Methodenartikel

Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in pancreas bètacelvoorlopers in een 2D-kweeksysteem

2.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63298

⸱

16 december 2021

 , 
1College of Health and Life Sciences, Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation, 2Diabetes Research Center, Qatar Biomedical Research Institute (QBRI), Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation (QF)

In dit artikel

Samenvatting

Het huidige protocol beschrijft een verbeterde methode om de co-expressie van PDX1- en NKX6.1-transcriptiefactoren in pancreasvoorlopercellen afgeleid van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's) in planaire monolagen te verhogen. Dit wordt bereikt door de verse matrix aan te vullen, de celdichtheid te manipuleren en de endodermale cellen te dissociëren.

Samenvatting

Menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's) zijn een uitstekend hulpmiddel voor het bestuderen van de vroege ontwikkeling van de alvleesklier en het onderzoeken van de genetische bijdragen aan diabetes. hPSC-afgeleide insuline-afscheidende cellen kunnen worden gegenereerd voor celtherapie en ziektemodellering, echter met beperkte efficiëntie en functionele eigenschappen. hPSC-afgeleide pancreasvoorlopercellen die voorlopers zijn van bètacellen en andere endocriene cellen, specificeren wanneer ze de twee transcriptiefactoren PDX1 en NKX6.1 co-expressie geven, de voorlopers van functionele, insuline-afscheidende bètacellen zowel in vitro als in vivo. hPSC-afgeleide pancreasvoorlopercellen worden momenteel gebruikt voor celtherapie bij type 1 diabetespatiënten als onderdeel van klinische onderzoeken. De huidige procedures genereren echter geen hoog percentage NKX6.1- en pancreasvoorlopercellen, wat leidt tot cogeneratie van niet-functionele endocriene cellen en weinig glucose-responsieve, insuline-afscheidende cellen. Dit werk ontwikkelde dus een verbeterd protocol voor het genereren van hPSC-afgeleide pancreasvoorlopercellen die de co-expressie van PDX1 en NKX6.1 in een 2D-monolaag maximaliseren. De factoren zoals celdichtheid, beschikbaarheid van verse matrix en dissociatie van hPSC-afgeleide endodermale cellen worden gemoduleerd die PDX1- en NKX6.1-niveaus in de gegenereerde pancreasvoorlopercellen verhoogden en de toewijding aan alternatieve leverafstamming geminimaliseerd. De studie benadrukt dat het manipuleren van de fysieke omgeving van de cel tijdens in vitro differentiatie van invloed kan zijn op de afstammingsspecificatie en genexpressie. Daarom vergemakkelijkt het huidige geoptimaliseerde protocol de schaalbare generatie van PDX1 en NKX6.1 co-expressing voorlopers voor celtherapie en ziektemodellering.

Inleiding

Diabetes is een complexe stofwisselingsziekte die wereldwijd miljoenen mensen treft. Suppletie van insuline wordt beschouwd als de enige behandelingsoptie voor diabetes. Meer gevorderde gevallen worden behandeld met bètacelvervangingstherapie, bereikt door transplantatie van de hele kadaver alvleesklier of eilandjes 1,2. Verschillende kwesties omringen transplantatietherapie, zoals beperking met de beschikbaarheid en kwaliteit van het weefsel, invasiviteit van transplantatieprocedures naast de voortdurende behoefte aan immunosuppressiva. Dit vereist de noodzaak om nieuwe en alternatieve opties voor bètacelvervangingstherapie te ontdekken 2,3. Menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's) zijn onlangs naar voren gekomen als een veelbelovend hulpmiddel voor het begrijpen van de biologie van de menselijke alvleesklier en als een niet-uitputtende en mogelijk meer gepersonaliseerde bron voor transplantatietherapie 4,5,6,7. hPSC's, met inbegrip van menselijke embryonale stamcellen (hESCs) en door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's), hebben een hoog zelfvernieuwingsvermogen en geven aanleiding tot elk weefseltype van het menselijk lichaam. hESCs zijn afgeleid van de binnenste celmassa van het embryo en hiPSC's worden geherprogrammeerd uit elke somatische cel 4,8.

Gerichte differentiatieprotocollen zijn geoptimaliseerd om bètacellen van de pancreas te genereren uit hPSC's die hPSC's achtereenvolgens door de ontwikkelingsstadia van de pancreas leiden. Deze protocollen genereren hPSC-afgeleide eilandjesorganoïden. Hoewel ze sterk zijn verbeterd in het verhogen van het aandeel bètacellen van de pancreas daarin, is de efficiëntie van protocollen zeer variabel. Het neemt niet toe tot meer dan ~40% van NKX6.1+/INSULIN+ of C-PEPTIDE + cellen 5,9,10,11,12,13. De gegenereerde bètacellen zijn echter niet helemaal identiek aan de volwassen menselijke bètacellen in termen van hun transcriptionele en metabolische profielen en hun respons op glucose 4,5,14. De hPSC-afgeleide bètacellen missen genexpressie van belangrijke bètacelmarkers zoals PCSK2, PAX6, UCN3, MAFA, G6PC2 en KCNK3 in vergelijking met volwassen menselijke eilandjes5. Bovendien hebben de van hPSC afgeleide bètacellen de calciumsignalering verminderd als reactie op glucose. Ze zijn besmet met de co-gegenereerde polyhormonale cellen die geen geschikte hoeveelheden insuline afscheiden als reactie op het verhogen van glucosespiegels5. Aan de andere kant kunnen hPSC-afgeleide pancreasvoorlopers, die eilandjesprecursoren zijn, in vitro efficiënter worden gegenereerd in vergelijking met bètacellen en, wanneer ze in vivo worden getransplanteerd, kunnen uitgroeien tot functionele, insuline-afscheidende bètacellen15,16. Klinische studies zijn momenteel gericht op het aantonen van hun veiligheid en werkzaamheid bij transplantatie bij T1D-proefpersonen.

Met name de expressie van de transcriptiefactoren PDX1 (Pancreas en Duodenale Homeobox 1) en NKX6.1 (NKX6 Homeobox 1) binnen dezelfde pancreasvoorlopercel is cruciaal voor de inzet voor een bètacellijn5. Pancreasvoorlopercellen die NKX6.1 niet tot expressie brengen, geven aanleiding tot polyhormonale endocriene cellen of niet-functionele bètacellen17,18. Daarom is een hoge co-expressie van PDX1 en NKX6.1 in het pancreasvoorloperstadium essentieel voor het uiteindelijk genereren van een groot aantal functionele bètacellen. Studies hebben aangetoond dat een embryoïde lichaam of 3D-cultuur PDX1 en NKX6.1 verbetert in pancreasvoorlopercellen waar de differentiërende cellen worden geaggregeerd, variërend tussen 40% -80% van de PDX1 + / NKX6.1 + populatie12,19. In vergelijking met suspensieculturen zijn 2D-differentiatieculturen echter kosteneffectiever, haalbaarder en handiger voor toepassing op meerdere cellijnen5. We hebben onlangs aangetoond dat monolaagdifferentiatieculturen meer dan 90% van de PDX1+/NKX6.1+ co-expressie van hPSC-afgeleide pancreasvoorlopersopleveren 20,21,22. De gerapporteerde methode verleende een hoge replicerende capaciteit aan de gegenereerde pancreasvoorlopers en voorkwam alternatieve lotspecificaties zoals leverlijn21. Daarom demonstreert dit protocol hierin een zeer efficiënte methode voor de differentiatie van hPSC's naar pancreas bètacelprecursoren die samen PDX1 en NKX6.1 tot expressie brengen. Deze methode maakt gebruik van de techniek van het dissociëren van hPSC-afgeleid endoderm en het manipuleren van de celdichtheid, gevolgd door een uitgebreide FGF- en Retinoïde-signalering en Egel-remming om PDX1- en NKX6.1-co-expressie te bevorderen (figuur 1). Deze methode kan een schaalbare generatie van hPSC-afgeleide pancreas bètacelprecursoren voor transplantatietherapie en ziektemodellering vergemakkelijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De studie is goedgekeurd door de bevoegde institutionele ethische commissie voor onderzoek en uitgevoerd volgens de ethische normen zoals vastgelegd in de Verklaring van Helsinki van 1964 en de latere wijzigingen of vergelijkbare ethische normen. Het protocol werd goedgekeurd door de Institutional Review Board (IRB) van HMC (nr. 16260/16) en Qatar Biomedical Research Institute (QBRI) (nr. 2016-003). Dit werk is geoptimaliseerd voor hESCs zoals H1, H9 en HUES8. Bloedmonsters werden verkregen van gezonde personen uit het ziekenhuis van Hamad Medical Corporation (HMC) met volledige geïnformeerde toestemming. De iPSC's worden gegenereerd uit perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) van controle, gezond individu23.

1. Voorbereiding van de cultuurmedia

  1. Bereid menselijke pluripotente stamcellen (hPSC) kweekmedia voor
    1. Bereid hPSC-kweekmedia van het in de handel verkrijgbare medium voor het onderhouden en uitbreiden van menselijke embryonale stamcellen door 100 eenheden / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine aan te vullen (zie materiaaltabel). Aliquot en bewaar de volledige media bij -20 °C voor de lange termijn of 4 °C voor onmiddellijk gebruik.
  2. Bereid fase 1-differentiatiemedia voor (voor Definitief Endoderm (DE)).
    1. Bereid basale media uit MCDB 131-media door aan te vullen met 0,5% vetzuurvrij runderserumalbumine (FFA-BSA), 1,5 g / l natriumbicarbonaat (NaHCO3), 10 mM glucose, 2 mM glutamax, 100 eenheden / ml penicilline en 100 μg / ml streptomycine (zie materiaaltabel). Filtreer de bereide media met een filter van 0,2 μm en bewaar bij 4 °C.
    2. Bereid fase 1-media die CHIR99021 bevatten uit de basale media (bereid in stap 1.2.1) door de basale media te verwarmen bij 37 °C en vervolgens aan te vullen met 2 μM CHIR99021, 100 ng/ml Activine A, 10 μM rotsremmer (Y-27632) en 0,25 mM vitamine C (zie materiaaltabel). Meng de aangevulde media goed en bedek het met aluminiumfolie om het te beschermen tegen licht.
      OPMERKING: Deze media worden alleen gebruikt op de eerste dag van differentiatie.
    3. Bereid fase 1-media zonder CHIR99021 voor op de basale media door deze op te warmen bij 37 °C en aan te vullen met 100 ng / ml Activine A en 0,25 m M vitamine C en meng goed.
      OPMERKING: 5 ng / ml basis FGF of FGF2 kan optioneel aan dit medium worden toegevoegd. Deze media zullen worden gebruikt voor de resterende dagen van Fase 1.
  3. Bereid fase 2 differentiatiemedia voor (voor primitieve darmbuis; PGT).
    1. Bereid fase 2 differentiatiemedia die rotsremmer uit de basale media bevatten voor door deze op te warmen bij 37 °C en aan te vullen met 50 ng/ml FGF10, 50 ng/ml NOGGIN, 0,25 μM CHIR99021, 10 μM Y-27632 (rotsremmer) en 0,25 mM vitamine C.
      OPMERKING: Dit medium wordt gebruikt op de dag van dissociatie van endodermale cellen.
    2. Bereid fase 2 differentiatiemedia zonder rockremmer volgens dezelfde procedure voor de media bereid in stap 1.3.1, met uitzondering van de rockremmer.
      OPMERKING: Dit medium wordt gebruikt op de tweede dag van fase 2.
  4. Bereid fase 3 differentiatiemedia voor (voor Posterior Foregut).
    1. Bereid DMEM-media met 4,5 g / L glucose, vul vervolgens aan met 1% penicilline-streptomycine en 2 mM glutamax en gebruik als basale media voor stadia 3 en 4.
    2. Verwarm de DMEM-media (bereid in stap 1.4.1) en vul aan met 2 μM retinoïnezuur, 0,25 μM SANT-1, 50 ng/ml FGF10, 50 ng/ml NOGGIN, 0,25 mM vitamine C en 1% B27-supplement zonder vitamine A (zie materiaaltabel).
      OPMERKING: Dit medium wordt gebruikt gedurende 4 dagen van fase 3 voor P2-D (protocol 2, geoptimaliseerd, gedissocieerd) en 2 dagen van fase 3 voor P1-ND (protocol 1, niet-geoptimaliseerd, niet-gedissocieerd).
  5. Bereid fase 4 differentiatiemedia voor (voor pancreasvoorlopers).
    1. Voeg DMEM toe met 4,5 g / l glucose met 100 ng / ml EGF, 10 mM nicotinamide, 50 ng / ml NOGGIN, 0,25 mM vitamine C en 1% B27-supplement zonder vitamine A (zie materiaaltabel). Gebruik deze media voor alle dagen van Fase 4.
      OPMERKING: Houd alle reagentia op de juiste temperatuur en alle cytokine en gevoelige reagentia moeten worden gealiquoteerd. Ontdooi de gealiquoteerde reagentia en voeg toe aan de basale media op het moment dat de differentiatiemedia veranderen. De samenstellingen van de verschillende differentiatiemedia zijn weergegeven in tabel 1.

2. Bereiding van keldermembraan matrix gecoate gerechten

  1. Ontdooi in de handel verkrijgbare keldermatrix (zie Materiaaltabel) en aliquot op ijs; vries de aliquots in bij -20 °C.
  2. Voordat u de weefselkweekschalen bedekt, ontdooit u de bevroren aliquots op ijs. Voeg het juiste volume van de membraanmatrixoplossing toe aan de gekoelde KO-DMEM/F-12-media (KnockOut DMEM/F-12) (zie Materiaaltabel) om de gewenste verdunde concentratie te bereiken en goed te mengen. Bewaar de verdunde matrixoplossing bij 4 °C voor onmiddellijk gebruik.
  3. Bedek het oppervlak van de met weefselkweek behandelde platen (zie materiaaltabel) met verdunde membraanmatrixoplossing en plaats de platen gedurende ten minste 60 minuten op 37 °C voordat de cellen worden platgelegd. Gebruik een verdunning van 1:50 van de membraanmatrixoplossing in KO-DMEM/F-12 voor platingcellen voor pancreasdifferentiatie-experiment en 1:80 voor uitbreiding van ongedifferentieerde hPSC's.

3. Cultuur van ongedifferentieerde hPSC's

  1. Passeer de hPSC's wanneer de kolonies een samenvloeiing van 70% -80% bereiken.
  2. Om door te gaan, was de hPSC's eenmaal met warme PBS, aspirateer met behulp van een draagbare vacuümaspirator in de weefselkweekkap en voeg 0,5 mM EDTA-oplossing toe in PBS om het kolonieoppervlak te bedekken. Incubeer bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 1 min of totdat de randen van de kolonie loskomen van het plaatoppervlak.
  3. Verwijder de EDTA-oplossing en verzamel de losmakende kolonies met hPSC-kweekmedium met behulp van een P1000-micropipette. Centrifugeer de verzamelde cellen bij 128 x g gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg en vul de cellen aan met hPSC-kweekmedia die 10 μM Y-27632 (Rotsremmer)23,24 bevatten.
    OPMERKING: Passeer de hPSC's in ten minste een verhouding van 1:3 op 1:80 membraanmatrix-gecoate schotels. Voor differentiatie-experimenten plaatst u de hPSC's echter op 1:50 gecoate gerechten.

4. Inductie van definitieve endoderm (DE) differentiatie in hPSC's (fase 1)

  1. Wanneer de hPSC-kolonies een samenvloeiing van 70% -80% bereiken, was ze dan twee keer met warme PBS en aspirateer met behulp van een draagbare vacuümaspirator in de weefselkweekkap om fase 1-differentiatie te beginnen.
  2. Voeg fase 1 differentiatiemedium met CHIR99021 (vanaf stap 1.2.2) toe aan de kolonies, 2 ml per 6-well plaat, en incubeer bij 37 °C gedurende 24 uur.
  3. Vervang de volgende dag de gebruikte media door fase 1 differentiatiemedium zonder CHIR99021 (stap 1.2.3).
  4. Aspirateer elke 24 uur de gebruikte media met behulp van een draagbare vacuümaspirator in de weefselkweekkap en vervang deze door een nieuw Stage 1-differentiatiemedium zonder CHIR99021.
    OPMERKING: Fase 1 kan worden verlengd tot 4 dagen. De lengte van fase 1 is afhankelijk van de hPSC-lijn die wordt gebruikt en moet dienovereenkomstig worden geoptimaliseerd.

5. Immunofluorescentieanalyse van hPSC-afgeleide DE (fase 1)

  1. Voor immunofluorescentie, aspirateer de gebruikte media met behulp van een draagbare vacuümaspirator in de weefselkweekkap uit de putjes en was tweemaal met warme PBS. Draai de plaat rond om zich te ontdoen van celresten.
  2. Bedek het oppervlak van de putten met 4% paraformaldehyde (PFA) om de DE-cellen te fixeren; voeg bijvoorbeeld 250 uL PFA toe per put van een plaat met 24 putten. Plaats de plaat op een 2D shaker op 20 x g gedurende 20 min.
  3. Was na fixatie de DE-cellen met tris-gebufferde zoutoplossing met 0,5% Tween (TBST) (zie Materiaaltabel) en plaats de plaat op de shaker op 20 x g gedurende 10 minuten. Herhaal deze stap nogmaals.
  4. Permeabiliseer de vaste cellen door een royaal volume fosfaat-gebufferde zoutoplossing toe te voegen met 0,5% Triton X-100 (PBST); voeg bijvoorbeeld 1 ml PBST toe per putje van een 24-wells plaat en plaats de plaat terug op de shaker op 20 x g gedurende 20 min.
  5. Bereid vers 5% -6% van BSA in PBST als blokkerende buffer en voeg het toe aan de gepermeabiliseerde cellen. Incubeer de plaat gedurende ten minste 1 uur in de blokkerende oplossing op de shaker.
  6. Verdun de primaire antilichamen tegen SOX17 en FOXA2 samen (zie materiaaltabel) in 2%-3% BSA in PBST-oplossing. Voeg de gecombineerde antilichamen toe aan geblokkeerde cellen en plaats de plaat op de shaker bij 4 °C 's nachts bij een lage snelheid met zacht schudden.
    OPMERKING: SOX17 en FOXA2 zijn gevestigde DE-markers25,26.
  7. De volgende dag aspirateer de primaire antilichamen met behulp van een draagbaar vacuümfilter en was de putten drie keer met TBST, elk gedurende 10 minuten wassen op de shaker.
  8. Bereid 1:500 verdunning van Alexa fluor 488- en 568- geconjugeerde secundaire antilichamen voor (zie Materiaaltabel) tegen de soort waarin de primaire antilichamen zijn opgegroeid.
  9. Voeg de secundaire antilichaamcombinatie toe aan de gekleurde put en bedek de plaat met aluminiumfolie om te beschermen tegen licht. Plaats het bord 1 uur op de shaker bij kamertemperatuur.
  10. Aspirateer de secundaire antilichaamoplossing met behulp van een draagbaar vacuümfilter en was de gekleurde putten met TBST op de shaker gedurende 10 minuten, waarbij de plaat met folie wordt bedekt. Herhaal de wasstap in totaal drie keer.
  11. Bereid een 1 μg/ml Hoechst 33342 verdunning in PBS om de kernen te kleuren. Voeg de Hoechst-oplossing toe aan de putjes en plaats de plaat gedurende 2-3 minuten op de shaker.
  12. Aspirateer de Hoechst-oplossing met behulp van een draagbaar vacuümfilter en spoel de putjes twee keer met PBS.
  13. Voeg ten slotte PBS toe aan de gekleurde cellen en beeld ze af met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop (zie Materiaaltabel) in het donker. Houd de plaat bedekt met folie wanneer deze niet wordt afgebeeld om het bleken van de fluorofoor te minimaliseren.
    OPMERKING: Als alternatief kan flowcytometrie worden gebruikt om de DE-efficiëntie te beoordelen zoals beschreven in stap 9.2.

6. Generatie van de primitieve darmbuis (PGT) uit hPSC's (fase 2)

OPMERKING: Als de immunofluorescentieanalyse in stap 5.13 wordt vastgesteld als een SOX17-FOXA2-co-expressie van 80% en hoger, gaat het experiment verder naar fase 2. Als de efficiëntie <80% is, verlengt u de duur van fase 1 tot 4 dagen.

  1. Dissociëer op dag 1 van fase 2 de hPSC-afgeleide endodermale cellen met behulp van TrypLE of Accutase (zie Materiaaltabel) voor het geoptimaliseerde P2-D-protocol. Was de hechtcellen met warme PBS en voeg gedurende 3-5 minuten bij 37 °C, 5% CO 2, of totdat de cellen van elkaar beginnen los te komen, warme 1 ml TrypLE- of Accutase-oplossing per putje van een 6-wellsplaat toe.
  2. Dissocieer de losgemaakte vellen of monolaag van cellen in de putten en verzamel ze vervolgens samen in een polypropyleenbuis van 15 ml met behulp van basale fase 1/2-media zonder cytokines die ten minste 0,5% foetaal runderserum (FBS) of KnockOut-serum (KOSR) bevatten (zie materiaaltabel).
  3. Draai de cellen op 800 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg. Voeg 1 ml steriel PBS toe en resuspenseer de pellet in enkele cellen.
  4. Tel de cellen met behulp van een geautomatiseerde teller (zie Tabel met materialen) door het aanbevolen volume cellen in de kamerschuif te laden. Draai de geresuspendeerde cellen op 800 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
  5. Resuspendeer de pellet in het juiste volume van fase 2 differentiatiemedium dat gesteenteremmer bevat met een dichtheid van 2,5-3,5 x 105 cellen/cm2.
    OPMERKING: Deze telling kan voor de meeste cellijnen neerkomen op een splitting ratio van 1:2, afhankelijk van de proliferatiesnelheid. Het totale volume is 2 ml media met geresuspendeerde cellen in 1 een put van 6-well plaat.
  6. Plaats de geresuspendeerde cellen op 1:50 membraanmatrix-gecoate platen (bereid in stap 2) en incubeer ze bij 37 °C, 5% CO2 in de incubator.
  7. Vervang 24 uur later het medium door fase 2 differentiatiemedium zonder rotsremmer (bereid in stap 1.3.2).

7. Generatie van posterieur foregut uit hPSC's (fase 3)

  1. Aspirateer de gebruikte Stage 2-media met behulp van een draagbare vacuümaspirator in de weefselkweekkap en was de cellen met warme PBS.
  2. Voeg fase 3 differentiatiemedia uit stap 1.4 toe aan de cellen en incubeer bij 37 °C, 5% CO2.
  3. Vervang na 24 uur de gebruikte media door vers bereide fase 3-differentiatiemedia. Herhaal dit in totaal 4 dagen voor het P2-D-protocol (geoptimaliseerd) en slechts 2 dagen voor het niet-gedissocieerde P1-ND.

8. Generatie van pancreasvoorlopers uit hPSC's (stadium 4)

  1. Na 4 dagen fase 3-behandeling, was de cellen met warme PBS, draai de plaat voorzichtig rond en aspirateer met behulp van een draagbare vacuümaspirator. Voeg vervolgens fase 4-differentiatiemedia uit stap 1.5 toe aan de cellen.
  2. Vervang na 24 uur de gebruikte media door vers bereide stage 4-media. Herhaal dit in totaal 4 dagen.

9. Beoordeling van de differentiatie-efficiëntie van het genereren van pancreasvoorlopercellen uit hPSC's

  1. Voer de immunofluorescentieanalyse uit van de hPSC afgeleide pancreasvoorlopers (stadium 4) voor expressie van PDX1 en NKX6.1.
    OPMERKING: PDX1 en NKX6.1 zijn gevestigde pancreasvoorlopermarkers17,18.
    1. Voer fixatie, permeabilisatie, blokkering en antilichaamincubatie en wasbeurten uit volgens stap 5.
    2. Kleur de hPSC-afgeleide pancreasvoorlopercellen met een combinatie van PDX1- en NKX6.1-antilichamen (zie materiaaltabel) verdund in 2% -3% BSA in PBST.
    3. Gebruik 1:500 verdunningen van geschikte Alexa fluor 488- en 568- geconjugeerde secundaire antilichamen (zie Materiaaltabel).
  2. Voer flowcytometrieanalyse uit van hPSC afgeleide pancreasvoorlopercellen voor expressie van PDX1 en NKX6.1.
    OPMERKING: Flow-cytometrie-analyse van pancreasmarkers in de gegenereerde hPSC-afgeleide pancreasvoorlopers biedt een manier om de PDX1- en NKX6.1-co-expressiecellen te kwantificeren.
    1. Was aan het einde van fase 4 de cellen twee keer met warme PBS en voeg voldoende TrypLE of Accutase toe om het oppervlak van de putten te bedekken, bijvoorbeeld 1 ml TrypLE of Accutase per put van 6-well plaat. Plaats de plaat in de incubator gedurende 5-7 minuten of totdat de cellen loskomen van het oppervlak.
    2. Dissociëer de hechte vellen cellen in de put met behulp van een P1000-micropipette voordat u ze verzamelt in een polypropyleenbuis van 15 ml.
    3. Spin de cellen in hPSC-afgeleide pancreasvoorlopers op 800 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant vervolgens weg. Was de cellen met PBS door ze te dissociëren in afzonderlijke cellen. Tel de cellen met behulp van een geautomatiseerde teller (zie Tabel van materialen) en noteer de concentratie in het aantal cellen per ml.
    4. Draai op 800 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg. Voeg 200 μL gekoeld PBS toe aan de pellet en dissociëer.
    5. Voeg 2 ml gekoelde 80% ethanol druppelsgewijs toe, met de buis op een vortex bij lage-gemiddelde snelheid (400 x g bij kamertemperatuur). Sluit de doppen goed en plaats de buizen iets gekanteld op de shaker bij 4 °C 's nachts.
    6. Draai de cellen op 800 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en was met PBS om eventuele klonten vaste cellen te dissociëren.
    7. Blokkeer de vaste cellen met 5%-6% BSA-oplossing in PBST gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur of 4 °C 's nachts op de shaker.
    8. Vlek voor de pancreasvoorlopermarkers volgens de onderstaande stappen.
      1. Verdeel 2.00.000 cellen per conditie, inclusief geschikte isotypecontroles, afhankelijk van de IgG-subklasse van de gastheersoort van het primaire antilichaam, de niet-gekleurde en secundaire antilichaamcontroles in een 96-well V-bodemplaat of 1,5 ml centrifugebuizen.
      2. Draai de plaat op 800 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en draai de plaat met een snelle beweging om het supernatant weg te gooien zonder de pellets te verliezen. Bereid primaire antilichaamverdunningen in 3% BSA-oplossing (zie materiaaltabel).
        OPMERKING: De concentratie van primaire antilichamen kan tussen 1:50 en 1:200 liggen.
      3. Incubeer de gekleurde cellen gedurende ten minste 2 uur bij kamertemperatuur of een nacht bij 4 °C op een schudder met zacht schudden bij lage snelheid.
      4. Was de gekleurde cellen driemaal met TBST door de cellen op en neer in de putjes te pipetteren. Draai en gooi het supernatant weg zoals in stap 9.2.8.2.
      5. Voeg 1:500 verdunning van secundaire antilichamen (Alexa fluor 488- en 647-geconjugeerde antilichamen) bereid in PBS toe (zie materiaaltabel). Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
      6. Was de gekleurde cellen minstens twee keer met TBST door de cellen op en neer te pipetteren. Draai de plaat en gooi het supernatant weg zoals in stap 9.2.8.2.
      7. Verzamel de gekleurde cellen in ten minste 100 μL PBS en breng ze over naar lichtbeveiligde FACS-buizen (zie Materiaaltabel). Voer de monsters uit op een flowcytometriemachine.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De resultaten tonen aan dat het geoptimaliseerde protocol P2-D (figuren 1A) de differentiatie-efficiëntie van pancreasvoorlopers verbeterde door pdx1- en nkx6.1-co-expressie te upreguleren (figuur 2A, B en figuur 3A). In het bijzonder toonden de resultaten aan dat dissociatie van endodermale cellen en hun replating op verse membraanmatrix samen met een langere duur van stadium 3 nkx6.1-expressie in hPSC-afgeleide pa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit werk beschrijft een verbeterd protocol voor het genereren van pancreasvoorlopercellen uit hPSC's met een hoge co-expressie van PDX1 en NKX6.1. Dissociatie en replating van het hPSC-afgeleide endoderm bij halve dichtheid op verse matrix resulteerde in hogere PDX1 en NKX6.1 in hPSC-afgeleide pancreasvoorlopers.

Hoewel de groeifactorcocktail voor elke fase sterk lijkt op P1-ND27, is aangetoond dat een meer uitgebreide fase 3-behandeling inclusief FGF- en retinoïdesigna...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van qatar National Research Fund (QNRF) (Grant No. NPRP10-1221-160041).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
15 mL, conische, centrifugeerbuizenThermo Scientific339651
20X TBS Tween 20Thermo Scientific28360
24-well kweekplaten, platte bodem met dekselCostar3524
50 mL, conische, centrifugeerbuizenThermo Scientific339652
6-well kweekplaten, multidishThermo Scientific140685
AccutaseStem Cell Technologies0-7920
Activine AR&D338-ACReconstituted in 4 mM HCl
Anti NKX6.1 antilichaam, muis monoklonaalDSHBF55A12-CDiluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining
Anti-PDX1 antilichaam, cavia polyklonaalAbcamab47308Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:1000 for immunostaining
B27 minus Vit AThermoFisher12587010
Runder serum albumine, heat shock fractie, vetzuurvrijSigmaA7030
CHIR 99021Tocris4423Reconstituted in DMSO
DMEM, hoge glucoseThermoFisher41965047
Ezel anti-Muis IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secundaire Antilichaam, Alexa Fluor 568InvitrogenA10037
Ezel anti-Konijn IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secundaire Antilichaam, Alexa Fluor 488A-21206
DPBS 1XThermoFisher14190144
EGFThermoFisherPHG0313Reconstituted in 0.1% BSA in PBS
FGF10R&D345-FGReconstituted in PBS
GlucoseSigma AldrichG8644
Hoechst 33258Sigma23491-45-4
Omgekeerde microscoopOlympusIX73
KnockOut DMEM/F-12 (1X)Gibco12660-012
KnockOut SR serum vervangerGibco10828-028
L-Ascorbinezuur (vitamine C)SigmaA92902Reconstituted in gedistilleerd water
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane MatrixCorning354230Aliquot the thawed stock and freeze at -20C.
MCDB131ThermoFisher10372019
Muis anti-SOX17ORIGENECF500096Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining
mTeSR PlusStem Cell Technologies85850Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use
Nalgene filter units, 0.2 µm PESThermoFisher566-0020
NicotinamideSigma72340Reconstituted in gedistilleerd water
NOGGINR&D6057-NGReconstituted in 0.1% BSA in PBS
Paraformaldehyde oplossing 4% in PBSChemCruzsc-281692
Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL)ThermoFisher15140122
Draagbare vacuüm aspirator
Konijn anti-FOXA2Cell signaling technology3143Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:500 for immunostaining
Retinoic AcidSigma AldrichR2625Reconstituted in DMSO
Rock inhibitor (Y-27632)ReproCell04-0012-02Reconstituted in DMSO
Ronde bodem Polystyrene FACS Tubes met doppen, STERIELStellar ScientificFSC-9010
SANT-1Sigma AldrichS4572Reconstituted in DMSO
NatriumbicarbonaatSigmaS5761-500G
StemFlexThermoFisherA3349401Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use
TALI Cellular Analysis SlideInvitrogenT10794
Tali image-based cytometer geautomatiseerde celtellerInvitrogenT10796
Triton X-100Sigma9002-93-1
TrypLE 100 mLThermoFisher12563011
Tween 20SigmaP2287
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0Invitrogen15575-038

Referenties

  1. Rickels, M. R., Robertson, R. P. Pancreatic islet transplantation in humans: Recent progress and future directions. Endocrine Reviews. 40 (2), 631-668 (2019).
  2. Latres, E., Finan, D. A., Greenstein, J. L., Kowalski, A., Kieffer, T. J. Navigating two roads to glucose normalization in diabetes: Automated insulin delivery devices and cell therapy. Cell Metabolism. 29 (3), 545-563 (2019).
  3. Vaithilingam, V., Tuch, B. E. Islet transplantation and encapsulation: An update on recent developments. Review of Diabetic Studies. 8 (1), 51-67 (2011).
  4. Abdelalim, E. M. Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (6), 2459-2483 (2021).
  5. Memon, B., Abdelalim, E. M. Stem cell therapy for diabetes: Beta cells versus pancreatic progenitors. Cells. 9 (2), 283(2020).
  6. Balboa, D., Iworima, D. G., Kieffer, T. J. Human pluripotent stem cells to model islet defects in diabetes. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 12, 642152(2021).
  7. Gaertner, B., Carrano, A. C., Sander, M. Human stem cell models: Lessons for pancreatic development and disease. Genes & Development. 33 (21-22), 1475-1490 (2019).
  8. Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).
  9. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
  10. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  11. Nair, G. G., et al. Recapitulating endocrine cell clustering in culture promotes maturation of human stem-cell-derived β cells. Nature Cell Biology. 21 (2), 263-274 (2019).
  12. Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
  13. Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro β-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
  14. Hrvatin, S., et al. Differentiated human stem cells resemble fetal, not adult, β cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3038-3043 (2014).
  15. Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
  16. Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells Journal. 31 (11), 2432-2442 (2013).
  17. Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells Journal. 31 (11), 2432-2442 (2013).
  18. Bruin, J. E., et al. Characterization of polyhormonal insulin-producing cells derived in vitro from human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 12 (1), 194-208 (2014).
  19. Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
  20. Memon, B., Abdelalim, E. M. Highly efficient differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1. Methods in Molecular Biology. , (2020).
  21. Memon, B., Karam, M., Al-Khawaga, S., Abdelalim, E. M. Enhanced differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 15(2018).
  22. Aigha, I. I., Memon, B., Elsayed, A. K., Abdelalim, E. M. Differentiation of human pluripotent stem cells into two distinct NKX6.1 populations of pancreatic progenitors. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 83(2018).
  23. Ali, G., et al. Keratinocytes derived from patient-specific induced pluripotent stem cells recapitulate the genetic signature of psoriasis disease. Stem Cells and Development. 29 (7), 383-400 (2020).
  24. Elsayed, A. K., et al. Generation of a human induced pluripotent stem cell line (QBRIi009-A) from a patient with a heterozygous deletion of FOXA2. Stem Cell Research. 42, 101705(2020).
  25. Davenport, C., Diekmann, U., Budde, I., Detering, N., Naujok, O. Anterior-posterior patterning of definitive endoderm generated from human embryonic stem cells depends on the differential signaling of retinoic acid, Wnt-, and BMP-signaling. Stem Cells. 34 (11), 2635-2647 (2016).
  26. Schroeder, I. S., et al. Induction and selection of Sox17-expressing endoderm cells generated from murine embryonic stem cells. Cells Tissues Organs. 195 (6), 507-523 (2012).
  27. Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
  28. Elsayed, A. K., Younis, I., Ali, G., Hussain, K., Abdelalim, E. M. Aberrant development of pancreatic beta cells derived from human iPSCs with FOXA2 deficiency. Cell Death & Disease. 12 (1), 103(2021).
  29. Mfopou, J. K., Chen, B., Mateizel, I., Sermon, K., Bouwens, L. Noggin, retinoids, and fibroblast growth factor regulate hepatic or pancreatic fate of human embryonic stem cells. Gastroenterology. 138 (7), 1-14 (2010).
  30. Mfopou, J. K., De Groote, V., Xu, X., Heimberg, H., Bouwens, L. Sonic hedgehog and other soluble factors from differentiating embryoid bodies inhibit pancreas development. Stem Cells. 25 (5), 1156-1165 (2007).
  31. Gattazzo, F., Urciuolo, A., Bonaldo, P. Extracellular matrix: A dynamic microenvironment for stem cell niche. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (8), 2506-2519 (2014).
  32. Watt, F. M., Huck, W. T. Role of the extracellular matrix in regulating stem cell fate. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (8), 467-473 (2013).
  33. Shih, H. P., Panlasigui, D., Cirulli, V., Sander, M. ECM signaling regulates collective cellular dynamics to control pancreas branching morphogenesis. Cell Reports. 14 (2), 169-179 (2016).
  34. Raza, A., Ki, C. S., Lin, C. C. The influence of matrix properties on growth and morphogenesis of human pancreatic ductal epithelial cells in 3D. Biomaterials. 34 (21), 5117-5127 (2013).
  35. Lin, H. Y., et al. Fibronectin and laminin promote differentiation of human mesenchymal stem cells into insulin producing cells through activating Akt and ERK. Journal of Biomedical Science. 17, 56(2010).
  36. Boretti, M. I., Gooch, K. J. Effect of extracellular matrix and 3D morphogenesis on islet hormone gene expression by Ngn3-infected mouse pancreatic ductal epithelial cells. Tissue Engineering Part A. 14 (12), 1927-1937 (2008).
  37. Boretti, M. I., Gooch, K. J. Induced cell clustering enhances islet beta cell formation from human cultures enriched for pancreatic ductal epithelial cells. Tissue Engineering. 12 (4), 939-948 (2006).
  38. Beattie, G. M., Rubin, J. S., Mally, M. I., Otonkoski, T., Hayek, A. Regulation of proliferation and differentiation of human fetal pancreatic islet cells by extracellular matrix, hepatocyte growth factor, and cell-cell contact. Diabetes. 45 (9), 1223-1228 (1996).
  39. Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), 82076(2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

2D culturesysteempancreasprogenitorenPDX1 NKX6 1 coexpressieinsuline secreterende cellenceltherapie diabetesendodermale celdissociatieflowcytometriefluorescentiemicroscopie

Gerelateerde artikelen