen op verschillende onderzoeksgebieden11, waaronder onderzoek naar nieuwe mechanismen van celmigratie in amoeboïden12, in neuronen geïsoleerd uit de hersenen van de pasgeboren muis13, en vleugelepitheelontwikkeling in Drosophila melanogaster14 . Andere lichtreactieve geneesmiddelen hebben bewezen waardevolle hulpmiddelen te zijn bij gerichte verstoring van de cellulaire functie. Een analoog van blebbistatine, azidoblebbistatine, werd bijvoorbeeld gebruikt voor verbeterde myosineremming onder verlichting15,16. Dit benadrukt het potentieel voor nieuwe ontdekkingen als gevolg van het vermogen tot spatiotemporaal gecontroleerde remming van de cellulaire functie.

Levende 3D-organismen presenteren prachtige maar delicatere systemen om microtubulidynamica te manipuleren op een heel dier,eencellig of subcellulair niveau onder fysiologische omstandigheden. Met name het pre-implantatie muizenembryo biedt uitzonderlijk inzicht in de innerlijke werking van de cel en intercellulaire relaties binnen een organisme17. Temporeel en ruimtelijk gerichte opeenvolgende cycli van activering en deactivering van PST's droegen bij aan de karakterisering van de interfasebrug, een post-cytokinetische structuur tussen cellen, als een niet-centrosomaal microtubuliorganiserend centrum in het pre-implantatiemuismyo16. Een vergelijkbare experimentele opstelling toonde de betrokkenheid van groeiende microtubuli bij de afdichting van het muizenembryo om blastocystvorming18 mogelijk te maken. Bovendien werden PST's ook gebruikt in hele zebravisembryo's om neuronale celmigratie te onderzoeken door de groei van microtubuli in een subset van cellen in de achterhersenente remmen 19.

Dit protocol beschrijft de experimentele opstelling en het gebruik van PST-1P in het pre-implantatiemuismyo. De instructies die hier worden gepresenteerd, kunnen ook de toepassing van PST's begeleiden voor een breed scala aan doelstellingen, zoals het bestuderen van chromosoomsegregatie en celdeling, handel in intracellulaire lading en celmorfogenese en migratie. Bovendien zullen dergelijke studies de implementatie van PST's in organoïde systemen, blastoïden en andere embryomodellen zoals Caenorhabditis elegans en Xenopus laevis helpen, evenals mogelijk het gebruik van PST's voor in-vitrofertilisatietechnologieën uitbreiden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Experimenten werden goedgekeurd door de Monash Animal Ethics Committee onder dierethiek nummer 19143. Dieren werden gehuisvest in specifieke pathogeenvrije dierhuisomstandigheden in de dierenfaciliteit (Monash Animal Research Platform) in strikte overeenstemming met ethische richtlijnen.

1. Pre-implantatie muizenembryoverzameling

  1. Superovuleren en paren muizen zoals eerder beschreven 16,18, in overeenstemming met de institutionele ethische richtlijnen voor dieren.
    OPMERKING: De meest gebruikte stammen voor het verzamelen van levende embryo's zijn C57BL/6- of FVB/N-muizen. Alle hier getoonde gegevens zijn gegenereerd met behulp van FVB/N-muizen.
  2. Spoel op de ochtend na de paring zygoten uit de eileider met behulp van M2-medium zoals beschreven20, of Human Tubal Fluid (HTF) medium. Breng met behulp van een mondpipetapparaat zoals beschreven21,22 zygoten over op verse Kalium Simplex Optimised Medium (KSOM) druppels, voorgewarmd tot 37 °C en gebalanceerd tot 5% CO2, in een 35 mm kweekschaal bedekt met een voldoende volume minerale olie om media-aandacht te garanderen.
  3. Micro-inject zygoten zoals beschreven20 met cRNA-codering voor een rode fluorescerend gelabelde microtubuli plus eindmarker. Hier werd cRNA voor het eindbindende eiwit 3 (EB3)-dTomato gebruikt bij een concentratie van 30 ng/μL na bereiding en zuivering zoals beschreven16,18 en verdunning in micro-injectiebuffer.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om cRNA van tevoren te bereiden en het bij -20 °C te bewaren totdat het nodig is.
  4. Kweek embryo's in het donker bij 37 °C en 5% CO2 totdat embryo's het gewenste ontwikkelingsstadium voor PST-1P-behandeling hebben bereikt.
    OPMERKING: Voor een uitgebreide bron van de kweektijden die nodig zijn voor verschillende embryonale stadia, zie23. Voor 16-cel stadium embryo's die hier worden gebruikt, kweek tot embryonale dag 3 (E3) na de bevruchting.

2. Bereiding van geneesmiddelen en beeldvormingsgerechten

OPMERKING: Voor stappen 2.1-2.10 moet u uitsluitend in het donker of rood licht werken om onbedoelde PST-1P-activering te voorkomen. Aluminiumfolie of donkere hoezen moeten worden gebruikt voor alle buizen en schalen die PST's bevatten.

  1. Bereid een voorraadconcentratie van 50 mM PST-1P in ultrapuur water.
    OPMERKING: Het molecuulgewicht van PST-1P is 440 g/mol. De stamoplossing is stabiel bij -20 °C gedurende maximaal 1 jaar. PST-1P is oplosbaar in water of waterige buffer, maar lost niet gemakkelijk op in DMSO.
  2. Bereid vanaf stap 2.1 een tussenliggende werkconcentratie van 800 μM PST-1P in ultrapuur water.
  3. Verdun PST-1P tot een eindconcentratie van 40 μM in vers KSOM. Aangezien een typisch experiment ongeveer 20 μL PST-1P-behandelde KSOM vereist, verdun 1 μL van 800 μM PST-1P in 19 μL KSOM voor een eindvolume van 20 μL om ervoor te zorgen dat er van tevoren voldoende medium wordt bereid, met alleen rood licht voor zichtbaarheid.
    OPMERKING: Zowel de concentratie als de activeringsstatus van een PST-1P-verdunning kunnen worden gecontroleerd door een UV-Vis-absorptiespectrum te nemen met behulp van een spectrofotometer, wat moet worden gedaan tijdens het opzetten van de test. De absorptie bij 380 nm (A380) van een volledig trans 40 μM verdunning in een cuvette van 1 cm moet ongeveer 0,8 zijn. Zowel cis- als transvormen hebben dezelfde absorptie bij 455 nm (A455). Wanneer de verhouding van de A380 tot de A455 ongeveer 9:1 is, is de verdunning inactief (volledig trans). Wanneer de verhouding A380:A455 1:2 is, wordt de verdunning volledig geactiveerd (volledig cis). Intermediaire verhoudingen weerspiegelen tussenliggende toestanden van activering.
  4. Om de kamerdia voor te bereiden op live beeldvorming, pipetteer 10 μL PST-1P-behandelde KSOM in het midden van één put om een hemisferische druppel te vormen (figuur 1A).
  5. Voeg voorzichtig voldoende minerale olie toe om de druppel te bedekken, zodat deze de media niet dispergeert. Dit zorgt ervoor dat de druppel niet verdampt.
  6. Verwarm en CO2-evenwicht de kamerschuifschaal in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 gedurende minimaal 3 uur of maximaal een nacht.
  7. Bereid aan het einde van de equilibratieperiode in stap 2.6 een kweekschaal van 35 mm met een 10 μL druppel PST-1P-behandelde, voorgewarmde en gebalanceerde KSOM als wasstap. Niet bedekken met olie.
  8. Breng embryo's via de mondpipetitie over in de met PST-1P behandelde KSOM-druppel uit stap 2.7.
    OPMERKING: Stappen 2.7 en 2.8 worden aanbevolen voor het pipetteren in de mond van embryo's, maar zijn optioneel.
  9. Breng embryo's onmiddellijk via de mondpipetitie terug in het midden van de met PST-1P behandelde KSOM-druppel in de beeldvormingskamerdia die is voorbereid in stappen 2.4-2.6 (figuur 1A).
  10. Incubeer embryo's bij 37 °C en 5% CO2 in PST-1P-behandelde KSOM in de beeldvormingskamerdia gedurende ten minste 1 uur vóór de beeldvorming. Monteer de kamerglaasjes indien mogelijk op de microscoop in een omgevingskamer bij 37 °C en 5% CO2, en in volledige duisternis om ervoor te zorgen dat alle PST-1P's zich in de inactieve transconfiguratie bevinden en dat embryo's naar de bodem van de schaal kunnen zinken.

3. Live imaging en PST-1P fotoactivatie

OPMERKING: Stappen 3.1-3.13 worden uitgevoerd op een confocale laserscanmicroscoop uitgerust met lawinefotodiodedetectoren (APD's) en een donkere omgevingskamer. Deze instructies hebben specifiek betrekking op de beeldvormingsopstelling met behulp van de acquisitiesoftware die wordt beschreven in de Tabel met materialen; ze kunnen echter ook worden toegepast op andere confocale microscopiesystemen.

  1. Bereid een 63x/1.2 NA waterolie-onderdompelingsdoel voor met het voorgeschreven onderdompelingsmedium.
  2. Gebruik een roodlichtlamp om de positionering te begeleiden en het doel te bereiken om contact te maken met het onderdompelingsmedium. Vermijd in dit stadium het gebruik van wit of helder veldlicht om de embryo's te vinden, omdat dit PST-1P vroegtijdig kan activeren.
  3. Gebruik het oculair en onder roodlichtverlichting, lokaliseer de rand van de druppel medium en plaats het objectief direct boven deze locatie. Dit kan de gebruiker helpen om de oriëntatie vast te stellen en het brandpuntsvlak te vinden.
  4. Gebruik vervolgens via het oculair of op software-enabled live-mode scanning een rood golflengtefilter of 561 nm laser om de embryo's in de druppel te lokaliseren.
  5. Gebruik stagecontrollers en live-scanmodus om de begin- en eindpunten in te stellen voor het verkrijgen van een z-stack van het hele embryo.
  6. Pas de laservermogensinstellingen aan (meestal is bij zeer gevoelige detectoren zoals de APD's een laservermogen van 561 nm van minder dan 5% voldoende), digitale offset (meestal bij -0,900) om het uiterlijk van EB3-dTomato-kometen te optimaliseren en achtergrondgeluid te minimaliseren, pinhole bij 2 μm, pixelresolutie van 512 x 512 en pixelverblijftijd van 3,15 μs.
  7. Verkrijg een z-stack van het hele embryo met intervallen van 1 μm sectie om gebieden met microtubulegroei in het hele organisme te beoordelen (figuur 1B).
  8. Gebruik de 3D z-stack-afbeelding uit stap 3.7 om interessante regio's (ROI's) te identificeren voor EB3-dTomato-trackingexperimenten. Verhoog de zoom tot 3x en teken een rechthoekige ROI rond het specifieke subcellulaire interessegebied.
  9. Verkrijg een time-lapse-film van een enkel z-vlak met behulp van de typische waarden van beeldparameters: 561 nm laservermogen bij 5%, digitale offset van -0,900, pixelresolutie van 512 x 512, pinhole bij 3 μm, pixel dwell-tijd van 3,15 μs, zoom van 3x, tijdsinterval van 500 ms.
    OPMERKING: 120 tijdframes bieden een trackingfilm van 1 minuut en zouden voldoende moeten zijn voor gegevensanalyse. De overname kan langer doorgaan, mits het bleken van de fluorofoor minimaal is (figuur 1C).
  10. Om PST-1P te activeren, schakelt u over naar een 405 nm-laser en krijgt u nog een time-lapse-film met de 405 nm-laser ingesteld op 10% vermogen, pixelresolutie van 512 x 512, pinhole maximaal geopend, pixelverblijftijd van 3,15 μs, zoom van 3x, tijdsinterval van 500 ms en een totaal van 20 frames (figuur 1D).
  11. Schakel terug naar 561 nm laser en herhaal acquisitie zoals in stap 3.9 om het verlies van EB3-dTomato-kometen na activering van PST-1P te bevestigen (Figuur 1E). Zorg ervoor dat deze overname zo snel mogelijk na activering plaatsvindt.
    OPMERKING: Stap 3.10 kan herhaaldelijk worden uitgevoerd voor langere remming van EB3-dTomato-kometen. Embryo's moeten echter zorgvuldig worden gecontroleerd om schade door UV-licht te voorkomen.
  12. Om PST-1P terug te brengen naar de inactieve trans-toestand, schakelt u een 514 nm laser in op 10% vermogen. Koop een time-lapse-film met de 514 nm-laser ingesteld op 10% vermogen, pixelresolutie van 512 x 512, pinhole maximaal geopend, pixelverblijftijd van 3,15 μs, zoom van 3x, tijdsinterval van 500 ms en in totaal 20 tijdframes (figuur 1F).
  13. Herhaal stap 3.11 om het herstel van EB3-dTomato-kometen te visualiseren (figuur 1G).

4. Analyse van beeldgegevens

  1. Voor het analyseren en kwantificeren van de remming van microtubule polymerisatie door PST's, gebruik softwareprogramma's die beschikbaar zijn voor onderzoekers om aan hun specifieke behoeften te voldoen. Degenen die worden aanbevolen voor gebruik, beschikken over een trackingtool, die handmatig of automatisch de beweging, richting en snelheid van EB3-dTomato-kometen 16,18 kan volgen.

figure-protocol-1
Figuur 1: Schematische weergave van PST-1P fotoactivatie en deactivering in het levende 3D pre-implantatie muizenembryo. Alle experimenten worden uitgevoerd in volledige duisternis (zwarte achtergrond) of alleen door roodlichtverlichting. (A) Levende pre-implantatiemuismyo's die EB3-dTomato tot expressie brengen, worden gekweekt in het 16-celstadium en vervolgens overgebracht naar een druppel KSOM met 40 μM PST-1P in een beeldvormingskamerdia. (B) Een 3D-beeld van het hele embryo maakt de beoordeling van de groei van microtubuli mogelijk door de verdeling van EB3-dTomato-kometen te visualiseren. (C) Om het experiment te starten, worden EB3-dTomato-kometen gevolgd in een subcellulair gebied met behulp van time-lapse beeldvorming. (D) Daaropvolgende PST-1P-fotoactivatie in hetzelfde subcellulaire gebied met behulp van een 405 nm-laser resulteert in het verlies van EB3-dTomato-kometen (E). Geïntensiveerde PST-1P-activering kan, indien nodig, worden geïmplementeerd door sequentiële 405 nm lichtverlichting. (F-G) Om PST-1P terug te brengen naar zijn inactieve toestand en EB3-dTomato-kometen te herstellen, wordt een 514 nm-laser toegepast op hetzelfde subcellulaire gebied. Indien nodig kunnen meerdere foto-activerings- en deactiveringsrondes worden uitgevoerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In overeenstemming met het protocol werden pre-implantatiemuismyo's micro-geïnjecteerd met cRNA voor EB3, gelabeld met rood fluorescerend dTomato (EB3-dTomato). Dit maakt de visualisatie van groeiende microtubuli mogelijk terwijl EB3 zich bindt aan polymeriserende microtubuli plus uiteinden24.

De experimenten werden 3 dagen na de bevruchting (E3) uitgevoerd wanneer het muizenembryo uit 16 cellen bestaat. Elke andere pre-implantatie ontwikkelingsstadium kan worden gebrui...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het microtubulinetwerk is een integraal onderdeel van de fundamentele innerlijke werking van een cel. Bijgevolg biedt dit uitdagingen bij het manipuleren van microtubulidynamica in levende organismen, omdat elke verstoring van het netwerk de neiging heeft wijdverspreide gevolgen te hebben voor alle aspecten van de cellulaire functie. De opkomst van fotoschakelbare microtubule-targeting verbindingen biedt een manier om het cytoskelet nauwkeurig te manipuleren op een subcellulair niveau, met superieure controle voor de ind...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerend of financieel belang te hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen Dr. Oliver Thorn-Seshold en Li Gao bedanken voor het verstrekken van fototatines en advies over manuscriptvoorbereiding, Monash Production voor filmondersteuning en Monash Micro Imaging voor microscopie-ondersteuning.

Dit werk werd ondersteund door de National Health and Medical Research Council (NHMRC) projectsubsidie APP2002507 aan J.Z. en de Canadian Institute for Advanced Research (CIFAR) Azrieli Scholarship aan J.Z. Het Australian Regenerative Medicine Institute wordt ondersteund door subsidies van de staatsregering van Victoria en de Australische regering.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AspiratiebuisSigma-AldrichA5177Voor mond-aspiratieapparaat
Chamber slides - LabTekThermo Fisher ScientificNUN155411
cRNA coderend voor EB3-dTomatoN/AN/ABereid volgens de instructies van de fabrikant met behulp van mMessage in vitro Transcriptiekit
Kweekschalen - 35mmThermo Fisher Scientific150560
Humaan choriongonadotrofineSigma-AldrichC8554
Human Tubal Fluid (HTF) mediumCosmo-BioCSR-R-B071
Imaris Image Analysis SoftwareBitplane
Dompelolie W 2010Carl Zeiss444969-0000-000Voor gebruik met microscoopdoel met dompeling
LED-zaklamp - Rood lichtCelestron93588
M2 mediumSigma-AldrichM7167
Muizen - wild-type FVB/N, mannetjes en vrouwtjesN/AN/AVrouwtjes 8-9 weken oud. Mannetjes 2-6 maanden oud.
Microcapillaire pipetten - KimbleSigma-AldrichZ543306Voor mond-aspiratieapparaat
Micro-injectie bufferN/AN/A5 mM Tris, 5 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, pH 7,4
Mineraal olieOrigioART-4008-5P
mMessage In vitro TranscriptiekitThermo Fisher ScientificAM1340
NanoDrop SpectrofotometerThermo Fisher Scientific
Potassium Simplex Optimal Medium (KSOM) mediumCosmo-BioCSR-R-B074
Pregnant mare serum gonadotrofineProspec BioHOR-272
PST-1PN/AN/ABorowiak, M. et al., Photoswitchable Inhibitors of Microtubule Dynamics Optically Control Mitosis and Cell Death. Cell. 162 (2), 403-411, doi:10.1016/j.cell.2015.06.049, (2015).
RNA-zuiveringskitSangonB511361-0100
Ultrapuur waterSigma-AldrichW1503
ZEN Black SoftwareCarl Zeiss

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hawdon, A., Aberkane, A., Zenker, J. Microtubule-dependent subcellular organisation of pluripotent cells. Development. 148 (20), (2021).
  2. Sanchez, A. D., Feldman, J. L. Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites. Current Opinion in Cell Biology. 44, 93-101 (2017).
  3. Galli, M., Morgan, D. O. Cell size determines the strength of the spindle assembly checkpoint during embryonic development. Developmental Cell. 36 (3), 344-352 (2016).
  4. Vazquez-Diez, C., Paim, L. M. G., FitzHarris, G. Cell-size-independent spindle checkpoint failure underlies chromosome segregation error in mouse embryos. Current Biology. 29 (5), 865-873 (2019).
  5. Baudoin, J. P., Alvarez, C., Gaspar, P., Metin, C. Nocodazole-induced changes in microtubule dynamics impair the morphology and directionality of migrating medial ganglionic eminence cells. Developmental Neuroscience. 30 (1-3), 132-143 (2008).
  6. Munz, F., et al. Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment. Scientific Reports. 8 (1), 312(2018).
  7. Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
  8. Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro. Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).
  9. Borowiak, M., et al. Photoswitchable inhibitors of microtubule dynamics optically control mitosis and cell death. Cell. 162 (2), 403-411 (2015).
  10. Gaspari, R., Prota, A. E., Bargsten, K., Cavalli, A., Steinmetz, M. O. Structural basis of cis- and trans-Combretastatin binding to tubulin. Chem. 2 (1), 102-113 (2017).
  11. Thorn-Seshold, O., Meiring, J. Photocontrolling microtubule dynamics with photoswitchable chemical reagents. ChemRxiv. , (2021).
  12. Kopf, A., et al. Microtubules control cellular shape and coherence in amoeboid migrating cells. Journal of Cell Biology. 219 (6), 201907154(2020).
  13. Sawada, M., et al. PlexinD1 signaling controls morphological changes and migration termination in newborn neurons. The EMBO Journal. 37 (4), 97404(2018).
  14. Singh, A., et al. Polarized microtubule dynamics directs cell mechanics and coordinates forces during epithelial morphogenesis. Nature Cell Biology. 20 (10), 1126-1133 (2018).
  15. Kepiro, M., et al. Azidoblebbistatin, a photoreactive myosin inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (24), 9402-9407 (2012).
  16. Zenker, J., et al. A microtubule-organizing center directing intracellular transport in the early mouse embryo. Science. 357 (6354), 925-928 (2017).
  17. White, M. D., Zenker, J., Bissiere, S., Plachta, N. Instructions for assembling the early mammalian embryo. Developmental Cell. 45 (6), 667-679 (2018).
  18. Zenker, J., et al. Expanding actin rings zipper the mouse embryo for blastocyst formation. Cell. 173 (3), 776-791 (2018).
  19. Theisen, U., et al. Microtubules and motor proteins support zebrafish neuronal migration by directing cargo. Journal of Cell Biology. 219 (10), 201908040(2020).
  20. Rulicke, T. Pronuclear microinjection of mouse zygotes. Methods in Molecular Biology. 254, 165-194 (2004).
  21. Greaney, J., Subramanian, G. N., Ye, Y., Homer, H. Isolation and in vitro culture of mouse oocytes. Bio-protocol. 11 (15), 4104(2021).
  22. Subramanian, G. N., et al. Oocytes mount a noncanonical DNA damage response involving APC-Cdh1-mediated proteolysis. Journal of Cell Biology. 219 (4), 201907213(2020).
  23. Mihajlovic, A. I., Bruce, A. W. The first cell-fate decision of mouse preimplantation embryo development: integrating cell position and polarity. Open Biology. 7 (11), 170210(2017).
  24. Roostalu, J., et al. The speed of GTP hydrolysis determines GTP cap size and controls microtubule stability. Elife. 9, 51992(2020).
  25. Gao, L., et al. In vivo photocontrol of microtubule dynamics and integrity, migration and mitosis, by the potent GFP-imaging-compatible photoswitchable reagents SBTubA4P and SBTub2M. BioRxiv. bioRxiv. , (2021).
  26. Tichy, A. M., Gerrard, E. J., Legrand, J. M. D., Hobbs, R. M., Janovjak, H. Engineering strategy and vector library for the rapid generation of modular light-controlled protein-protein interactions. Journal of Molecular Biology. 431 (17), 3046-3055 (2019).
  27. van Haren, J., Adachi, L. S., Wittmann, T. Optogenetic control of microtubule dynamics. Methods in Molecular Biology. 2101, 211-234 (2020).
  28. Adikes, R. C., Hallett, R. A., Saway, B. F., Kuhlman, B., Slep, K. C. Control of microtubule dynamics using an optogenetic microtubule plus end-F-actin cross-linker. Journal of Cell Biology. 217 (2), 779-793 (2018).
  29. Kogler, A. C., et al. Extremely rapid and reversible optogenetic perturbation of nuclear proteins in living embryos. Developmental Cell. 56 (16), 2348-2363 (2021).
  30. Maghelli, N., Tolic-Norrelykke, I. M. Laser ablation of the microtubule cytoskeleton: setting up and working with an ablation system. Methods in Molecular Biology. 777, 261-271 (2011).
  31. Bukhari, S. N. A., Kumar, G. B., Revankar, H. M., Qin, H. L. Development of combretastatins as potent tubulin polymerization inhibitors. Bioorganic Chemistry. 72, 130-147 (2017).
  32. Gilazieva, Z., Ponomarev, A., Rutland, C., Rizvanov, A., Solovyeva, V. Promising applications of tumor spheroids and organoids for personalized medicine. Cancers (Basel). 12 (10), 2727(2020).
  33. Scherer, K. M., et al. Three-dimensional imaging and uptake of the anticancer drug combretastatin in cell spheroids and photoisomerization in gels with multiphoton excitation. Journal of Biomedical Optics. 20 (7), 78003(2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Spatiotemporele manipulatielive cell imagingconfocale microscopiemicrotubuli polymerisatieEB3 dTomato trackingfotoschakelbare remmers

Gerelateerde artikelen