Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Robuuste differentiatie van menselijke iPSC's in een zuivere populatie van adipocyten om adipocyten-geassocieerde aandoeningen te bestuderen

4.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63311

⸱

9 februari 2022

 ,  , 
1Diabetes Research Center, Qatar Biomedical Research Institute (QBRI), Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation (QF), 2College of Health and Life Sciences, Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation

In dit artikel

Samenvatting

Het protocol maakt het mogelijk om een zuivere adipocytenpopulatie te genereren uit geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's). Retinoïnezuur wordt gebruikt om iPSC's te differentiëren in mesenchymale stamcellen (MSC's) die worden gebruikt voor de productie van adipocyten. Vervolgens wordt een sorteerbenadering op basis van Nijlrode kleuring gebruikt om zuivere adipocyten te verkrijgen.

Samenvatting

Recente ontwikkelingen in geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) technologie hebben het genereren van verschillende celtypen mogelijk gemaakt, waaronder adipocyten. De huidige differentiatiemethoden hebben echter een lage efficiëntie en produceren geen homogene populatie van adipocyten. Hier omzeilen we dit probleem door een volledig trans-retinoïsche methode te gebruiken om mesenchymale stamcellen (MSC's) met een hoge opbrengst te produceren. Door routes te reguleren die celproliferatie, overleving en adhesie regelen, maakt onze differentiatiestrategie de efficiënte generatie van embryonale lichamen (EB's) mogelijk die differentiëren in een zuivere populatie van multipotente MSC's. Het grote aantal MSC's dat door deze methode wordt gegenereerd, biedt een ideale bron voor het genereren van adipocyten. De heterogeniteit van de steekproef als gevolg van adipocytendifferentiatie blijft echter een uitdaging. Daarom gebruikten we een op Nijlrood gebaseerde methode voor het zuiveren van lipide-dragende volwassen adipocyten met behulp van FACS. Deze sorteerstrategie stelde ons in staat om een betrouwbare manier te vinden om adipocyten-geassocieerde metabole stoornissen te modelleren met behulp van een pool van adipocyten met verminderde heterogeniteit van het monster en verbeterde celfunctionaliteit.

Inleiding

Mesenchymale stamcellen (MSC's) fungeren als een effectieve tijdelijke bron voor het produceren van cellen van mesodermale oorsprong zoals adipocyten, osteocyten en chondrocyten, die verder kunnen worden gebruikt voor het modelleren van hun respectieve genetische aandoeningen. Eerdere benaderingen waren echter gebaseerd op het bereiken van deze MSC's uit volwassen weefsels 1, wat de uitdaging oplegde om ze in grote aantallen van de donoren te verkrijgen, en de beperking om ze functioneel levensvatbaar te houden in suboptimale in vitro kweekomstandigheden 1,2. Deze obstakels hebben geleid tot een grote vraag naar een protocol voor het genereren van MSC's in vitro. Door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) kunnen worden gebruikt als een waardevolle bron van MSC's en vertonen MSC-kenmerken 3,4,5. iPSCS-afgeleide MSC's kunnen worden gebruikt als een therapeutische optie bij verschillende ziekten. Ook het vermogen van van iPSC's afgeleide MSC's om adipocyten te genereren, maakt ze een waardevol in vitro menselijk model om menselijke adipogenese, obesitas en adipocyten-geassocieerde aandoeningen te bestuderen.

De huidige differentiatieprotocollen van adipocyten kunnen in twee groepen worden ingedeeld, waarbij de ene differentiatie van adipocyten met behulp van chemische of op eiwitten gebaseerde cocktails met een resulterende opbrengst van 30% -60% 6,7,8,9 oplevert, terwijl de andere genetische manipulatie omvat voor robuuste inductie van belangrijke transcriptiefactoren die de ontwikkeling van adipocyten regelen om een opbrengst van 80% -90% 10 te geven, 11. Genetische manipulatie vat echter niet het natuurlijke proces van adipocytendifferentiatie samen en maskeert vaak de subtiele paradigma's die tijdens adipogenesis aankomen, waardoor het niet effectief is voor ziektemodelleringsdoeleinden12,13. Daarom presenteren we een manier om chemisch afgeleide volwassen adipocyten te sorteren van onrijpe adipocyten door fluorescerend lipide-dragende adipocyten te labelen met behulp van Nijlrood.

Hier presenteren we een protocol met voorbijgaande incubatie van van iPSC's afgeleide embryoïde lichamen (EB's) met all-trans retinoïnezuur om een groot aantal snel prolifererende MSC's te produceren, die verder kunnen worden gebruikt voor het genereren van adipocyten14. We presenteren ook een manier om chemisch afgeleide rijpe adipocyten uit de heterogene differentiatiepool te sorteren door hun lipidedruppeltjes fluorescerend te labelen met behulp van een lipofiele kleurstof; Nijlrood. Dit zou het mogelijk maken om een zuivere populatie van volwassen adipocyten te genereren met verbeterde functionaliteit om adipocyt-geassocieerde metabole stoornissen nauwkeurig te modelleren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De studie is goedgekeurd door de juiste ethische commissie voor institutioneel onderzoek en uitgevoerd volgens de ethische normen zoals vastgelegd in de Verklaring van Helsinki van 1964 en de latere wijzigingen of vergelijkbare ethische normen. Het protocol is goedgekeurd door de Institutional Review Board (IRB) van HMC (nr. 16260/16) en QBRI (nr. 2016-003). Dit werk is ook geoptimaliseerd voor hESCs zoals H1 en H9. Bloedmonsters werden verkregen van gezonde personen met volledige geïnformeerde toestemming. De iPSC's worden gegenereerd uit perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) van gezonde individuen.

1. Het kweken en onderhouden van iPSC's

  1. Bereid keldermembraanmatrix-gecoate platen voor door de coatingmatrix in knockout-DMEM te reconstitueren in een verhouding van 1:80 en bewaar bij 4 °C.
  2. Bereid iPSC-kweekmedia door 50 ml 10x stamcelsupplementmedia toe te voegen aan 500 ml stamcelbasaal media, samen met 5 ml 100x penicilline-streptomycine (P / S) en bewaar bij 4 ° C voor korte termijn of bij -20 ° C voor langdurig gebruik.
  3. Bekleed de platen met coatingmatrix-1 ml voor een 6-well plaat, 500 μL voor een 12-well plaat, 250 μL voor een 24-well plaat-en incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 1-2 uur.
  4. Verwijder een hoeveelheid iPSC-kweekmedia en verwarm deze voor gebruik op kamertemperatuur.
  5. Ontdooi een injectieflacon met iPSC's (SER's of iPSC's) in een waterbad van 37 °C en breng over in een conische buis van 15 ml met 2-3 ml kweekmedia.
  6. Centrifugeer de buis op 120 x g gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur (RT-23 °C).
  7. Verwijder het supernatant en voeg 2 ml verse kweekmedia toe, aangevuld met 10 μM ROCK-remmer (Y-27632). Plaats de cellen in één put van een matrix-gecoate 6-well plaat en plaats de plaat op 37 °C.
  8. Verwijder na 24 uur de media en vervang deze door nieuwe cultuurmedia.
  9. Verander de media elke dag totdat de cellen 80% -90% confluentie bereiken.
  10. Bij het bereiken van confluentie, passage cellen door het volgen van de onderstaande stappen.
    1. Verwijder de media en was de cellen met Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS).
    2. Voeg iPSC's dissociatiereagens toe (zie materiaaltabel)-500 μl voor een put van een 6-wellenplaat, 250 μl voor een put van een 24-wellenplaat en incubeer gedurende 1 min bij 37 °C.
    3. Verwijder het dissociatiereagens en incubeer de cellen gedurende 1 minuut droog bij 37 °C.
    4. Verzamel de cellen met behulp van kweekmedia - 1 ml voor een put van een 6-putplaat en 250 μl voor een put van een 24-putplaat - in een conische buis van 15 ml en centrifugeer op 120 x g gedurende 4 minuten.
    5. Resuspendeerde cellen in kweekmedia-2 ml voor een put van een 6-well-plaat en 500 μL voor een put van een 24-well plaat-aangevuld met 10 μM ROCK-remmer en plaat ze op verse matrix gecoate platen met 40% confluentie.

2. Differentiatie van iPSC in MSC's

  1. Bereid MSC-differentiatiemedia door 15% foetaal runderserum (FBS) en 1% P / S toe te voegen aan DMEM met lage glucose + pyruvaat en bewaar bij 4 °C.
  2. Gebruik bij het bereiken van 80% confluentie iPSC's voor de vorming van embryoïde lichamen (EB) volgens de onderstaande stappen.
    1. Was de cellen met DPBS en incubeer ze met dissociatiemedium/EDTA-500 μL voor een putje van een 6-well plaat, 250 μL voor een putje van een 24-well plaat.
    2. Incubeer gedurende 1 minuut bij 37 °C, zuig het dissociatiereagens op en houd de cellen nog eens 1 minuut op 37 °C. Om MSC-differentiatie te starten, zijn ~10-12 x 106 cellen vereist.
    3. Verzamel de cellen in een conische buis van 15 ml met behulp van kweekmedia. Zorg ervoor dat je heel voorzichtig bent tijdens het verzamelen om te voorkomen dat cellen single worden en EB-vorming mogelijk maken. Centrifugeer de cellen op 120 x g gedurende 4 min.
    4. Resuspendie van de cellen in 3 ml MSC-differentiatiemedia met 10 μM ROCK-remmer.
    5. Meng en verdeel 0,5 ml/put in een 24-well ultra-low attachment plate.
      OPMERKING: Het gebruik van een ultralage bevestigingsplaat zou celaggregatie in EB's aanmoedigen in plaats van hun bevestiging aan het oppervlak.
    6. Plaats de plaat in de incubator bij 37 °C.
  3. Induceer na 24 uur de bereikte EB's met een behandeling met hoog retinoïnezuur (RA) door de onderstaande stappen te volgen.
    1. Voeg 10 μM RA toe aan 3 ml MSC-differentiatiemedia. Verzamel EB's in een buis van 15 ml en laat ze 15 minuten bezinken.
    2. Verwijder het supernatant uit EB's en voeg MSC-differentiatiemedia toe, aangevuld met 10 μM RA.
    3. Resuspendeer voorzichtig en verdeel 0,5 ml/put in dezelfde 24-well ultra-low bevestigingsplaat.
    4. Plaats de plaat in de incubator bij 37 °C. Stoor de EB's de komende 48 uur niet.
    5. Verzamel na 48 uur EB's in een buis van 15 ml en laat ze 15 minuten bezinken.
    6. Verwijder het supernatant uit EB's en voeg MSC-differentiatiemedia toe, aangevuld met 0,1 μM RA.
    7. Resuspendeer voorzichtig en verdeel 0,5 ml/put in dezelfde 24-well ultra-low bevestigingsplaat.
    8. Plaats de plaat in de incubator bij 37 °C. Stoor de EB's de komende 48 uur niet.
  4. Verwijder de RA die aan de cellen is toegevoegd door de onderstaande stappen te volgen.
    1. Na 48 uur van de laatste RA-behandeling, verzamel de EB's en laat ze 15 minuten bezinken.
    2. Verwijder het supernatant en voeg DMEM-lage glucosemedia toe zonder cytokines.
    3. Resuspendeer voorzichtig en verdeel 0,5 ml/put in een 24-well ultra-low bevestigingsplaat. Plaats de plaat in de incubator bij 37 °C.
  5. Plaats de van iPSC's afgeleide EB's door de onderstaande stappen te volgen.
    1. Na 48 uur na de vorige stap (stap 2.4), verzamelt u de EB's in een buis van 15 ml en laat u ze gedurende 15 minuten bezinken.
    2. Verwijder supernatant en resuspensie in 2 ml verse MSC-differentiatiemedia.
    3. Breng over naar twee putten van een keldermembraan matrix-gecoate 6-well plaat.
    4. Verander de media om de andere dag gedurende nog eens 5 dagen.
    5. Verwijder na 5 dagen de gebruikte media en vervang deze door verse MSC-differentiatiemedia die 2,5 ng / ml basisfibroblastgroeifactor (bFGF) bevatten.
  6. Passeer de vergulde EB's wanneer ze 80% -90% samenvloeiing bereiken, door de onderstaande stappen te volgen.
    1. Was de cellen met DPBS, voeg trypsine-EDTA-500 μL toe voor een putje van een 6-well plaat en incubeer de cellen op 37 °C gedurende 3 min.
    2. Verzamel de cellen met behulp van MSC-differentiatiemedia in een conische buis van 15 ml en draai gedurende 4 minuten op 750 x g .
    3. Resuspendeer in MSC-differentiatiemedia met 2,5 ng/ml bFGF en plaats de cellen op keldermembraanmatrix-gecoate platen in een verhouding van 1:3.
    4. Herhaal de passage wanneer de cellen 70% -80% confluency bereiken. Er wordt verwacht dat het 3-6 miljoen cellen krijgt door 2-3 passages.

3. Flowcytometrie-analyse van van iPSC's afgeleide MSC's

OPMERKING: Na het ondergaan van 2-3 passages moeten de cellen toegankelijk zijn voor de efficiëntie van MSC-differentiatie. Differentiatie zal als succesvol worden beschouwd als de cellen MSC-differentiatiemarkers-CD44, CD73, CD90 en CD105 met een efficiëntie van meer dan 90% tot expressie brengen en geen hoge niveaus van hematopoietische markers-CD14, CD19, CD34 en CD45 tot expressie brengen. De efficiëntie van deze markers kan worden benaderd door de onderstaande stappen te volgen.

  1. Passeer de cellen met behulp van de hierboven beschreven stappen (stap 2.6) en bereik 1 x 105 cellen in één put van een v-bodem 96-putplaat.
  2. Centrifugeer de plaat op 375 x g gedurende 4 minuten bij 4 °C.
  3. Resuspendeer 1 x 105 cellen in 100 μL koude DPBS met 1 μL geconjugeerd antilichaam (Ab) (zie Tabel met materialen) en incubeer bij 4 °C gedurende 30-40 minuten om blootstelling aan licht te voorkomen.
  4. Resuspendeer nog eens 1 x 105 cellen in 100 μL koude DPBS met de respectieve isotypecontrole van het geconjugeerde Ab in een concentratie van 1:100 ) en incubeer bij 4 °C gedurende 30-40 minuten om blootstelling aan licht te voorkomen.
  5. Na incubatie wordt de plaat gedurende 4 minuten bij 4 °C gecentrifugeerd bij 375 x g . Gooi het supernatant weg door de plaat over de gootsteen te schudden.
  6. Resuspendeer de cellen in 100 μL koude DPBS.
  7. Centrifugeer de cellen op 375 x g gedurende 4 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg.
  8. Resuspendeer de cellen in 200 μL koude DPBS en verzamel ze in donkere, koude microcentrifugebuizen van 1,5 ml en houd ze op ijs totdat ze worden geanalyseerd door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS).
  9. Voor FACS-analyse verdeelt u de cellen met behulp van side scattered (SSC-A) versus forward scattered (FSC-A) om het puin uit te sluiten. Verdeel verder de gated cellen met behulp van forward scattered height (FSC-H) versus forward scattered area (FSC-A) om singlets te onderscheiden van doubletten uit de levende celpopulatie.
    OPMERKING: Cellen werden omheind ten opzichte van de verschuiving van isotypecontrole voor elke marker en een minimum van 10.000 gated events van elk gekleurd monster werd gebruikt voor analyse.

4. Differentiatie van MSC's in adipocyten

  1. Bereid adipocytendifferentiatie basale media door 10% knockout serumvervanging (KOSR), 1% Glutamine, 1% P / S, 4,5 ng / μL glucose toe te voegen aan minimaal essentiële media (MEM) -alfa en bewaar bij 4 °C.
  2. Laat MSC's meer dan 90% confluency bereiken. Blijf ze nog 48 uur kweken om ze een periode van groeistilstand te laten ondergaan.
  3. Bereid complete adipocytendifferentiatiemedia door 100 μg / ml 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), 1 μM dexamethason, 0,2 U / ml insuline, 100 μM indomethacine en 10 μM rosiglitazon toe te voegen aan de basale media.
  4. Verwijder MSC-differentiatiemedia en was de cellen met DPBS.
  5. Voeg volledige adipocytendifferentiatiemedia toe - 2 ml voor een put van een 6-putplaat en 1 ml voor een put van een 12-putplaat - en incuber de cellen bij 37 °C. Verander volledige differentiatiemedia om de andere dag gedurende 14 dagen.

5. Evaluatie van de differentiatie-efficiëntie van adipocyten

  1. Controleer op dag 14 van differentiatie de efficiëntie van differentiatie door cellen te kleuren voor adipocytenrijpingsmarkers, FABP4 en adiponectine.
  2. Verwijder de media en was de cellen met DPBS.
  3. Bevestig de cellen met 4% paraformaldehyde (PFA) - 200 μL aan een put van een plaat met 24 putten - en incuber gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Gooi de PFA weg en was met tris-gebufferde zoutoplossing met 0,5% tween (TBST) en plaats deze gedurende 15 minuten op een shaker bij kamertemperatuur. Herhaal het proces twee keer.
  5. Permeabiliseer de vaste cellen met fosfaat-gebufferde zoutoplossing met 0,5% Triton X-100 (PBST) en plaats het op een shaker bij kamertemperatuur gedurende 15-20 minuten.
  6. Gooi de PBST weg en voeg de blokkeringsbuffer (5%-6% runderserumalbumine (BSA) in PBST)-500 μL voor een putje van een 6-wells plaat en 250 μL voor een putje van een 12-well plaat-en incubeer bij kamertemperatuur op de shaker gedurende 40-60 min.
  7. Verdun de primaire antilichamen tegen FABP4, adiponectine in 2%-3% BSA, in een concentratie van 1:500 (zie tabel met materialen). Voeg deze antilichamen alleen bij verschillende dieren aan elkaar toe en plaats de plaat bij 4 °C een nacht op de schudder.
  8. Verwijder de primaire antilichamen en was de cellen drie keer met TBST (elk 15 minuten) en plaats het op een shaker bij kamertemperatuur.
  9. Bereid Alexa Fluor secundaire antilichamen voor in PBST (1:500). Incubeer de cellen in de secundaire antilichaamcombinaties (volgens de soort waarbij het primaire antilichaam wordt verhoogd) gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur en bedek de plaat met aluminiumfolie om deze tegen licht te beschermen.
  10. Gooi de secundaire antilichamen weg, was drie keer met TBST en plaats de plaat op de shaker.
  11. Om de kernen te kleuren, voegt u 1 μg / ml Hoechst 33342-200 μL toe voor een put van een 24-well plaat verdund in PBS en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  12. Gooi de Hoechst-oplossing weg en voeg PBS-500 μL toe voor een put van een 24-putplaat aan de cellen. Houd de platen bedekt tegen licht totdat ze worden gevisualiseerd met behulp van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop.

6. Sorteren van adipocyten met nijlrood

  1. Bereid nijlrode werkoplossing door toevoeging van 1 mg/ml nijlrode stamoplossing in DMSO en bewaar bij -20 °C. Ontdooi vlak voor gebruik de rode nijlvoorraad en reconstitueer in DPBS tot een concentratie van 300 nM werkoplossing.
  2. Gooi op of na dag 14 van adipocytendifferentiatie de media uit de cellen en was met DPBS.
  3. Voeg nijlrode werkoplossing -1 ml toe in een put van een plaat met 6 putten - en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C.
  4. Verwijder de Nile red solution en voeg trypsine-EDTA -500 μL toe in een putje van een 6-well plaat- en incubeer bij 37 °C gedurende 4 min.
  5. Verzamel de cellen met DMEM met 5% FBS in een conische buis van 15 ml. Centrifugeer op 750 x g gedurende 4 min.
  6. Verwijder het supernatant en resuspensie in DPBS-1 ml gedurende 1 x 106 cellen. Centrifugeer op 750 x g gedurende 4 min.
  7. Verwijder het supernatant en resuspensie in DPBS-1 ml gedurende 1 x 106 cellen. Gebruik een FACS-sorteerder om de nijlrood-positieve cellen te isoleren met behulp van het FL1-kanaal.
  8. Herkweek de gesorteerde cellen in adipocytendifferentiatiemedia of verzamel de gesorteerde cellen voor RNA- en eiwitisolatie.
  9. Extraheer RNA uit de gesorteerde cellen en voer een relatieve kwantitatieve analyse uit van adipocytendifferentiatiemarkers, waaronder FABP4, PPARG en C / EBPA. De nijlrood-positieve cellen vertonen een significante upregulatie in de genexpressie van ten minste twee vouwen in vergelijking met niet-gesorteerde cellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Schematische en morfologie van cellen tijdens mesenchymale differentiatie: Differentiatie van iPSC's in MSC's omvat verschillende stadia van ontwikkeling die zich uitstrekken over EB-vorming, MSC-differentiatie en MSC-expansie (figuur 1). Tijdens deze stadia van ontwikkeling verwerven cellen verschillende morfologie als gevolg van de verschillende stimulerende chemicaliën waaraan ze worden blootgesteld. Bij het initiëren van differentiatie worden cellen in suspensie geplaatst en wordt verwac...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol is van het grootste belang vanwege het vermogen om MSC's met een hoge opbrengst en efficiëntie te leveren. Deze massaproductie van MSC's werd mogelijk gemaakt door tijdelijke incubatie van van iPSC's afgeleide EB's met 10 μM RA14,15. Voorbijgaande behandeling met 10 μM RA verhoogde de MSC-opbrengst met 11,2 tot 1542 maal14,15, waarbij dit protocol van toepassing was op zowel iPSC's als hPSC's...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen tegenstrijdige belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van Qatar National Research Fund (QNRF) (Grant No. NPRP10-1221-160041). Maryam Aghadi werd ondersteund door een GSRA-beurs van het Qatar National Research Fund (QNRF).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AdiponectinAbcamab22554Adipocyte maturation marker
anti-CD105BD Pharmingen560839MSC differentiatie marker
anti-CD14BD Pharmingen561712MSC differentiatie marker
anti-CD19BD Pharmingen555415MSC differentiatie marker
anti-CD34BD Pharmingen555824MSC differentiatie marker
anti-CD44abcamab93758MSC differentiatie marker
anti-CD45BD Pharmingen
560975		MSC differentiatie marker
anti-CD73BD Pharmingen550256MSC differentiatie marker
anti-CD90BD Pharmingen555596MSC differentiatie marker
bFGFR&D233-FPMSC cultuurmedia supplement
C/EBPAAbcamab40761Adipocyte maturation marker
DexamethasonTorics1126Adipocyte differentiatie media supplement
FABP4Abcamab93945Adipocyte maturation marker
Fetaal bovien serumThermoFisher10082147MSC cultuurmedia supplement
GlutamaxThermoFisher35050-061MSC cultuurmedia supplement
IBMXSigma AldrichI5879Adipocyte differentiatie media supplement
IndomethacineSigma AldrichI7378Adipocyte differentiatie media supplement
InsulinSigma Aldrich91077CAdipocyte differentiatie media supplement
Knockout DMEMThermoFisher12660012Basal media voor het bereiden van matrigel
Low glucose DMEMThermoFisher11885084MSC cultuur media
MatrigelCorning354230Coating matrix
MEM-alphaThermoFisher12561056Adipocyte differentiatie media
NileredSigma Aldrich19123Sorteringsmarker voor adipocyte
PenicillineThermoFisher15140122MSC/Adipocyte media supplement
Fosfaat gebufferde zoutoplossingThermoFisher14190144Wasbuffer
Pierce™ 20X TBS BufferThermo Fisher28358Wasbuffer
PPARGCell Signaling Technology2443Adipocyte maturation marker
ReLeSRStem Cell Technologies5872Dissociatie reagens
Retinoic acidSigma AldrichR2625MSC differentiatie media supplement
Rock inhibitorTocris1254/10hPSC cultuurmedia supplement
RoziglitazoneSigma AldrichR2408Adipocyte differentiatie media supplement
StemFlexThermoFisherA334901hPSC cultuurmedia
TritonThermo Fisher28314Permebealisatie reagens
TrypsineThermoFisher25200072Dissociatie reagens
Tween 20Sigma AldrichP7942Wasbuffer

Referenties

  1. Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Communication and Signaling: CCS. 9, 12(2011).
  2. Wagner, W., et al. Aging and replicative senescence have related effects on human stem and progenitor cells. PLoS One. 4 (6), 5846(2009).
  3. Brown, P. T., Squire, M. W., Li, W. J. Characterization and evaluation of mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells and bone marrow. Cell and Tissue Research. 358 (1), 149-164 (2014).
  4. Trivedi, P., Hematti, P. Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells. Experimental Hematology. 36 (3), 350-359 (2008).
  5. Barberi, T., Willis, L. M., Socci, N. D., Studer, L. Derivation of multipotent mesenchymal precursors from human embryonic stem cells. PLoS Medicine. 2 (6), 161(2005).
  6. Xiong, C., et al. Derivation of adipocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 14 (6), 671-675 (2005).
  7. Cuaranta-Monroy, I., et al. Highly efficient differentiation of embryonic stem cells into adipocytes by ascorbic acid. Stem Cell Research. 13 (1), 88-97 (2014).
  8. van Harmelen, V., et al. Differential lipolytic regulation in human embryonic stem cell-derived adipocytes. Obesity (Silver Spring). 15 (4), 846-852 (2007).
  9. Noguchi, M., et al. In vitro characterization and engraftment of adipocytes derived from human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 22 (21), 2895-2905 (2013).
  10. Ahfeldt, T., et al. Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes. Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).
  11. Lee, Y. K., Cowan, C. A. Differentiation of white and brown adipocytes from human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 538, 35-47 (2014).
  12. Abdelalim, E. M. Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (6), 2459-2483 (2021).
  13. Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).
  14. Karam, M., Younis, I., Elareer, N. R., Nasser, S., Abdelalim, E. M. Scalable Generation of mesenchymal stem cells and adipocytes from human pluripotent stem cells. Cells. 9 (3), (2020).
  15. Karam, M., Abdelalim, E. M. Robust and highly efficient protocol for differentiation of human pluripotent stem cells into mesenchymal stem cells. Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. (2020).
  16. Li, L., Bennett, S. A., Wang, L. Role of E-cadherin and other cell adhesion molecules in survival and differentiation of human pluripotent stem cells. Cell Adhesion & Migration. 6 (1), 59-70 (2012).
  17. Lai, L., Bohnsack, B. L., Niederreither, K., Hirschi, K. K. Retinoic acid regulates endothelial cell proliferation during vasculogenesis. Development. 130 (26), 6465-6474 (2003).
  18. Chanchevalap, S., Nandan, M. O., Merlin, D., Yang, V. W. All-trans retinoic acid inhibits proliferation of intestinal epithelial cells by inhibiting expression of the gene encoding Kruppel-like factor 5. FEBS Letters. 578 (1-2), 99-105 (2004).
  19. di Masi, A., et al. Retinoic acid receptors: from molecular mechanisms to cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 41, 1(2015).
  20. Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies. FEBS Letters. 584 (14), 3123-3130 (2010).
  21. De Angelis, M. T., Parrotta, E. I., Santamaria, G., Cuda, G. Short-term retinoic acid treatment sustains pluripotency and suppresses differentiation of human induced pluripotent stem cells. Cell Death & Disease. 9 (1), 6(2018).
  22. Li, L., Dong, L., Wang, Y., Zhang, X., Yan, J. Lats1/2-mediated alteration of hippo signaling pathway regulates the fate of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. BioMed Research International. 2018, 4387932(2018).
  23. Moldes, M., et al. Peroxisome-proliferator-activated receptor gamma suppresses Wnt/beta-catenin signalling during adipogenesis. The Biochemical Journal. 376, Pt 3 607-613 (2003).
  24. Ross, S. E., et al. Inhibition of adipogenesis by Wnt signaling. Science. 289 (5481), 950-953 (2000).
  25. Wang, Y. K., Chen, C. S. Cell adhesion and mechanical stimulation in the regulation of mesenchymal stem cell differentiation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 823-832 (2013).
  26. Mohsen-Kanson, T., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells into brown and white adipocytes: role of Pax3. Stem Cells. 32 (6), 1459-1467 (2014).
  27. Billon, N., et al. The generation of adipocytes by the neural crest. Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).
  28. Li, N., Kelsh, R. N., Croucher, P., Roehl, H. H. Regulation of neural crest cell fate by the retinoic acid and Pparg signalling pathways. Development. 137 (3), 389-394 (2010).
  29. Ussar, S., et al. ASC-1, PAT2, and P2RX5 are cell surface markers for white, beige, and brown adipocytes. Science Translational Medicine. 6 (247), (2014).
  30. Festy, F., et al. Surface protein expression between human adipose tissue-derived stromal cells and mature adipocytes. Histochemistry and Cell Biology. 124 (2), 113-121 (2005).
  31. Cai, L., Wang, Z., Ji, A., Meyer, J. M., vander Westhuyzen, D. R. Scavenger receptor CD36 expression contributes to adipose tissue inflammation and cell death in diet-induced obesity. PLoS One. 7 (5), 36785(2012).
  32. Mesuret, G., et al. A neuronal role of the Alanine-Serine-Cysteine-1 transporter (SLC7A10, Asc-1) for glycine inhibitory transmission and respiratory pattern. Scientific Reports. 8 (1), 8536(2018).
  33. Silverstein, R. L., Febbraio, M. CD36, a scavenger receptor involved in immunity, metabolism, angiogenesis, and behavior. Science Signaling. 2 (72), (2009).
  34. Brooimans, R. A., van Wieringen, P. A., van Es, L. A., Daha, M. R. Relative roles of decay-accelerating factor, membrane cofactor protein, and CD59 in the protection of human endothelial cells against complement-mediated lysis. European Journal of Immunology. 22 (12), 3135-3140 (1992).
  35. Davies, A., et al. CD59, an LY-6-like protein expressed in human lymphoid cells, regulates the action of the complement membrane attack complex on homologous cells. The Journal of Experimental Medicine. 170 (3), 637-654 (1989).
  36. Lapid, K., Graff, J. M. Form(ul)ation of adipocytes by lipids. Adipocyte. 6 (3), 176-186 (2017).
  37. Aldridge, A., et al. Assay validation for the assessment of adipogenesis of multipotential stromal cells--a direct comparison of four different methods. Cytotherapy. 15 (1), 89-101 (2013).
  38. Schaedlich, K., Knelangen, J. M., Navarrete Santos, A., Fischer, B., Navarrete Santos, A. A simple method to sort ESC-derived adipocytes. Cytometry A. 77 (10), 990-995 (2010).
  39. Costa, L. A., et al. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (2), 447-467 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Differentiatie van humane iPSC smesenchymale stamcellenadipocytdifferentiatieNile Red sorteringzuivere adipocytenpopulatieembryonale lichaampjesFACS sorteringmarker voor adipocytmaturatielipidbevattende adipocyten
Robuuste differentiatie van menselijke iPSC's in een zuivere populatie van adipocyten om adipocyten-geassocieerde aandoeningen te bestuderen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.