Assemblage en karakterisering van een externe driver voor het genereren van sub-kilohertz oscillerende stroming in microkanalen

Summary

Het protocol demonstreert een handige methode om harmonische oscillerende stroom van 10-1000 Hz in microkanalen te produceren. Dit wordt uitgevoerd door een computergestuurd luidsprekermembraan op een modulaire manier aan het microkanaal te koppelen.

Abstract

Microfluïdische technologie is een standaardinstrument geworden in chemische en biologische laboratoria voor zowel analyse als synthese. De injectie van vloeibare monsters, zoals chemische reagentia en celculturen, wordt voornamelijk bereikt door gestage stromen die meestal worden aangedreven door spuitpompen, zwaartekracht of capillaire krachten. Het gebruik van complementaire oscillerende stromen wordt zelden overwogen in toepassingen, ondanks de vele voordelen zoals onlangs aangetoond in de literatuur. De aanzienlijke technische barrière voor de implementatie van oscillerende stromen in microkanalen is waarschijnlijk verantwoordelijk voor het ontbreken van de wijdverspreide toepassing ervan. Geavanceerde commerciële spuitpompen die oscillerende stroom kunnen produceren, zijn vaak duurder en werken alleen voor frequenties minder dan 1 Hz. Hier wordt de assemblage en werking van een goedkoop, plug-and-play luidsprekergebaseerd apparaat gedemonstreerd dat oscillerende stroom in microkanalen genereert. Hifi harmonische oscillerende stromen met frequenties variërend van 10-1000 Hz kunnen worden bereikt, samen met onafhankelijke amplituderegeling. Amplitudes variërend van 10-600 μm kunnen worden bereikt over het hele werkingsbereik, inclusief amplitudes > 1 mm bij de resonantiefrequentie, in een typisch microkanaal. Hoewel de oscillatiefrequentie wordt bepaald door de luidspreker, illustreren we dat de oscillatieamplitude gevoelig is voor vloeistofeigenschappen en kanaalgeometrie. In het bijzonder neemt de oscillatieamplitude af met toenemende kanaalcircuitlengte en vloeistofviscositeit, en daarentegen neemt de amplitude toe met toenemende dikte en lengte van de luidsprekerbuis. Bovendien vereist het apparaat geen voorafgaande functies die op het microkanaal moeten worden ontworpen en is het gemakkelijk afneembaar. Het kan gelijktijdig worden gebruikt met een constante stroom die wordt gecreëerd door een spuitpomp om pulsatiele stromen te genereren.

Introduction

De nauwkeurige regeling van het vloeistofdebiet in microkanalen is cruciaal voor lab-on-a-chip-toepassingen zoals druppelproductie en inkapseling¹, mengen ^2,3 en het sorteren en manipuleren van zwevende deeltjes ^4,5,6,7. De meest gebruikte methode voor debietregeling is een spuitpomp die sterk gecontroleerde constante stromen produceert die een vast volume vloeistof of een vast debiet afgeven, vaak beperkt tot volledig unidirectioneel debiet. Alternatieve strategieën voor het produceren van unidirectionele stroming omvatten het gebruik van gravitationele kop⁸, capillaire krachten⁹ of elektro-osmotische stroom¹⁰. Programmeerbare spuitpompen maken een tijdsafhankelijke bidirectionele regeling van debieten en afgegeven volumes mogelijk, maar zijn beperkt tot responstijden van meer dan 1 s vanwege de mechanische traagheid van de spuitpomp.

Flow control op kortere tijdschalen ontsluit een overvloed aan 6,11,12,13,14,15 aan anders ontoegankelijke mogelijkheden als gevolg van kwalitatieve veranderingen in de stromingsfysica. De meest praktische manier om deze gevarieerde stromingsfysica te benutten is door middel van akoestische golven of oscillerende stromen met tijdsperioden variërend van ^10-1- ^10-9 s of 10¹ -10⁹ Hz. Het hogere uiteinde van dit frequentiebereik is toegankelijk met behulp van bulk akoestische golf (BAW; 100 kHz-10 MHz) en oppervlakte akoestische golf (SAW; 10 MHz-1 GHz) apparaten. In een typisch BAW-apparaat worden het hele substraat en de vloeistofkolom getrild door een spanningssignaal toe te passen over een gebonden piëzo-elektrisch. Dit maakt relatief hoge doorvoersnelheden mogelijk, maar resulteert ook in verwarming bij hogere amplitudes. In SAW-apparaten wordt de vaste-vloeistofinterface echter oscillerend door spanning toe te passen op een paar interdigitated elektroden met een patroon op een piëzo-elektrisch substraat. Door de zeer korte golflengten (1 μm-100 μm) kunnen deeltjes zo klein als 300 nm nauwkeurig worden gemanipuleerd door de drukgolf die in SAW-apparaten wordt gegenereerd. Ondanks het vermogen om kleine deeltjes te manipuleren, zijn SAW-methoden beperkt tot lokale deeltjesmanipulatie, omdat de golf snel verzwakt met de afstand tot de bron.

Bij het frequentiebereik van 1-100 kHz worden oscillerende stromen meestal gegenereerd met behulp van piëzo-elementen die zijn gebonden aan een polydimethylsiloxaan (PDMS) microkanaal boven een ontworpen holte^16,17. Het PDMS-membraan boven de patroonholte gedraagt zich als een trillend membraan of trommel die de vloeistof in het kanaal onder druk zet. Bij dit frequentiebereik is de golflengte groter dan de kanaalgrootte, maar de oscillatiesnelheidsamplitudes zijn klein. Het meest bruikbare fenomeen in dit frequentieregime is het genereren van akoestische / viskeuze stroomstromen, die worden gerectificeerde gestage stromen veroorzaakt door niet-lineariteit inherent aan de stroom van vloeistoffen met traagheid¹⁸. De gestage stroomstromen manifesteren zich meestal als snelle tegengesteld draaiende wervelingen in de buurt van obstakels, scherpe hoeken of microbellen. Deze wervelingen zijn nuttig voor het mengen van^19,20 en het scheiden van deeltjes ter grootte van 10 μm van de stroomstroom²¹.

Voor frequenties in het bereik van 10-1000 Hz zijn zowel de snelheid van de oscillerende component als de bijbehorende gestage viskeuze streaming aanzienlijk in omvang en nuttig. Sterke oscillerende stromen in dit frequentiebereik kunnen worden gebruikt voor traagheidsfocus²², vergemakkelijken druppelgeneratie²³ en kunnen stroomomstandigheden (Womersley-getallen) genereren die de bloedstroom nabootsen voor in vitro studies. Aan de andere kant zijn streamingstromen nuttig voor het mengen, deeltjesvangen en manipulatie. Oscillerende stroming in dit frequentiebereik kan ook worden bereikt met behulp van een piëzo-element dat aan het apparaat is gebonden zoals hierboven beschreven²³. Een belangrijke hindernis voor het implementeren van oscillerende stromen door een gebonden piëzo-element is dat het vereist dat functies vooraf worden ontworpen. Bovendien zijn de verlijmde luidsprekerelementen niet afneembaar en moet aan elk apparaat een nieuw element worden bevestigd²⁴. Dergelijke apparaten hebben echter het voordeel dat ze compact zijn. Een alternatieve methode is het gebruik van een elektromechanische relaisklep²⁰. Deze kleppen vereisen pneumatische drukbronnen en aangepaste besturingssoftware voor de werking en verhogen daarom de technische barrière voor testen en implementatie. Niettemin maken dergelijke apparaten de toepassing van ingestelde drukamplitude en frequentie mogelijk.

In dit artikel wordt de constructie, werking en karakterisering van een gebruiksvriendelijke methode beschreven om oscillerende stromen te genereren in het frequentiebereik van 10-1000 Hz in microkanalen. De methode biedt tal van voordelen, zoals kosteneffectieve montage, bedieningsgemak en klaar om te communiceren met standaard microfluïdische kanalen en accessoires zoals spuitpompen en slangen. Bovendien biedt de methode, in vergelijking met eerdere vergelijkbare benaderingen²⁵, de gebruiker selectieve en onafhankelijke controle van oscillatiefrequenties en amplitudes, inclusief de modulatie tussen sinusoïdale en niet-sinusoïdale golfvormen. Deze functies stellen gebruikers in staat om eenvoudig oscillerende stromen te implementeren en vergemakkelijken daarom een wijdverspreide toepassing in een breed scala van momenteel bestaande microfluïdische technologieën en toepassingen op het gebied van biologie en chemie.

Protocol

1. Snel prototype matrijsontwerp en fabricage

1. Open AutoCAD op een pc. Selecteer Bestand op de taakbalk, selecteer vervolgens Openen en blader naar en klik op een driedimensionaal (3D) modelbestand van de kanaalmal met .dxf of .dwg extensie.
2. Selecteer het hele model door erop te klikken en er een vak omheen te slepen. Exporteer het ontwerp als stl-bestand door Bestand | Exporteren, vervolgens Andere indelingen en kies .stl in de vervolgkeuzelijst. 
3. Upload het bestand naar een hoge precisie hars stereolithografische (SLA) printer zoals Formlabs FORM3. Giet de hars in de harskamer en begin met het printen en produceer de mal met de kleinste stappen met z-as (25 micron voor Formlabs CLEAR resin).
4. Wacht tot het automatisch afdrukken van onderdelen is voltooid.
   OPMERKING: Mallen met functies zo klein als 0,1 mm kunnen op deze manier worden vervaardigd.
5. Nadat u het deel uit de hars hebt verwijderd, roert u het gedurende 5 minuten in isopropanol om de resterende hars te verwijderen.
6. Droog de mal met lucht of stikstofgas gedurende 2 min.
   OPMERKING: Conventionele microfluïdische schimmelfabricage met siliciumwafers en fotolithografie met elke SU8- of KMPR-fotoresisten kunnen ook worden gebruikt om een mal met kleinere kenmerken te produceren.
7. Laat de gedroogde mal maximaal 1 uur uitharden bij 60 °C in UV-licht.

2. PDMS microkanaal fabricage

1. Plaats de mal op een vel aluminiumfolie. Om de delaminatie van PDMS te vergemakkelijken, spuit u de mal in 1 of 2 gangen met siliconen schimmelafgifte.
2. Giet PDMS-hars en cross-linker in een wegwerpbeker in de verhouding van 10:1 gewicht en meng met een wegwerplepel.
3. Giet het resulterende mengsel op de mal om een film van de vereiste dikte te produceren. Om wandvervorming met grote kanalen te voorkomen, moet u de PDMS-dikte van meer dan 5 mm of 3-4 keer de maximale objectdikte behouden.
4. Plaats de vorm met gegoten PDMS in de ontgaskamer en sluit het deksel. Zorg ervoor dat de O-ring de kamer hermetisch afsluit.
5. Sluit de uitlaatklep en zet de vacuüm ruwe pomp aan om het ontgassen te starten.
6. Ontgas het gegoten mengsel in een vacuümpomp gedurende meer dan 4-6 cycli, waarbij elke cyclus ongeveer 5 minuten duurt. Verwijder handmatig eventuele resterende bellen (in hoeken en sleuven) met behulp van een fijne draad.
7. Stel de oventemperatuur in op 80 °C en laat deze voorverwarmen. Zet het mengsel 2 uur in de oven op 80 °C om uit te harden.
8. Haal de uitgeharde vorm uit de oven en laat deze 10 min op kamertemperatuur afkoelen.
9. Snijd met behulp van een scalpel voorzichtig de randen van de mal uit. Gebruik voor optimale delaminatie een spuit om isopropanol tussen de mal en het uitgeharde PDMS te injecteren.
10. Verwijder het uitgeharde PDMS uit de mal en snijd het in afzonderlijke apparaten met een scheermesje. De afmetingen van elk apparaat moeten variëren van 10 mm x 10 mm tot 30 mm x 70 mm om met de glasplaat te worden verbonden.
11. Maak een gat van 1,0-3,0 mm diameter bij de inlaat en uitlaat met behulp van een biopsypons.
12. Schakel de handheld radiofrequentie (RF) plasmagenerator in. Om de glasplaat te activeren, passeert u de draadelektrode gedurende 2 minuten meerdere keren over een schone droge glasplaat. Houd een draad-naar-glasspleet van ongeveer 5 mm aan. Plaats de apparaatzijde van het uitgeharde PDMS in contact met de geactiveerde glasplaat en plaats deze vervolgens gedurende 2 uur in een oven van 80 °C.
13. Knip polyethyleen inlaat- en uitlaatbuizen op de gewenste lengte en steek ze in de inlaat- en uitlaatgaten.
14. Om loslating van de buis tijdens het gebruik te voorkomen, brengt u siliconenkit aan op het contactoppervlak en laat u deze gedurende 2 uur uitharden om de slang vast te zetten.

3. Oscillerende driverassemblage

1. Klem de uiteinden van de alligatorclip van een paar alligator-to-pin-draden vast aan de aansluitingen van een luidspreker. Hier werd een 15 W luidspreker met een 8 cm conus gebruikt, hoewel andere luidsprekers ook kunnen worden gebruikt.
2. Plaats de chip van de aux-controller op een isolerende container. Steek de uiteinden van de pen in de schroefdoppen van de aux-controllerchip en draai stevig vast met een schroevendraaier om de connectiviteit te garanderen.
3. Sluit het ene uiteinde van een aux-kabel aan op de controllerchip en het andere uiteinde op een aux-poort op een computer of smartphone.
4. Sluit een 12 V gelijkstroomadapter (DC) aan op de voeding. Schakel de controllerchip in door het coaxiale uiteinde van de DC-adapter aan te sluiten op het stopcontact.
5. Navigeer met behulp van een internetbrowser naar een website voor online toongeneratoren (bijv. https://www.szynalski.com/tone-generator/ ).
6. Typ de gewenste frequentie (5-1200 Hz) in de online applicatie. Scrol op de volumebalk naar de gewenste hoeveelheid (bijvoorbeeld 100%).
7. Klik op het Wave-Type Generator symbool en selecteer de gewenste golfvorm (sinus, vierkant, driehoek, zaagtand). Let op: de standaardwaarde is een sinusgolfvorm. Druk op Afspelen om de luidspreker te activeren.

4. Adapter montage

OPMERKING: De volledige luidspreker-naar-buis adapterassemblage wordt geïllustreerd door het schema in figuur 1.

1. Bevestig de luidspreker (figuur 1(I)) op de 3D-geprinte luidsprekerbevestiging (figuur 1(II)) (zie speakermount.stl in aanvullend bestand 1) door een tape over het gebogen oppervlak en aan weerszijden van de houder te plakken.
2. Richt de luidspreker verticaal met het oppervlak van de luidsprekerconus naar boven gericht. Plaats de 3D-geprinte adapter (figuur 1(III)) (zie speakertubeadapter.stl in aanvullend bestand 2) concentrisch op de luidsprekerconus.
3. Breng siliconenkit royaal aan langs de randen van de adapter en laat 2 uur uitharden.
4. Plaats de luidspreker en luidsprekerbevestiging op het microscooppodium en plak deze af om beweging tijdens het gebruik te voorkomen.
5. Snijd een micropipetpunt van 200 μL ongeveer 2 cm van het smalle uiteinde en gooi de bredere helft van de punt weg. Het smalle conische uiteinde zal dienen als een wigafdichting voor omkeerbare bevestiging.
6. Sluit de polyethyleenbuis (figuur 1(V)) aan op de uitlaat van het microkanaal (figuur 1(VI)) door eerst door de micropipetpunt te lopen (figuur 1(IV)) en vervolgens door het coaxiale uiteinde van de adapter en ten slotte via de zijkant naar buiten.
7. Wig het smalle uiteinde van de pipetpunt stevig in het coaxiale uiteinde van de adapter om een afneembare, strakke afdichting te creëren.

5. Werking van de experimentele opstelling voor oscillerende stromen in microkanalen

1. Voeg tracerdeeltjes toe aan een injectieflacon met 22% gewicht/gewicht (w/w) glyceroloplossing om een neutraal drijvende suspensie te produceren met een volumefractie van 0,01% -0,1% polystyreen in vloeistof bij 20 °C. Meng krachtig door te schudden om een homogene suspensie te produceren.
2. Laad een inlaatspuit van 1 ml met 1 ml monster. Monteer en bevestig de geladen spuit op een automatische spuitpomp. Steek de naald van de spuit in de inlaatslang van het apparaat om een waterdichte afdichting te creëren.
3. Zorg ervoor dat de uitlaatbuis door de adapterassemblage naar een reservoir wordt geleid (zie de vorige sectie over adapterassemblage).
4. Zet de spuitpomp aan. Selecteer met behulp van het aanraakscherm het type spuit als Becton-Dickinson 1 ml. Selecteer vervolgens Infuse. Selecteer vervolgens het vereiste debiet (0-1 ml /min) of het debiet (< 1 ml).
5. Start de constante stroom met behulp van de spuitpomp. Wacht tot er voldoende vloeistof is gestroomd en de uitlaatbuis tot aan de luidspreker is gevuld met vloeistof.
   OPMERKING: De oscillerende amplitude voor een bepaalde instelling zal niet variëren met de gestage transportstroom als de uitlaatbuis is voorbereid.
6. Selecteer een vereiste frequentie, amplitude en golfvorm in de toongeneratortoepassing zoals beschreven in stap 3.5 en druk op Afspelen om oscillerende stroom in het microkanaal te genereren.

6. Observatie- en amplitudemeting

1. Monteer het apparaat op de microscoop. Stel de optische configuratie in door een objectieflens te selecteren met een vergroting tussen 10x en 40x om het brandpuntsvlak aan te passen en het podium te positioneren.
2. Om metingen in een goed gedefinieerd brandpuntsvlak te verkrijgen, moet u ervoor zorgen dat de scherptediepte van de objectieflens met een factor 5 of meer kleiner is dan de kanaaldiepte.
3. Om de oscillerende stroom te observeren, gebruikt u een hogesnelheidscamera met een framesnelheid van ten minste tweemaal de oscillatiefrequentie zoals berekend met behulp van de bemonsteringsstelling van Nyquist. Voor een praktisch bruikbare resolutie van de golfvorm meet u ten minste 10 punten per tijdsperiode met behulp van een framerate > 10 keer die van de oscillatiefrequentie.
4. Als alternatief, om alleen de gecorrigeerde of langdurige effecten van pulsatiele stromen te observeren, voert u stroboscopische beeldvorming uit door de observatiefrequentie in te stellen op een perfecte deler van de oscillatiefrequentie.
5. Gebruik voor zowel directe als stroboscopische beeldvorming een camera die is uitgerust met een globale sluiter om het jello-effect te voorkomen. Houd in beide gevallen de belichtingstijd aanzienlijk korter dan de oscillatietijd (met een factor 10 of meer) om strepen te voorkomen.
6. Om de oscillatieamplitude te meten zonder een hogesnelheidscamera, neemt u op met een framerate die dicht bij maar niet gelijk is aan de stroboscopische framesnelheid (bijv. 49 frames / s voor een 50 Hz-signaal). Dit resulteert in een sterk vertraagde oscillatie waaruit de amplitude nauwkeurig kan worden gemeten.
7. Observeer en registreer de amplitudemetingen.

Results

Om het vermogen en de prestaties van de bovenstaande opstelling te illustreren, worden representatieve resultaten van oscillerende stroming in een eenvoudig lineair microkanaal met een vierkante doorsnede gepresenteerd. De breedte en hoogte van het kanaal zijn 110 μm en de lengte is 5 cm. Eerst beschrijven we de beweging van bolvormige polystyreen tracerdeeltjes en hoe deze kunnen worden gebruikt om de getrouwheid van het oscillerende signaal te controleren, evenals het bereik van oscillatieamplitudes dat haalbaar is. Ve...

Discussion

We hebben de assemblage (zie protocolkritische stappen 3 en 4) en werking (zie protocolkritische stappen 5 en 6) van een extern luidsprekergebaseerd apparaat gedemonstreerd voor het genereren van oscillerende stroom met frequenties in het bereik van 10 tot 1000 Hz in microfluïdische apparaten. Deeltjestracering van gesuspendeerde tracerdeeltjes is vereist om de getrouwheid van de harmonische beweging te bepalen en om het bereik van oscillatieamplitudes te kalibreren die haalbaar zijn over het bereik van bedrijfsfrequenti...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oscillatory Driver Assembly
Alligator-to-pin wire	Adafruit	3255	Kleine alligator clip naar mannelijke jumper wire (12)
Aux cable	Adafruit	2698	3,5 mm Mannelijk/Mannelijk stereo kabel 1 m
Controller chip	Damgoo	TPA3116	50w+50w 2 kanaals audioversterker (bluetooth en AUX)
DC adapter	Adafruit	798	12 V DC 1A gereguleerde switching voedingsadapter
Micro-pipette tip	VWR Signature	37001-532	200 ul micropipet tip
Silicone sealant	Loctite	908570	Klare siliconen waterdichte afdichting (80 ml)
Speaker	Drok	6843996	4,5 inch 4 Ohm 40 W luidspreker
Speaker mount			3D geprint van 'speakermount.stl' in aanvullende bestanden
Speaker-to-tube adapter			3D geprint van 'speaketubeadapter.stl' in aanvullende bestanden
Microchannel Manufacture
Biopsy punch	Miltex	15110	Biopsy punch met plunjer (1 - 4 mm)
Degasser
Disposable cup
Disposable spoon
Glass Slides	VWR Signature	16004-430	3" x 1" voorgezuiverde 1 mm dik
Mold			Si - SU-8 of 3D geprint
Oven	Fischer Scientific		Isotemp
PDMS resin and cross-linker	Dow Chemical	4019862	Sylgard 184 PDMS resin en crosslinker (500 g)
Polyethylene tubing	Becton Dickinson Intramedic	427440	Polyethyleen buis (PE 60 - PE 200)
Razor blades	VWR	55411-050	Eenzijdige industriële scheermesjes
RF plasma generator	Electro-Technic Products	BD - 20	Hoogfrequente generator
Silicone Mold Release	CRC	03301	Food Grade Silicon Mold release (16 oz)
Observation and Characterization
Camera	Edgertronic		SC2+
Lens	Nikon		Plan Fluor 10x
Microscope	Nikon		Ti Eclipse handmatige stage
Needles	Becton Dickinson	305175	PrecisionGlide 20G
Syringe	Becton Dickinson	1180100555	Monoject 1 ml
Syringe pump	Harvard Apparatus		Programmeerbare dubbele spuitpomp
Tracer Particles	Spherotech	PP-10-10	Polystyreen tracer deeltjes 1 um