Methodenartikel

Isolatie en profilering van menselijke primaire mesenteriale arteriële endotheelcellen op transcriptoomniveau

DOI:

10.3791/63307

⸱

14 maart 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Diabetes Complications and Metabolism, City of Hope, 2Department of Bioengineering, University of California San Diego, 3Irell and Manella Graduate School of Biological Sciences, City of Hope

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol beschrijft de isolatie, cultuur en profilering van endotheelcellen uit de menselijke mesenteriale slagader. Daarnaast wordt een methode aangeboden om de menselijke slagader voor te bereiden op ruimtelijke transcriptomics. Proteomics, transcriptomics en functionele assays kunnen worden uitgevoerd op geïsoleerde cellen. Dit protocol kan worden hergebruikt voor elke middelgrote of grote slagader.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endotheelcellen (EC's) zijn cruciaal voor de vasculaire en lichaamsfunctie door hun dynamische reactie op omgevingssignalen. Het ophelderen van het transcriptoom en epigenoom van EC's is van het grootste belang om hun rol in ontwikkeling, gezondheid en ziekte te begrijpen, maar is beperkt in de beschikbaarheid van geïsoleerde primaire cellen. Recente technologieën hebben de high-throughput profilering van EC-transcriptoom en epigenoom mogelijk gemaakt, wat heeft geleid tot de identificatie van voorheen onbekende EC-celsubpopulaties en ontwikkelingstrajecten. Hoewel EC-culturen een nuttig hulpmiddel zijn bij het verkennen van EC-functie en disfunctie, kunnen de kweekomstandigheden en meerdere passages externe variabelen introduceren die de eigenschappen van inheemse EC veranderen, waaronder morfologie, epigenetische toestand en genexpressieprogramma. Om deze beperking te overwinnen, demonstreert het huidige artikel een methode om menselijke primaire EC's te isoleren van donor mesenterische slagaders met als doel hun oorspronkelijke toestand vast te leggen. EC's in de intimale laag worden mechanisch en biochemisch gedissocieerd met behulp van bepaalde enzymen. De resulterende cellen kunnen direct worden gebruikt voor bulk-RNA of eencellige RNA-sequencing of verguld voor kweek. Daarnaast wordt een workflow beschreven voor de voorbereiding van menselijk arterieel weefsel op ruimtelijke transcriptomics, specifiek voor een commercieel beschikbaar platform, hoewel deze methode ook geschikt is voor andere ruimtelijke transcriptoomprofileringstechnieken. Deze methodologie kan worden toegepast op verschillende vaten verzameld van een verscheidenheid aan donoren in gezondheids- of ziektetoestanden om inzicht te krijgen in EC transcriptionele en epigenetische regulatie, een cruciaal aspect van endotheelcelbiologie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Langs het lumen van bloedvaten zijn endotheelcellen (EC's) cruciale regulatoren van vasculaire tonus en weefselperfusie. EC's zijn opmerkelijk in hun vermogen om te reageren op de extracellulaire omgeving en zich aan te passen aan veranderingen in de dynamiek en samenstelling van de bloedstroom. Deze dynamische responsen worden gemedieerd door een netwerk van intracellulaire signaleringsgebeurtenissen, waaronder transcriptionele en post-transcriptionele modulaties met spatio-temporele resolutie. De ontregeling van deze reacties is betrokken bij vele pathologieën, waaronder maar niet beperkt tot hart- en vaatziekten, diabetes en kanker 1,2.

Een groot deel van de studies maakt gebruik van cellijnen of diermodellen om EC-transcriptoom te ondervragen. De eerste is een handig hulpmiddel, gezien het relatieve gebruiksgemak en de goedkoopheid. Seriële kweek kan echter fenotypische veranderingen in EC's introduceren, zoals fibroblastische kenmerken en een gebrek aan polarisatie, waardoor ze worden losgekoppeld van hun in vivo toestand3. De primaire cellen, bijvoorbeeld human umbilical vein EC (HUVEC) zijn een populaire keuze sinds de jaren 1980, maar zijn afgeleid van een ontwikkelingsvasculair bed dat niet bestaat bij volwassenen, waardoor het onwaarschijnlijk is dat het volwassen EC's volledig vertegenwoordigt. Dieren, met name muismodellen, vertegenwoordigen beter de fysiologische of pathofysiologische omgeving van EC's en maken ondervraging van transcriptomen mogelijk als gevolg van genetische verstoring. Murine EC's kunnen worden geïsoleerd uit verschillende weefsels, waaronder de aorta, longen en vetweefsels met behulp van op enzymen gebaseerde procedures 4,5,6,7. De geïsoleerde cellen kunnen echter niet voor meerdere passages worden gebruikt, tenzij ze6 transformeren en zijn vaak beperkt in aantallen, wat pooling van meerdere dieren vereist 5,8,9.

De komst van nieuwe technologieën die de scheepsarchitectuur op transcriptomisch niveau verkennen, met name met eencellige resolutie, heeft een nieuw tijdperk van endotheelbiologie mogelijk gemaakt door nieuwe functies en eigenschappen van EC's 5,10,11,12,13,14 te onthullen. Een rijke bron gebouwd door Tabula Muris-onderzoekers verzamelde eencellige transcriptomische profielen van 100.000 cellen, waaronder EC's in 20 verschillende muizenorganen15, die zowel gemeenschappelijke EC-markergenen als unieke transcriptomische handtekeningen onthulden met inter- en intraweefselverschillen 5,13. Niettemin zijn er duidelijke verschillen tussen muis en mens in genoom, epigenoom en transcriptoom, vooral in de niet-coderende regio's 16,17,18. Deze bovengenoemde nadelen benadrukken het belang van analyse van EC's met behulp van menselijke monsters om een getrouw profiel te krijgen van EC's in hun oorspronkelijke staat in gezondheid en ziekte.

De meeste EC-isolatiemethoden zijn gebaseerd op fysieke dissociatie door homogenisatie, fijnsnijden en fijnsnijden van het weefsel vóór incubatie met proteolytische enzymen gedurende verschillende tijden. De enzymen en aandoeningen variëren ook aanzienlijk tussen weefseltypen, van trypsine tot collagenase, alleen of in combinatie gebruikt 19,20,21. Verdere op antilichamen gebaseerde verrijking of zuivering worden vaak opgenomen om de zuiverheid van EC's te vergroten. Doorgaans worden antilichamen tegen EC-membraanmarkers, bijvoorbeeld CD144 en CD31, geconjugeerd aan magnetische kralen en toegevoegd aan de celsuspensie22,23. Een dergelijke strategie kan in het algemeen worden aangepast voor EG-isolatie van meerdere menselijke en muizenweefsels, met inbegrip van de in dit protocol geïntroduceerde technieken.

In hun oorspronkelijke toestand interageren EC's met meerdere celtypen en kunnen ze bestaan in vasculaire niches waar celnabijheid cruciaal is voor de functie. Hoewel single-cell en single-nuclear RNA-sequencing (scRNA en snRNA-seq) studies van het grootste belang zijn geweest voor de recente doorbraken in het beschrijven van EC-heterogeniteit, verstoort het dissociatieproces weefselcontext en cel-celcontact, die ook belangrijk zijn om de EC-biologie te begrijpen. Ontwikkeld in 2012 en uitgeroepen tot Methode van het Jaar in 202024, is ruimtelijke transcriptoomprofilering gebruikt om wereldwijde genexpressie te profileren met behoud van de ruimtelijke kenmerken in verschillende weefsels, waaronder hersenen25, tumor26 en vetweefsel27. De technologieën kunnen worden gericht, met behulp van gespecialiseerde sondes die specifiek zijn voor bepaalde RNA-sequenties die zijn bevestigd aan affiniteitsreagentia of fluorescerende tags, waardoor geselecteerde genen met subcellulaire resolutie 28,29,30,31 worden gedetecteerd. Ze kunnen ook ongericht zijn32,33, meestal met behulp van ruimtelijk barcoded oligonucleotiden om RNA te vangen, die samen worden omgezet in cDNA voor latere seq-bibliotheekvoorbereiding en dus het voordeel hebben dat ze de genexpressie van het hele weefsel op een onbevooroordeelde manier afleiden. Ruimtelijke resolutie wordt momenteel echter niet bereikt op een enkel cellulair niveau met commercieel beschikbare technologieën. Dit kan tot op zekere hoogte worden ondervangen met data-integratie met scRNA-seq-gegevens, waardoor uiteindelijk het in kaart brengen van eencellig transcriptoom in een complexe weefselcontext mogelijk is met behoud van de oorspronkelijke ruimtelijke informatie34.

Hierin wordt een workflow beschreven om EC-transcriptoom te profileren met behulp van menselijke superieure mesenteriale slagader, een perifere slagader die is gebruikt om vaatverwijding, vasculaire remodellering, oxidatieve stress en ontsteking te bestuderen 35,36,37. Twee technieken worden beschreven: 1) om EC's te isoleren en te verrijken uit de intima van bloedvaten die mechanische dissociatie en enzymatische spijsvertering combineren, geschikt voor eencellige transcriptoomsequencing of daaropvolgende in vitro cultuur; 2) het voorbereiden van arteriële secties voor ruimtelijke transcriptoomprofilering (figuur 1). Deze twee technieken kunnen onafhankelijk of complementair worden uitgevoerd om EC's en hun omliggende cellen te profileren. Bovendien kan deze workflow worden aangepast voor gebruik op elke middelgrote of grote slagader.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menselijke weefselstudies werden uitgevoerd op gedeïdentificeerde exemplaren verkregen van het Southern California Islet Cell Resource Center in City of Hope. De onderzoekstoestemmingen voor het gebruik van postmortale menselijke weefsels werden verkregen van de nabestaanden van de donoren en ethische goedkeuring voor deze studie werd verleend door de Institutional Review Board of City of Hope (IRB nr. 01046).

1. Fysieke dissociatie (geschatte tijd: 1-2 uur)

  1. Plaats een verse slagader op een schaal van 10 cm en was met steriele Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (D-PBS).
  2. Verwijder met een steriele tang en dissectieschaar het vet en de buitenste bindweefsels totdat het vat schoon is. Meet de lengte van het vat met een liniaal buiten de schaal en maak foto's voor de registratie (figuur 1A).
  3. Geschikte verteringsbuffer voorverwarmen tot 37 °C: voor scRNA-seq celdissociatie-enzym gebruiken; gebruik voor celkweektests 1-6 mg /ml Collagenase D, 3 mg / ml van bacteriën afgeleid protease, 100 mM HEPES, 120 mM NaCl, 50 mM KCl, 5 mM glucose, met 1 mM CaCl2 6,38 (pH 7,0, vereist geen aanpassing) toegevoegd 5 minuten voorafgaand aan gebruik.
  4. Neem de mesenteriale slagader (meestal met een diameter van 6-8 mm) en knip in de lengte met een schaar om het vat lumen verticaal te openen.
  5. Bevestig het vat met behulp van naalden op zwarte was op alle vier de hoeken, waardoor de intima bloot komt te liggen (figuur 1B).
  6. Voeg 1 ml voorverwarmde verteringsbuffer toe aan intima. Neem een steriel scalpel en schraap het lumen van het vat twee keer voorzichtig.
    OPMERKING: Het doel van deze procedure is om de intimale laag te dissociëren, die mogelijk oefening nodig heeft. Er moet voldoende kracht worden uitgeoefend om endotheel te verwijderen, maar niet zozeer dat ook de diepere weefsellagen worden verwijderd, wat de EC-representatie zal verminderen.
  7. Breng de verteringsbuffer over in een buis van 5 ml. Voeg 1 ml verteringsbuffer toe aan de intima en pipetteer voorzichtig op en neer om de resterende cellen te verzamelen en voeg toe aan de buis van 5 ml. Incubeer cellen bij 37 °C en draai gedurende 5 minuten bij 150 tpm.
  8. Voeg 2 ml M199 medium (of D-PBS als u verder gaat met scRNA-seq) toe aan de celsuspensie om de enzymatische reactie te doven. Meng voorzichtig en centrifugeer bij 4 °C, 600 x g gedurende 5 min.
  9. Verwijder het supernatant en bewaar het supernatant afzonderlijk in cultuur als controle om te observeren of alle cellen in stap 1.8 in de pellet zijn gevangen. Resuspend de celkorrel in 1 ml M199 medium (of D-PBS als u verder gaat met scRNA-seq).
  10. Beoordeel de levensvatbaarheid van de cel door 10 μL trypan blauw te mengen met 10 μL celvoorraad. Observeer de celmorfologie en tel de cellen met behulp van een hemocytometer.
    OPMERKING: Op dit punt kunnen cellen worden gebruikt voor eiwit- of RNA-kwantificering of in vitro worden gekweekt met behulp van EC-kweekmedia volgens standaardprotocollen39. Als alternatief kunnen ze worden voorbereid voor sequencing zoals beschreven in de volgende sectie.
  11. Voor de kweek, coat twee putten van een 6-well plaat door 500 μL bevestigingsreagens gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in putten te pipetteren. Na verwijdering van het bevestigingsreagens en wassen met steriele D-PBS, doseer de volledige celvoorraad in één put en het supernatant wordt als controle in de tweede put gehouden.

2. Voorbereiding voor scRNA-seq studies (geschatte tijd: 3-4 h)

  1. Centrifugeer de celvoorraad vanaf stap 1.11 bij 4 °C, 600 x g gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en vul de pellet voorzichtig opnieuw op met een P1000-pipet en een punt met brede boring in 1 ml 0,04% runderserumalbumine (BSA) in D-PBS. Meng goed om een eencellige suspensie te garanderen.
  2. Laat de oplossing door een zeef van 40 μm gaan om celresten te verwijderen. Als er vuil achterblijft, ga dan door een tweede zeef in 4 ml van 0,04% BSA in D-PBS.
  3. Centrifugeer bij 4 °C, 600 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en resuspend de pellet in 500 μL van 0,04% BSA in D-PBS met behulp van een P1000-pipet met een pipetpunt met brede boring. Meng goed om een eencellige suspensie te garanderen.
  4. Beoordeel de levensvatbaarheid van de cel door 10 μL celvoorraad te mengen met 10 μL trypan blauw. Met behulp van een hemocytometer, observeer de morfologie, bepaal of er een eencellige suspensie is zonder clusters, controleer op weefselresten en bereken het aantal levende en dode cellen.
  5. Als cellen geclusterd zijn of er vuil achterblijft, herhaal dan het wassen met 0,04% BSA in D-PBS of ga opnieuw door de zeef van 40 μm.
    OPMERKING: Hoewel dit de opbrengst zal verminderen, is het belangrijk dat cellen in een schone eencellige suspensie bestaan voor optimale sequencing.
  6. De eencellige suspensie kan worden gebruikt voor scRNA-seq.

3. Ruimtelijke transcriptoomprofilering (geschatte tijd: 3-4 uur)

  1. Voeg isopentaan (2-methylbutaan) toe aan een metalen bus en koel af in vloeibare stikstof (LN2) of droogijs (LN2 heeft de voorkeur omdat het de temperatuur lager zal brengen dan droogijs). Giet optimale snijtemperatuurverbinding (OCT) in putten van gelabelde plastic cryomolden en zorg ervoor dat er geen bubbels ontstaan en verwijder de bubbels die verschijnen. Laat cryomold op droogijs afkoelen.
  2. Snijd ten minste twee coronale secties, 1 cm lang van het vat. Gebruik een lange (12") tang om het weefsel onder te dompelen in isopentaan totdat het bevroren is. Dompel het weefsel snel onder in OCT bij oriëntatie met het lumen zichtbaar in het midden. Zorg ervoor dat u eventuele bubbels verwijdert, vooral die naast het weefsel.
  3. Gebruik een lange (12") tang, pak de cryomolden vast en houd ze in de metalen bus. Hoewel de basis van de mallen zich in de vloeistof moet bevinden, mag deze niet te diep zijn om isopentaan over het weefsel te laten lopen. Let op het bevriezen, de OCT zal geleidelijk wit worden van buitenaf in 1-2 min.
  4. Bewaar deze secties in een verzegelde container bij -80 °C gedurende maximaal 6 maanden.
    OPMERKING: Bewaar te allen tijde monsters op droogijs en laat niet meer dan één vries-dooicyclus toe. Dit weefsel kan worden gebruikt voor histologische analyse, RNA / DNA-fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) of ruimtelijke transcriptomics, die nu zullen worden beschreven.
  5. Stel de cryostaattemperatuur in op -20 °C voor de kamer en -10 °C voor de monsterkop. Equilibrate OCT ingebed vat secties, messen, borstels, en glijden tot -20 °C in de cryostaat gedurende ongeveer 30 minuten. Reinig tijdens het balanceren de machine en alle apparatuur die de secties kan raken, inclusief het mes, met 70% ethanol gevolgd door RNase-decontaminatieoplossing.
  6. Bevestig het monster door een kleine hoeveelheid OCT op het cirkelvormige cryostaatblok te doseren en het monster erop te plaatsen voordat het bevriest. Plaats het blok in het midden van de monsterkop en schroef het blok op zijn plaats met een hoge zwarte handgreep aan de linkerkant. Snijd overtollige OCT rond het schip weg.
  7. Stel de snijdikte in op 10 μm op de cryostaat, snijd ongeveer 60 secties en plaats ze in een voorgekoelde buis van 1,5 ml. Deze secties zullen worden gebruikt om de RNA-kwaliteit te beoordelen. Voeg bij verwijdering uit cryostaat onmiddellijk 1 ml RNA-extractiereagens en vortex toe totdat de secties volledig zijn opgelost.
  8. Voeg 200 μL chloroform toe en meng tot de oplossing lijkt op een aardbeienmilkshake. Centrifugeer bij 11.200 x g gedurende 10 min bij 4 °C.
  9. Verzamel de waterige fase (heldere fase bovenop witte en roze lagen) en voeg er 500 μL isopropanol aan toe. Meng door de buizen meer dan 10 keer om te keren en plaats op -80 °C gedurende ten minste 20 minuten.
  10. Centrifugeer bij 11.200 x g gedurende 10 min bij 4 °C. Los de gezuiverde RNA-pellet op in 5 μL RNase-vrij water. Onderzoek het RNA-integriteitsnummer (RIN).
    OPMERKING: Monsters met RIN ≥ 7 hebben de voorkeur, maar RIN ≥ 6 is acceptabel. Het aantal weefselsecties en het volume van de oplossing voor het oplossen van RNA kan optimalisatie vereisen, afhankelijk van het systeem dat wordt gebruikt om ervoor te zorgen dat de uiteindelijke RNA-concentratie binnen het RIN-functiebereik ligt om een nauwkeurige RIN-evaluatie mogelijk te maken.
  11. Oefen het op de juiste manier snijden en plaatsen van secties binnen de fiduciale frames met behulp van gewone glazen dia's voordat u doorgaat met commercieel beschikbare weefseloptimalisatie of genexpressiedia's. Dit kan worden bereikt door vierkanten van 6,5 mm x 6,5 mm op een gewone glasplaat te tekenen, af te koelen tot -20 °C in de cryostaat en secties in dit opvanggebied te plaatsen.
  12. Snijd 10 μm secties met anti-roll plaat op zijn plaats, draai en maak voorzichtig plat door het gedeelte zachtjes aan te raken door de omringende OCT.
  13. Met behulp van RNase-vrije cryostaatborstels plaatst u het weefselgedeelte in het vierkant, met alleen de omringende OCT. Plaats onmiddellijk één vinger (in handschoenen) op de achterkant van het vanggebied om het gedeelte naar de dia te smelten.
  14. Zodra de sectie is blijven plakken, plaatst u de schuif op de cryobar om de sectie te laten bevriezen. Er moet voor worden gezorgd dat weefsel niet vouwt en weefsel boven de afgebakende randen van het fiduciale frame ligt. Snijd indien nodig het weefsel in helften of kwarten langs het lumen met behulp van een mes om ervoor te zorgen dat het vatgedeelte binnen het frame van 6,5 mm x 6,5 mm past.
  15. Snijd 10 μm secties van weefsel volgens 3.12-3.14 op weefseloptimalisatie of genexpressiedia's. Breng de dia over naar een slide mailer die op droogijs is geplaatst. Bewaar dia's bij -80 °C gedurende maximaal 4 weken voordat u verder gaat met gepubliceerde ruimtelijke protocollen33,34.

4. Sequencing data-analyse (geschatte tijd: tot 1 week afhankelijk van de bekendheid met software)

OPMERKING: Ga alleen voor ruimtelijke transcriptomische analyse naar stap 4.8. scRNA-seq-gegevens worden verwerkt met behulp van de gestandaardiseerde pijplijn die is uitgelijnd op menselijk hg38-referentietranscriptoom. Het R-pakket Seurat (v3.2.2) wordt gebruikt om scRNA-seq-gegevens te analyseren volgens gepubliceerde richtlijnen40.

  1. Filter met behulp van gevestigde kwaliteitscontrolestatistieken: zeldzame cellen met zeer hoge aantallen genen (mogelijk multiplets) en cellen met hoge mitochondriale percentages (lage kwaliteit of stervende cellen vertonen vaak mitochondriale besmetting) worden verwijderd.
  2. Normaliseer gegevens met behulp van "sctransform", een methode om de integratie van monsters te verbeteren in vergelijking met log-normalisatie. Deze genormaliseerde gegevens worden gebruikt voor dimensionaliteitsreductie en clustering, terwijl log-genormaliseerde expressieniveaus worden gebruikt voor analyse op basis van genexpressieniveaus, zoals celtypeclassificatie41.
  3. Selecteer markergenen per celtype, bijvoorbeeld bloedplaatjes-endotheelceladhesiemolecuul-1 (PECAM1) en von Willebrand-factor (VWF) voor EC's, lumican (LUM) en procollageen C-Endopeptidase Enhancer (PCOLCE) voor fibroblasten, B-celtranslocatiegen 1 (BTG1) en CD52 voor macrofagen, C1QA en C1QB voor monocyten, en myosine zware keten 11 (MYH11) en transgeline (TAGLN) voor vasculaire gladde spiercellen36.
  4. Bereken het gemiddelde expressieniveau voor afzonderlijke cellen tussen elk paar markeringen om één markering te hebben met een gemiddeld expressieniveau dat is gekoppeld aan elk celtype42.
  5. Pas een Gaussisch mengselmodel (GMM) met twee componenten toe op de expressiegegevens van elke marker in afzonderlijke cellen om cellen in twee sets te scheiden, namelijk het sterk tot expressie brengen van de marker en het laag uitdrukken van de marker. Op deze manier wordt voor elke marker elke afzonderlijke cel toegewezen aan een van de twee componenten42.
  6. Gebruik statistische verrijking voor de set markergenen, een exacte test van Fisher, om aan elk cluster een celtype toe te wijzen. Zo wordt per cluster een set p-waarden verkregen, die elk overeenkomen met een celtype. Het celtype met de laagste p-waarde wordt aan dat cluster toegewezen.
  7. Verwerk de ruimtelijke transcriptomische gegevens met behulp van de Space Ranger-pijplijnen, wat resulteert in ruimtelijke de-barcodering en het genereren van quality control (QC) -statistieken, inclusief totale uitgelijnde reads naar hg38 menselijk transcriptoom, het mediane aantal Unique Molecular Identifier (UMI) of genen per spot35.
    OPMERKING: Het R-pakket Seurat (v3.2.2) wordt gebruikt om de door de Space Ranger verwerkte gegevens te analyseren volgens gepubliceerde richtlijnen40.
  8. Normaliseer gegevens met behulp van "sctransform", een methode waarvan is aangetoond dat deze de stroomafwaartse analyse verbetert in vergelijking met log-normalisatie gezien de heterogeniteit van het weefsel en de zeer hoge variantie in tellingen over de vlekken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De analyse van EC's uit mesenteriale slagader met behulp van een combinatie van mechanische en enzymatische dissociatie of cryopreservatie voor gebruik in verschillende downstream assays is hier afgebeeld (figuur 1). EC's kunnen worden geprofileerd in mesenteriale slagaders met behulp van de volgende stappen: A) mechanische dissociatie van de intima in combinatie met collagenasevertering naar kweekcellen; B) generatie van eencellige suspensie voor scRNA-seq; of C) doorsneden van de slagader ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De gepresenteerde workflow beschrijft een reeks technieken om EC's te profileren vanuit een enkel stuk menselijke slagader met eencellige en ruimtelijke resolutie. Er zijn verschillende kritische stappen en beperkende factoren in het protocol. Een sleutel tot transcriptoomprofilering is de versheid van het weefsel en de integriteit van het RNA. Het is belangrijk om weefsels zoveel mogelijk op ijs te houden voorafgaand aan de verwerking om RNA-degradatie te minimaliseren. Meestal worden de postmortale weefsels verwerkt tu...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.Z. is oprichter en bestuurslid van Genemo, Inc.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies R01HL108735, R01HL145170, R01HL106089 (aan Z.B.C.); DP1DK126138 en DP1HD087990 (naar S.Z.); een Ella Fitzgerald Foundation beurs en een Wanek Family Project (aan Z.B.C.); en een Human Cell Atlas seed network grant (aan Z.B.C. en S.Z.). Onderzoek gerapporteerd in deze publicatie omvatte werk uitgevoerd in de Integrative Genomics Core in City of Hope, ondersteund door het National Cancer Institute van de National Institutes of Health onder toekenningsnummer P30CA033572. De auteurs willen Dr. Ismail Al-Abdullah en Dr. Meirigeng Qi van het eilandjestransplantatieteam van City of Hope bedanken voor de isolatie van menselijke weefsels, Dr. Dongqiang Yuan van City of Hope voor zijn hulp bij scRNA-seq-analyse en Dr. Marc Halushka van de afdeling Cardiovasculaire Pathologie, Johns Hopkins University School of Medicine voor zijn onschatbare inzichten in vasculaire histologie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL micro-centrifuge tubeUSA Scientific1615-5500
10 cm dishGenesee Scientific25-202
23G needlesBD305145
2-methylbutaanThermo FisherAC327270010
40 µm strainerFisher14100150
4200 TapeStation SystemAgilent TechnologiesG2991BA
5 mL tubeThermo Fisher14282300
6-well plateGreiner Bio-One07-000-208
Attachment factorCell Applications123-500Attachment reagent in het protocol
Zwarte wasElke commerciële zwarte was kan worden gebruikt
Bovine serum albumine hitteschok behandeldFisherBP1600-100
CaCl2FisherBP510
CentrifugeEppendorf
ChloroformFisherC607
Collageenase DRoche11088866001
CryostatLeica
Cryostat borstels
D-GlucoseFisherD16-1
Dimethyl sulfoxideFisherMT25950CQC
Dispase IIRoche4942078001Bacteria-derived protease in het protocol
Disposable Safety ScalpelsMyco Instrumentation6008TR-10
D-PBSThermo Fisher14080055
EthanolFisherBP2818-4
Fetaal bovien serumFisher10437028
HemocytometerFisher267110
HEPESSigma AldrichH3375-100g
High sensitivity D1000 sample bufferAgilent Technologies5067-5603
High sensitivity D1000 screen tapeAgilent Technologies5067-5584
IncubatorBlijf op 37 °C 5% CO2
IsopropanolFisherBP26324
KClFisherP217-3
Vloeibare stikstof
Medium 199Sigma AldrichM2520-10X
Metaal canister
MicroscoopLeicaOm celmorfologie te beoordelen
Microvasculair endotheel kweekmediumCell Applications111-500
NaClFisherS271-1
New Brunswick Innova 44/44R Orbital shakerEppendorf
Optimal Cutting Temperature compoundFisher4585
Plastic cryomoldsFisher22363553
RNA screen tapeAgilent Technologies5067-5576
RNA screen Tape sample bufferAgilent Technologies5067-5577
RNase ZAPThermo FisherAM9780
RNase-free waterTakaraRR036BRNase-free water (2) in kit
Steriele 12" lange forcepsF.S.T91100-16
Steriele fijne forcepsF.S.T11050-10
Steriele fijne schaarF.S.T14061-11
Superfrost PLUS Gold SlidesFisher1518848
TRIzol reagentFisher15596018
Trypan BlueCorningMT25900CI
TrypLE Express Enzyme (1X) phenol redThermo Fisher12605010Cell-dissociatie enzym in het protocol
Visium Accessory Kit10X GenomicsPN-1000215
Visium Gateway Package, 2rxns10X GenomicsPN-1000316
Visium Spatial Gene Expression Slide & Reagent Kit, 4 rxns10X GenomicsPN-1000184

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thorin, E., Shreeve, S. M. Heterogeneity of vascular endothelial cells in normal and disease states. Pharmacology & Therapeutics. 78 (3), 155-166 (1998).
  2. Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
  3. Hillen, H. F., Melotte, V., van Beijnum, J. R., Griffioen, A. W. Endothelial cell biology. Angiogenesis Assays: A Critical Appraisal of Current Techniques. , John Wiley & Sons. Chichester, West Sussex, UK. 1-38 (2007).
  4. Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).
  5. Kalucka, J., et al. Single-cell transcriptome atlas of murine endothelial cells. Cell. 180 (4), 764-779 (2020).
  6. Tang, X., et al. Suppression of endothelial AGO1 promotes adipose tissue browning and improves metabolic dysfunction. Circulation. 142 (4), 365-379 (2020).
  7. Ni, C. W., Kumar, S., Ankeny, C. J., Jo, H. Development of immortalized mouse aortic endothelial cell lines. Vascular Cell. 6 (1), 7(2014).
  8. Kalluri, A. S., et al. Single-cell analysis of the normal mouse aorta reveals functionally distinct endothelial cell populations. Circulation. 140 (2), 147-163 (2019).
  9. Wirka, R. C., et al. Atheroprotective roles of smooth muscle cell phenotypic modulation and the TCF21 disease gene as revealed by single-cell analysis. Nature Medicine. 25, 1280-1289 (2019).
  10. Widyantoro, B., et al. Endothelial cell-derived endothelin-1 promotes cardiac fibrosis in diabetic hearts through stimulation of endothelial-to-mesenchymal transition. Circulation. 121 (22), 2407-2418 (2010).
  11. Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
  12. Stuart, T., Satija, R. Integrative single-cell analysis. Nature Reviews Genetics. 20, 257-272 (2019).
  13. Paik, D. T., et al. Single-cell RNA sequencing unveils unique transcriptomic signatures of organ-specific endothelial cells. Circulation. 142 (19), 1848-1862 (2020).
  14. Palikuqi, B., et al. Adaptable haemodynamic endothelial cells for organogenesis and tumorigenesis. Nature. 585 (7825), 426-432 (2020).
  15. The Tabula Muris Consortium. et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
  16. Hezroni, H., et al. Principles of long noncoding RNA evolution derived from direct comparison of transcriptomes in 17 species. Cell Reports. 11 (7), 1110-1122 (2015).
  17. Washietl, S., Kellis, M., Garber, M. Evolutionary dynamics and tissue specificity of human long noncoding RNAs in six mammals. Genome Research. 24 (4), 616-628 (2014).
  18. Chen, J., et al. Evolutionary analysis across mammals reveals distinct classes of long non-coding RNAs. Genome Biology. 17 (19), 19(2016).
  19. Drake, B. L., Loke, Y. W. Isolation of endothelial cells from first trimester decidua using immunomagnetic beads. Human Reproduction. 6, 1156-1159 (1991).
  20. McDouall, R. M., Yacoub, M., Rose, M. L. Isolation, culture and characterization of MHC class II-positive microvascular endothelial cells from the human heart. Microvascular Research. 51, 137-152 (1996).
  21. Sokol, L., et al. Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: small intestine, colon, heart, and liver. STAR Protocols. 2 (2), 100489(2021).
  22. Springhorn, J. P., Madri, J. A., Squinto, S. P. Human capillary endothelial cells from abdominal wall adipose tissue: isolation using an anti-pecam antibody. In Vitro Cellular Developmental Biology Animal. 31 (6), 473-481 (1995).
  23. Hewett, P. W., Murray, J. C. Immunomagnetic purification of human microvessel endothelial cells using Dynabeads coated with monoclonal antibodies to PECAM-1. European Journal of Cell Biology. 62 (2), 451-454 (1993).
  24. Marx, V. Method of the Year: spatially resolved transcriptomics. Nature Methods. 18 (1), 9-14 (2021).
  25. Maynard, K. R., et al. Transcriptome-scale spatial gene expression in the human dorsolateral prefrontal cortex. Nature Neuroscience. 24 (3), 425-436 (2021).
  26. Ji, A. L., et al. Multimodal analysis of composition and spatial architecture in human squamous cell carcinoma. Cell. 182 (2), 497-514 (2020).
  27. Bäckdahl, J., et al. Spatial mapping reveals human adipocyte subpopulations with distinct sensitivities to insulin. Cell Metabolism. 33 (9), 1869-1882 (2021).
  28. Wang, J., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
  29. Codeluppi, S., et al. Spatial organization of the somatosensory cortex revealed by osmFISH. Nature Methods. 15, 932-935 (2018).
  30. Eng, C. H. L., et al. Transcriptome-scale super-resolved imaging in tissues by RNA seqFISH. Nature. 568, 235-239 (2019).
  31. Eng, C. H. L., Shah, S., Thomassie, J., Cai, L. Profiling the transcriptome with RNA SPOTs. Nature Methods. 14, 1153-1155 (2017).
  32. Rodriques, S. G., et al. Slide-seq: a scalable technology for measuring genome-wide expression at high spatial resolution. Science. 363 (6434), 1463-1467 (2019).
  33. Ståhl, P. L., et al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science. 353 (6294), 78-82 (2016).
  34. Rao, A., et al. Exploring tissue architecture using spatial transcriptomics. Nature. 596 (7871), 211-220 (2021).
  35. Sachidanandam, K., et al. Differential effects of diet-induced dyslipidemia and hyperglycemia on mesenteric resistance artery structure and function in type 2 diabetes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 328 (1), 123-130 (2009).
  36. Calandrelli, R., et al. Stress-induced RNA-chromatin interactions promote endothelial dysfunction. Nature Communications. 11 (1), 5211(2020).
  37. Souza-Smith, F. M., et al. Mesenteric resistance arteries in Type 2 diabetic db/db mice undergo outward remodeling. PLoS One. 6 (8), 23337(2011).
  38. Asterholm, I., et al. Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling. Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).
  39. Marin, V., et al. Endothelial cell culture: protocol to obtain and cultivate human umbilical endothelial cells. Journal of Immunological Methods. 254 (1-2), 183-190 (2001).
  40. Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single-cell data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
  41. Hafemeister, C., Satija, R. Normalization and variance stabilization of single-cell RNA-seq data using regularized negative binomial regression. Genome Biology. 20 (1), 296(2019).
  42. Bonnycastle, L. L., et al. Single-cell transcriptomics from human pancreatic islets: sample preparation matters. Biology Methods Protocols. 5 (1), (2020).
  43. Espitia, O., et al. Implication of molecular vascular smooth muscle cell heterogeneity among arterial beds in arterial calcification. PLoS One. 13 (1), 0191976(2018).
  44. Engelbrecht, E., et al. Sphingosine 1-phosphate-regulated transcriptomes in heterogenous arterial and lymphatic endothelium of the aorta. eLife. 9, 52690(2020).
  45. Hu, H., et al. Single-cell transcriptomic atlas of different human cardiac arteries identifies cell types associated with vascular physiology. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (4), 1408-1427 (2021).
  46. van Beijnum, J., et al. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
  47. Jin, S., et al. Inference and analysis of cell-cell communication using CellChat. Nature Communications. 12 (1), 1088(2021).
  48. Efremova, M., Vento-Tormo, M., Teichmann, S. A., Vento-Tormo, R. CellPhoneDB: inferring cell-cell communication from combined expression of multi-subunit ligand-receptor complexes. Nature Protocols. 15 (4), 1484-1506 (2020).
  49. Hu, Y., Peng, T., Gao, L., Tan, K. CytoTalk: de novo construction of signal transduction networks using single-cell RNA-Seq data. Science Advances. 7 (16), (2020).
  50. Sanchez-Ferras, O., et al. A coordinated progression of progenitor cell states initiates urinary tract development. Nature Communications. 12 (1), 2627(2021).
  51. Mantri, M., et al. Spatiotemporal single-cell RNA sequencing of developing chicken hearts identifies interplay between cellular differentiation and morphogenesis. Nature Communications. 12 (1), 1771(2021).
  52. Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
  53. Moffit, J. R., et al. High-throughput MERFISH. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (39), 11046-11051 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Mesenteric ArteryCell IsolationTranscriptome ProfilingSingle Cell RNASpatial TranscriptomicsCell ViabilityImmunofluorescence StainingRNA ExtractionHematoxylin Eosin Staining

Gerelateerde artikelen