Hier leveren we exogene kunstmatig gesynthetiseerde miRNA-nabootsingen aan de nier via staartaderinjectie van een niet-virale vector en polyethylenimine nanodeeltjes in verschillende nierziektemuismodellen. Dit leidde tot significante overexpressie van doelmiRNA in de nier, wat resulteerde in geremde progressie van nierziekte in verschillende muismodellen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Levering van exogene kunstmatig gesynthetiseerde miRNA-nabootsing aan de nier met behulp van polyethylenimine nanodeeltjes in verschillende nierziektemuismodellen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
microRNA's (miRNA's), kleine niet-coderende RNA's (21-25 basen) die niet worden vertaald in eiwitten, remmen veel doelboodschapper-RNA's (mRNA's) door hun vertaling bij verschillende nierziekten te destabiliseren en te remmen. Daarom is afwisseling van miRNA-expressie door exogene kunstmatig gesynthetiseerde miRNA-nabootsingen een potentieel nuttige behandelingsoptie voor het remmen van de ontwikkeling van veel nierziekten. Omdat serumRNAase echter onmiddellijk systematisch toegediende exogene miRNA-nabootsingen in vivo afbreekt, blijft de afgifte van miRNA aan de nier een uitdaging. Daarom zijn vectoren nodig die exogene miRNA-nabootsingen kunnen beschermen tegen afbraak door RNAase en ze aanzienlijk aan de nier kunnen afleveren. Veel studies hebben virale vectoren gebruikt om exogene miRNA-nabootsers of -remmers aan de nier te leveren. Virale vectoren kunnen echter een interferonrespons en/of genetische instabiliteit veroorzaken. Daarom is de ontwikkeling van virale vectoren ook een hindernis voor het klinische gebruik van exogene miRNA-nabootsers of -remmers. Om deze zorgen met betrekking tot virale vectoren weg te nemen, ontwikkelden we een niet-virale vectormethode om miRNA-nabootsingen aan de nier af te leveren met behulp van staartaderinjectie van polyethylenimine nanodeeltjes (PEI-NP's), wat leidde tot significante overexpressie van doel-miRNA's in verschillende muismodellen van nierziekte.
Inleiding
miRNA's, kleine niet-coderende RNA's (21-25 basen) die niet worden vertaald in eiwitten, remmen veel doelboodschapper-RNA's (mRNA's) door ze te destabiliseren en hun vertaling bij verschillende nierziekten te remmen 1,2. Daarom is gentherapie met exogene kunstmatig gesynthetiseerde miRNA-nabootsers of -remmers een potentiële nieuwe optie om de ontwikkeling van veel nierziekten te remmen 3,4,5.
Ondanks de belofte van miRNA-nabootsers of -remmers voor gentherapie, blijft levering aan doelorga....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierexperimentele protocollen werden goedgekeurd door de dierethische commissie van de Jichi Medical University en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor gebruik en verzorging van proefdieren uit de Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals. Hier toonden we miRNA-nabootsing van toediening aan de nier aan, wat resulteerde in overexpressie met behulp van UUO-muizen. Deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van de Jichi Medical University [Goedkeuring nrs. 19-12 voor nierfibrose, 17-024 voor acute nierinfectie (AKI) en 19-11 voor diabetische nefropathie].
1. Bereiding van PEI-NPs-miRNA-mimic....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De hieronder beschreven doel-miRNA's voor nierfibrose, diabetische nefropathie en AKI werden geselecteerd op basis van de microarray, qRT-PCR en / of database-onderzoek voor gentherapietoepassingen. Voor nadere bijzonderheden wordt verwezen naar de vorige publicaties13,14,15.
Toediening en effecten van miRNA-146a-5p-mimic met behulp van PEI-NP's bij nierfibrosemuizen
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Met behulp van het protocol dat in dit manuscript wordt gepresenteerd, kunnen PEI-NP's miRNA-nabootsingen aan de nier leveren om overexpressie van doel-miRNA's te induceren, wat resulteert in behandelingseffecten in in vivo muismodellen van verschillende nierziekten, waaronder nierfibrose, diabetische nierziekte en AKI.
De methode om het complex van PEI-NP's en miRNA-mimiek te bereiden is heel eenvoudig. Het positief geladen oppervlak van PEI-NP's vangt de miRNA-nabootsing in wanneer .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door JSPS KAKENHI (Grant No. 21K08233). Wij danken Edanz (https://jp.edanz.com/ac) voor het redigeren van kladversies van dit manuscript.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole voor kleuring van nucleïnezuren | Thermo Fisher Scientific | D-1306 | |
| Buffer RPE | Qiagen | 79216 | Wasbuffer 2 |
| Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | Wasbuffer 1 |
| Control-miRNA-mimic (kunstmatig gesynthetiseerd miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Niet toegewezen | 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3’ (sense) 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (antisense) |
| Cy3-gelabelde dubbelstrengs oligonucleotiden | Takara Bio Inc. | MIR7900 | |
| Fluoresceïne-gelabelde Lotus tetragonolobus lectin | Vector Laboratories Inc | FL-1321 | |
| In vivo-jetPEI | Polyplus | 101000021 | |
| MicroAmp Optical 96-well reactieplaat voor qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reactieplaat |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Kleeffolie voor 96-well reactieplaat |
| miRNA-146a-5p mimic (kunstmatig gesynthetiseerd miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Niet toegewezen | 5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU UT-3′ (sense) 5’-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3′ (antisense) |
| miRNA-146a-5p primer | Qiagen | MS00001638 | Niet beschikbaar omdat Qiagen qRT-PCR kits heeft gewijzigd (van miScript miRNA PCR systeem naar miRCURY LNA miRNA PCR Systeem vanaf mei 2021) |
| miRNA-181b-5p mimic (kunstmatig gesynthetiseerd miRNA) | Gene design | Niet toegewezen | 5’-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG GUU-3’ |
| miRNA-181b-5p primer | Qiagen | MS00006083 | Niet beschikbaar omdat Qiagen qRT-PCR kits heeft gewijzigd (van miScript miRNA PCR systeem naar miRCURY LNA miRNA PCR Systeem vanaf mei 2021) |
| miRNA-5100-mimic (kunstmatig gesynthetiseerd miRNA) | Gene design | Niet toegewezen | 5’-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3′ |
| miRNA-5100-primer | Qiagen | MS00042952 | Niet beschikbaar omdat Qiagen qRT-PCR kits heeft gewijzigd (van miScript miRNA PCR systeem naar miRCURY LNA miRNA PCR Systeem vanaf mei 2021) |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Membraan verankerde spinkolom in een 2,0-mL opvangbuis |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | Niet beschikbaar omdat Qiagen qRT-PCR kits heeft gewijzigd (van miScript miRNA PCR systeem naar miRCURY LNA miRNA PCR Systeem vanaf mei 2021) |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Niet beschikbaar omdat Qiagen qRT-PCR kits heeft gewijzigd (van miScript miRNA PCR systeem naar miRCURY LNA miRNA PCR Systeem vanaf mei 2021) |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | Biopolymeer spinkolommen in een 2,0-mL opvangbuis |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Fenol/guanidine gebaseerde lysis reagent |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR systeem | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software versie 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software |
| RNase-vrij water | Qiagen | 129112 | |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | Niet beschikbaar omdat Qiagen qRT-PCR kits heeft gewijzigd (van miScript miRNA PCR systeem naar miRCURY LNA miRNA PCR Systeem vanaf mei 2021) |
| Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound) | Sakura Finetek Japan Co.,Ltd. | Niet toegewezen |
Referenties
- Mohr, A. M., Mott, J. L. Overview of microRNA biology. Seminars in Liver Disease. 35 (1), 3-11 (2015).
- Bushati, N., Cohen, S. M. microRNA functions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 175-205 (2007).
- Simpson, K., Wonnacott, A., Fraser, D. J., Bowen, T.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
