De klinische evaluatie van spasticiteit op basis van de Hoffmann-reflex (H-reflex) en met behulp van elektrische stimulatie van perifere zenuwen is een gevestigde methode. Hier bieden we een protocol voor een terminale en directe zenuwstimulatie voor H-reflexkwantificering in de voorpoot van de muis.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Terminale H-reflexmetingen bij muizen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De Hoffmann-reflex (H-reflex), als een elektrisch analoog aan de rekreflex, maakt elektrofysiologische validatie van de integriteit van neurale circuits mogelijk na verwondingen zoals ruggenmergbeschadiging of beroerte. Een toename van de H-reflexrespons, samen met symptomen zoals niet-vrijwillige spiercontracties, pathologisch verhoogde rekreflex en hypertonie in de overeenkomstige spier, is een indicator van spasticiteit na een beroerte (PSS).
In tegenstelling tot eerder zenuw-niet-specifieke transcutane metingen, presenteren we hier een protocol om de H-reflex direct op de ulnaire en mediane zenuwen van de voorpoot te kwantificeren, die met kleine wijzigingen van toepassing is op de tibiale en heupzenuw van de achterpoot. Op basis van de directe stimulatie en de aanpassing aan verschillende zenuwen, vertegenwoordigt de methode een betrouwbaar en veelzijdig hulpmiddel om elektrofysiologische veranderingen in spasticiteitsgerelateerde ziektemodellen te valideren.
Inleiding
De Hoffmann-reflex (H-reflex), genoemd naar de fysioloog Paul Hoffmann, kan worden opgeroepen door elektrische stimulatie van perifere zenuwen, die axonen van sensorische en motorische neuronen dragen die voortkomen uit en leiden tot dezelfde spieren. Het is het elektrisch geïnduceerde analoog van de monosynaptische rekreflex en deelt hetzelfde pad1. In tegenstelling tot de spierrek is de H-reflex het gevolg van elektrische stimulatie. Wanneer perifere zenuwen elektrisch worden gestimuleerd bij een lage stroomintensiteit, worden de Ia-afferente vezels meestal eerst gedepolariseerd vanwege hun grote axondiameter2. Hun actiepotentialen prikkelen alfamotorneuronen (αMN's) in het ruggenmerg, die op hun beurt actiepotentialen uitlokken die langs de αMN-axonen naar de spier reizen (figuur 1). Deze cascade genereert een spierrespons met kleine amplitude, weerspiegeld in de zogenaamde H-golf. Door de stimulusintensiteit geleidelijk te verhogen, neemt de amplitude van de H-golf toe door de rekrutering van extra motoreenheden. Vanaf een bepaalde stimulusintensiteit worden actiepotentialen in de dunnere axonen van de αMN's direct opgewekt, die wordt geregistreerd als de M-golf. Deze M-golf verschijnt met een kortere latentie dan de H-golf (figuur 2). Als de stimulatie-intensiteit verder wordt verhoogd, wordt de amplitude van de M-golf groter door de rekrutering van meer αMN-axonen, terwijl de H-golf geleidelijk kleiner wordt. De H-golf kan worden onderdrukt bij hoge stimulusintensiteiten als gevolg van antidromale backpropagatie van actiepotentialen in de αMN-axonen. Deze getriggerde actiepotentialen botsen met die van de Ia-stimulatie en kunnen elkaar dus opheffen. Bij supramaximale stimulusintensiteiten komen orthodromale (naar de spier) en antidromale (naar het ruggenmerg) actiepotentialen voor in alle MN-axonen; de eerste geeft aanleiding tot de maximale M-golfamplitude (Mmax), terwijl de laatste resulteert in volledige afschaffing van de H-reflex3.
Voor de evaluatie van post-stroke spasticiteit (PSS) of dwarslaesie (SCI) is de H-reflex gebruikt om de neurale basis van beweging en spasticiteit bij mensen te beoordelen1. Een verbeterde kwantificering van de verandering in de H-reflex tussen metingen en tussen proefpersonen wordt bereikt door gebruik te maken van de verhouding van de H- en M-golf (H/M-verhouding). Als alternatief wordt de snelheidsafhankelijke depressie (RDD) gemeten met behulp van een reeks oplopende frequenties (bijv. 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 en 5,0 Hz). De RDD weerspiegelt de integriteit van remmende circuits die kunnen worden verstoord door een beroerte of dwarslaesie. Wanneer alle neurale circuits intact zijn, is er een uniforme, frequentie-onafhankelijke onderdrukking van de H-reflex. Als er echter sprake is van verminderde neurale remming als gevolg van een beroerte of dwarslaesie, neemt de onderdrukking van de H-reflex af met toenemende stimulatiefrequentie4.
De juiste elektrofysiologische registratie met behulp van oppervlakte-elektroden kan een uitdaging zijn en kan worden beïnvloed door motorische taken, remmende mechanismen en αMN-prikkelbaarheid5. Bij de transcutane opname bij knaagdieren wordt een stimuluselektrode in de buurt van de tibiale zenuw geplaatst en een opname-elektrode in de buurt van de gerelateerde spieren in de voorpoot. Volgens onze ervaring is de juiste plaatsing van de transcutane elektroden (figuur 1A) echter nog complexer en variabeler bij knaagdieren dan de plaatsing van oppervlakte-elektroden bij mensen. Dit kan leiden tot verschillen in lengte, frequentie en stimulatie-intensiteit die nodig zijn om de H-reflex op te wekken. Deze methodologische uitdagingen zouden kunnen verklaren waarom er slechts een zeer beperkt aantal H-reflex meetstudies zijn (bijvoorbeeld in experimentele beroertemodellen 3,4 en andere spasticiteitsmodellen6). Een nauwkeurige (langdurige) stimulatie en registratie van de H-reflex op individuele zenuwen zou in principe kunnen worden bereikt met behulp van implanteerbare elektroden rond de doelzenuw 7,8. Vanwege de uitdagende operatie met mogelijke bijwerkingen voor het dier en mogelijke instabiliteit van de sonde, is deze aanpak geen standaard geworden in het veld. De hier gepresenteerde methode vereist ook enige chirurgische expertise. Het maakt echter een nieuwe, nauwkeurige stimulatie en registratie van geïsoleerde zenuwen in vivo mogelijk met behulp van lage stimulatie-intensiteiten, waardoor gelijktijdige stimulatie van naburige zenuwen wordt vermeden.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Europese en nationale dierverzorgingswetten en institutionele richtlijnen en werden goedgekeurd door het Landesamt für Natur-, Umwelt- und Verbraucherschutz Noordrijn-Westfalen (Az: 81-02.04.2019.A309). Het protocol is geoptimaliseerd voor volwassen muizen (ca. 8-16 weken oude C57Bl/6J muizen) en de voorpoot opname. Het kan eenvoudig worden aangepast door de respectieve zenuwen van de achterpoot te stimuleren en de achterpootspieren te registreren (figuur 1B). Een beschrijving van de opname- en stimulatie-elektroden is toegevoegd aan de materiaaltabel. Houd er rekening mee dat het protocol alleen wordt gebruikt voor een terminalmeting.
1. Voorbereiding
- Weeg het dier en start de anesthesie door via i.p. een mengsel van ketamine (100 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) te injecteren.
- Houd de muis in de warmhouddoos totdat de chirurgische tolerantie is bereikt. Wacht een paar minuten totdat de muis kalm is, de ademhaling stabiel is en reflexen afwezig zijn. Controleer de diepte van de anesthesie door het gebrek aan reactie op de teenknijp te meten.
- Draai de muis op zijn rug en plaats hem op een verwarmingspad (optimaal zou feedbackgestuurde verwarming zijn met behulp van een rectale temperatuursonde). Bevestig de voorpoten met tape. Zorg er hier voor dat de tape zo is geplaatst dat de meetelektroden gemakkelijk in de voorpoten kunnen worden gestoken.
- Plaats een rectale sonde om de temperatuur van het dier te meten en bevestig deze met tape. Breng oogzalf aan om te voorkomen dat de ogen uitdrogen.
2. Operatie
OPMERKING: De stabiele toestand van het verdoofde dier, d.w.z. ademhaling, temperatuur en verlies van reflexen, moet tijdens de procedure regelmatig worden gecontroleerd. De directe zenuw H-golf meetprocedure wordt getoond voor de radiale/ulnaire/mediane zenuw van de voorpoot (figuur 3A). De meting kan ook worden aangepast aan de achterpoot (ischias/tibiale zenuw) met modificaties.
- Voor een beter overzicht van het operatiegebied verwijdert u het haar vooraf met een elektrisch scheermes of een schaar op een aparte plaats. Voor meer ervaren chirurgen is dit alleen optioneel.
OPMERKING: Desinfectie is hier niet nodig, omdat dit een eindexperiment is. Het dier wordt later geëuthanaseerd. - Til de huid op met een pincet en maak een incisie van ongeveer 1 cm in de huid langs de ventro-achterste as van de voorpoot (gebied boven de oksel en thorax) met een fijne afgeronde schaar.
- Verwijder voorzichtig het bindweefsel en leg de spier en zenuw eronder bloot. Verwijder de blootgestelde musculus pectoralis profundus met een tang om toegang te krijgen tot de mediane zenuw (figuur 3E, F). Verwijder kleine hoeveelheden bloed en weefselvloeistof met zacht weefsel.
- Snijd in de volgende stap voorzichtig de borst of okselspier van boven naar beneden om de zenuwbundel eronder bloot te leggen. Bevrijd de zenuwbundel van het bind- en spierweefsel over een lengte van ongeveer 1,5 cm.
OPMERKING: Hier moet bijzondere aandacht worden besteed aan het niet beschadigen van de bloedvaten die parallel lopen aan de mediane zenuw. Snijd bij het snijden van het weefsel altijd langs de zenuw om te voorkomen dat deze gewond raakt. Als dit gebeurt, verwijder dan lekkende vloeistof en bloed met een wattenstaafje. Astereo microscoop is niet nodig voor het hele experiment, maar het kan nuttig zijn voor de voorbereiding van de zenuwen. - Scheid de ulnaire en mediane zenuw van de voorpoot voorzichtig met behulp van een gebogen glazen pipet (figuur 3E). De bovenste van de twee zenuwen is de nervus ulnaris en de onderste is de mediane zenuw.
OPMERKING: Zorg er bij het scheiden van de zenuwen van elkaar voor dat het bloedvat eronder niet gewond raakt.
3. Plaatsing van de elektrode
- Plaats de stimulatiehaakelektroden parallel op een afstand van 0,5-1,0 mm en gebruik een micromanipulator om de dubbele haak dicht bij de zenuw te plaatsen.
- Gebruik de glazen haak als hulpmiddel om de nervus ulnaris op de stimulatiehaakelektroden te tillen. Trek de elektrode met de zenuw terug en scheid deze van andere zenuwen met ongeveer 1-2 mm met behulp van de micromanipulator (figuur 3D, F).
- Plaats de elektroden langs de lange as van de poot om de overspraak tussen de spieren te verminderen.
OPMERKING: De plaatsing van de elektroden is erg belangrijk, maar moeilijk te standaardiseren vanwege de individuele anatomie. Het vereist een ervaren chirurg om de elektroden correct te plaatsen. De draden kunnen ook worden verplaatst als de signaalamplitude onbevredigend is. - Droog oppervlakkig de elektrodehaken die aan de zenuw zijn bevestigd en breng vaseline aan met behulp van een spuit om elektrische isolatie van het aangrenzende weefsel te bieden.
OPMERKING: Er moet voor worden gezorgd dat er voldoende vaseline op de elektrode en ook tussen de twee haken wordt aangebracht om elektrische isolatie te garanderen en te voorkomen dat de zenuwen uitdrogen.
4. Plaatsing van de opname- en referentie-elektroden
- Om de H-reflex te meten, plaatst u de EMG-elektroden intramusculair in de voorpoot. Plaats bovendien de referentie-elektrode subcutaan in de achterpoot (bijvoorbeeld met behulp van een minutenpin), vastgehouden door een miniatuur krokodillenklem (figuur 3B).
- Wanneer de stimulator is ingeschakeld, observeer dan een succesvolle stimulatie als kleine spiertrekkingen van de voorpoot. De minimale stimulatiestroom om de M-golf en kleine zichtbare spiertrekkingen in de voorpoot uit te lokken, moet in het bereik van 10-50 μA liggen.
OPMERKING: Als er geen spiertrekkingen zichtbaar zijn bij 50 μA, pas dan de stimulatie-elektroden aan en breng vaseline opnieuw aan. Ook bij muizen is het niet ongebruikelijk dat de M-golf verschijnt bij lagere stimulatie-intensiteiten dan de H-golf5.
5. Meting
- Herhaal de stimulatie van de zenuw 15 keer met elk 0,2 ms lange pulsen. Met pauzes van 2 minuten tussen sets stimuli wordt de frequentie verhoogd van 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 naar 5 Hz.
OPMERKING: Deze frequenties zijn nodig bij het achteraf berekenen van de RDD. Alle EMG-gegevens worden geregistreerd, gedigitaliseerd en geanalyseerd met behulp van software, bijvoorbeeld Spike2-software (CED, versie 7.19). De grootste H-golf amplitude wordt verwacht bij 0,1 Hz. Hoe hoger de frequentie, hoe kleiner de amplitude van de H-golf wordt door de RDD. - Na het experiment offert u het dier volgens het IACUC-protocol van het instituut. In dit experiment werd transcardiale perfusie bij muizen uitgevoerd met PBS en 4% PFA onder diepe anesthesie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Selecteer uit de n = 15 stimulatieproeven per stimulatiefrequentie en poot ten minste n = 10 succesvolle opnames voor de analyse. Proeven met meetfouten (bijv. ontbrekende M-golf) zijn uitgesloten van de analyse. Analyseer elke studie afzonderlijk en genereer later een gemiddelde voor groeps- / tijdvergelijkingen. De latentie tussen stimulatie en verschijning van de M-golf en H-golf wordt voor elke proef geregistreerd. In onze ervaring treedt de M-golf ongeveer 2 ms na stimulatie op en de H-golf na 6-8 ms, vanwege de lan...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In tegenstelling tot eerder beschreven transcutane H-reflexmetingen bij muis6, bieden we een meer directe en zenuwspecifieke meting. Deze nieuwe benadering kan worden toegepast op de zenuwen van de voor- en achtertak (bijv. De mediane, ulnaire en radiale zenuwen, en respectievelijk de tibiale en ischiaszenuwen), waardoor deze methode aanpasbaar is als een diagnostisch hulpmiddel voor vele ziektemodellen (bijv. Beroerte, multiple sclerose, amyotrofische laterale sclerose, traumatisch hersenletsel e...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.
Dankbetuigingen
De auteurs erkennen dankbaar de steun van T. Akay, Dalhousie University, tijdens een bezoek van MG aan zijn lab. Dit werk werd ondersteund door financiering van de Friebe Foundation (T0498/28960/16) en de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project-ID 431549029 - SFB 1451.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Absorbent onderlaag | VWR | 115-0684 | |
| AD-converter | Cambridge Electronic Design, UK | CED 1401micro | |
| Versterker | Workshop Zoologisch Instituut, UoC | - | |
| Digitale stimulator | Workshop Zoologisch Instituut, UoC | MS 501 | |
| EMG-elektroden | Workshop Zoologisch Instituut, UoC | Twee gedraaide, geïsoleerde koperen draden (50 µm buitendiameter) werden gesoldeerd aan een mannelijke stekker en aangesloten op een differentiële versterker. | |
| Oogzalf | Bayer | Bepanthen | |
| Glazen pipet | Workshop Zoologisch Instituut, UoC | - | Maak een glazen pipet gebogen tot een eenvoudige glazen haak in de vlam van een Bunsenbrander. |
| Verwarmingsbox | MediHeat | MediHeat V1200 | |
| Verwarmingskussen | WPI | 61840 Verwarmingskussen | |
| Haakelektroden | Workshop Zoologisch Instituut, UoC | - | Om de elektroden te produceren, buig miniatuurpennen van roestvrij staal aan één uiteinde tot haken en steek ze in stompe cannula's om direct mechanisch contact te creëren. Soldeer het uiteinde van de canule aan koperen draden (lengte ca. 50 cm), die zijn aangesloten op een stimulatie- of registratieapparaat. |
| Ketamine | Pfizer | Ketavet | |
| Rectorale sonde | WPI | RET-3 | |
| Stimulatorisolatie-eenheid | Workshop Zoologisch Instituut, UoC | MI 401 | |
| Sterilisator | CellPoint Scientific | Germinator 500 | Rotina-ontsmetting van de chirurgische apparatuur voor en na de operatie moet gebeuren door warmte-sterilisatie. Ontsmet instrumenten gedurende 15 s in het verwarmde glazen parelbad (260°C). |
| Temperatuurregelaar | WPI | ATC200 | |
| Vaseline | Bayer | - | |
| Xylazin | Bayer | Rompun |
Referenties
- Palmieri, R. M., Ingersoll, C. D., Hoffman, M. A. The Hoffmann reflex: methodologic considerations and applications for use in sports medicine and athletic training research. Journal of Athletic Training. 39 (3), 268-277 (2004).
- Henneman, E., Somjen, G., Carpenter, D. O. Excitability and inhibitibility of motoneurons of different sizes. Journal of Neurophysiology. 28 (3), 599-620 (1965).
- Toda, T., Ishida, K., Kiyama, H., Yamashita, T., Lee, S. Down-regulation of KCC2 expression and phosphorylation in motoneurons, and increases the number of in primary afferent projections to motoneurons in mice with post-stroke spasticity. PLoS ONE. 9 (12), 114328(2014).
- Lee, S., Toda, T., Kiyama, H., Yamashita, T. Weakened rate-dependent depression of Hoffmann’s reflex and increased motoneuron hyperactivity after motor cortical infarction in mice. Cell Death & Disease. 5 (1), 1007(2014).
- Knikou, M. The H-reflex as a probe: Pathways and pitfalls. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 1-12 (2008).
- Wieters, F., et al. Introduction to spasticity and related mouse models. Experimental Neurology. 335, 113491(2020).
- Pearson, K. G., Acharya, H., Fouad, K. A new electrode configuration for recording electromyographic activity in behaving mice. Journal of Neuroscience Methods. 148 (1), 36-42 (2005).
- Akay, T. Long-term measurement of muscle denervation and locomotor behavior in individual wild-type and ALS model mice. Journal of Neurophysiology. 111 (3), 694-703 (2014).
- Haghighi, S. S., Green, D. K., Oro, J. J., Drake, R. K., Kracke, G. R. Depressive effect of isoflurane anesthesia on motor evoked potentials. Neurosurgery. 26 (6), 993(1990).
- Chang, H. -Y., Havton, L. A. Differential effects of urethane and isoflurane on external urethral sphincter electromyography and cystometry in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 295 (4), 1248-1253 (2008).
- Nolan, J. P. Section 4: Nervous system (Br. J. Pharmacol). Clinical pharmacology. , 295-310 (2012).
- Struck, M. B., Andrutis, K. A., Ramirez, H. E., Battles, A. H. Effect of a short-term fast on ketamine-xylazine anesthesia in rats. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 50 (3), 344-348 (2011).
- Zandieh, S., Hopf, R., Redl, H., Schlag, M. G. The effect of ketamine/xylazine anesthesia on sensory and motor evoked potentials in the rat. Spinal Cord. 41 (1), 16-22 (2003).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
