Methodenartikel

Residu-specifieke uitwisseling van Proline door Proline-analogen in fluorescerende eiwitten: hoe "moleculaire chirurgie" van de ruggengraat de vouwing en stabiliteit beïnvloedt

DOI:

10.3791/63320

⸱

3 februari 2022

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Chemistry, Technische Universität Berlin, 2Department of Chemistry, University of Manitoba, 3Institute of Physics, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de beperkingen van klassieke site-directed mutagenese te overwinnen, werden proline analogen met specifieke modificaties opgenomen in verschillende fluorescerende eiwitten. We laten zien hoe de vervanging van waterstof door fluor of van de enkele door dubbele bindingen in prolineresiduen ("moleculaire chirurgie") fundamentele eiwiteigenschappen beïnvloedt, inclusief hun vouwing en interactie met licht.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vervanging van proline (Pro) residuen in eiwitten door de traditionele plaatsgerichte mutagenese door een van de resterende 19 canonieke aminozuren is vaak schadelijk voor eiwitvouwing en, in het bijzonder, chromofoorrijping in groene fluorescerende eiwitten en aanverwante varianten. Een redelijk alternatief is om de translatie van het eiwit zo te manipuleren dat alle Pro-residuen residu-specifiek worden vervangen door analogen, een methode die bekend staat als selectieve drukincorporatie (SPI). De ingebouwde chemische modificaties kunnen worden gebruikt als een soort "moleculaire chirurgie" om meetbare veranderingen fijn te ontleden of zelfs rationeel verschillende eiwiteigenschappen te manipuleren. Hier toont de studie het nut aan van de SPI-methode om de rol van prolines te bestuderen in de organisatie van de typische β-barrel structuur van spectrale varianten van het groene fluorescerende eiwit (GFP) met 10-15 prolines in hun sequentie: verbeterd groen fluorescerend eiwit (EGFP), NowGFP en KillerOrange. Pro-residuen zijn aanwezig in verbindingssecties tussen individuele β-strengen en vormen de sluitdeksels van de vatsteiger, waardoor ze verantwoordelijk zijn voor de isolatie van de chromofoor uit water, d.w.z. fluorescentie-eigenschappen. Selectieve drukincorporatie-experimenten met (4R)-fluoroproline (R-Flp), (4S)-fluoroproline (S-Flp), 4,4-difluoroproline (Dfp) en 3,4-dehydroproline (Dhp) werden uitgevoerd met behulp van een proline-auxotrofe E. coli-stam als expressiegastheer. We ontdekten dat fluorescerende eiwitten met S-Flp en Dhp actief zijn (d.w.z. fluorescerend), terwijl de andere twee analogen (Dfp en R-Flp) disfunctionele, verkeerd gevouwen eiwitten produceerden. Inspectie van UV-Vis absorptie- en fluorescentie-emissieprofielen toonde weinig karakteristieke veranderingen in de eiwitten die Pro-analogen bevatten. Onderzoek van de vouwkinetische profielen in EGFP-varianten toonde een versneld hervouwproces in aanwezigheid van S-Flp, terwijl het proces vergelijkbaar was met wild-type in het eiwit dat Dhp bevat. Deze studie toont het vermogen van de SPI-methode om subtiele modificaties van eiwitresiduen op atomair niveau ("moleculaire chirurgie") te produceren, die kunnen worden gebruikt voor de studie van andere eiwitten van belang. Het illustreert de resultaten van proline-vervangingen met nauwe chemische analogen op de vouwende en spectroscopische eigenschappen in de klasse van β-vat fluorescerende eiwitten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klassieke site-directed mutagenese maakt permutatie van elke bestaande gen-gecodeerde eiwitsequentie mogelijk door codonmanipulatie op DNA-niveau. Om eiwitvouwing en stabiliteit te bestuderen, is het vaak wenselijk om vergelijkbare aminozuren te vervangen door vergelijkbare tegenhangers. Traditionele eiwitmutagenese is echter zeker beperkt tot structureel vergelijkbare vervangingen onder canonieke aminozuren zoals Ser / Ala / Cys, Thr / Val, Glu / Gln, Asp / Asn, Tyr / Phe, die aanwezig zijn in het standaard genetische coderepertoire. Aan de andere kant zijn er geen dergelijke mogelijkheden voor andere canonieke aminozuren zoals Trp, Met, His of Pro, die vaak essentiële structurele en functionele rollen spelen in eiwitten1. Een ideale benadering om deze interacties te bestuderen in de context van de zeer specifieke interne architectuur van eiwitten en hun vouwproces is het genereren van niet-verstorende isosterische modificaties. Inderdaad, wanneer isosterische aminozuuranalogen van deze canonieke aminozuren, ook bekend als niet-canonieke aminozuren (NCA's), in eiwitten worden ingebracht, zorgen ze voor subtiele veranderingen, zelfs op het niveau van enkele atomen of atoomgroepen zoals H / F, CH2 / S / Se / Te bekend als "atomaire mutaties"2. Een dergelijke "moleculaire chirurgie" produceert veranderde eiwitten waarvan de eigenschappen uitsluitend het gevolg zijn van de uitwisseling van enkele atomen of groepen atomen, die in gunstige gevallen kunnen worden geanalyseerd en de gedetecteerde veranderingen kunnen worden gerationaliseerd. Op deze manier wordt de reikwijdte van eiwitsynthese om eiwitvouwing en -structuur te bestuderen veel verder uitgebreid dan klassieke DNA-mutagenese. Merk op dat eiwitten die worden gegenereerd door plaatsgerichte mutagenese meestal worden aangeduid als "mutanten", terwijl eiwitten met gesubstitueerde canonieke aminozuren worden aangeduid als "varianten" 3, "alloproteïnen"4 of "eiwitcongeneren"5.

Het groene fluorescerende eiwit (GFP), voor het eerst geïdentificeerd in het mariene organisme Aequorea victoria, vertoont felgroene fluorescentie bij blootstelling aan ultraviolet tot blauw licht 6,7. Tegenwoordig wordt GFP vaak gebruikt als een zeer gevoelig etiketteringsinstrument voor routinematige visualisatie van genexpressie en eiwitlokalisatie in cellen via fluorescerende microscopie. GFP is ook nuttig gebleken in verschillende biofysische 8,9,10 en biomedische 11,12 studies, evenals in eiwittechnologie 13,14,15. Een grondige analyse van de GFP-structuur maakte het mogelijk om talrijke varianten te creëren die worden gekenmerkt door gevarieerde stabiliteits- en fluorescentiemaxima16,17. De meeste GFP-varianten die in de cel- en moleculaire biologie worden gebruikt, zijn monomere eiwitten, zowel in oplossing als in het kristal18. Hun belangrijkste structurele organisatie is typerend voor alle leden van de GFP-familie, onafhankelijk van hun fylogenetische oorsprong, en bestaat uit 11 β-strengen die een zogenaamde β-barrel vormen, terwijl een geknikte α-helix door het midden van de loop loopt en de chromofoor draagt (figuur 1A). De autokatalytische rijping van de chromofoor (figuur 1B) vereist de precieze positionering van de zijketens eromheen op de centrale plaats van het eiwit; veel van deze zijkettingen zijn sterk geconserveerd in andere GFP-varianten19. In de meeste fluorescerende eiwitten van kwallen zoals Aequorea victoria bestaat de groenuitstotende chromofoor uit twee aromatische ringen, waaronder een fenolring van Tyr66 en de vijfkoppige heterocyclische structuur van imidazolinon (figuur 1B). De chromofoor is, wanneer goed ingebed in de eiwitmatrix, verantwoordelijk voor de karakteristieke fluorescentie van het hele eiwit. Het bevindt zich in het midden van de structuur, terwijl de vatstructuur het isoleert van het waterige medium20. Blootstelling van de chromofoor aan het bulkwater zou resulteren in fluorescentie-doven, d.w.z. verlies van fluorescentie21.

Het goed vouwen van de vatachtige structuur is essentieel voor het beschermen van de chromofoor tegen fluorescentie doven22. Proline (Pro) residuen spelen een bijzondere rol in de structurele organisatie van GFP23. Omdat ze niet in staat zijn om een β-streng te ondersteunen, vormen ze verbindingslussen die verantwoordelijk zijn voor het behoud van de eiwitstructuur als geheel. Het is niet verrassend dat 10-15 prolineresiduen worden aangetroffen in zowel Aequorea- als Anthoathecata-afgeleide GFP's; sommigen van hen zijn zeer geconserveerd in andere soorten fluorescerende β-barrel eiwitten. Van prolines wordt verwacht dat ze de vouweigenschappen kritisch beïnvloeden vanwege hun eigenaardige geometrische kenmerken. Bijvoorbeeld, in Aequorea-afgeleide GFP's, van de tien proline residuen (Figuur 2A), vormen negen trans- en slechts één vormt een cis-peptide binding (Pro89). Pro58 is essentieel, d.w.z. niet uitwisselbaar met de rest van de 19 canonieke aminozuren. Dit residu kan verantwoordelijk zijn voor de juiste positionering van het Trp57-residu, waarvan is gemeld dat het cruciaal is voor de rijping van chromofoor en de algeheleGFP-vouwing 24. Het fragment PVPWP met drie proline residuen (Pro54, Pro56, Pro58) en Trp57 is het essentiële onderdeel van het "onderste deksel" in de GFP-structuur uit figuur 1A. Het PVPWP structurele motief wordt gevonden in verschillende eiwitten zoals cytochromen en eukaryote spanningsgeactiveerde kaliumkanalen25. Proline-naar-alanine substituties op posities 75 en 89 zijn ook schadelijk voor eiwitexpressie en vouwing en chromofoorrijping elimineren. Pro75 en Pro89 maken deel uit van het "bovenste deksel" dat de chromofoor begraaft (figuur 1A) en worden bewaard over 11-gestrande β-vat fluorescerende eiwitten23. Deze twee "deksels" houden de chromofoor uitgesloten van het waterige oplosmiddel, zelfs wanneer de stabiele tertiaire structuur gedeeltelijk is gebroken26. Zo'n specifieke moleculaire architectuur beschermt de fluorofoor tegen botsingen (dynamische) fluorescentie-uitschakeling, bijvoorbeeld door water, zuurstof of andere diffuusibele liganden.

Om moleculaire engineering van de GFP-structuur uit te voeren, moet men aminozuursubstituties introduceren in de primaire structuur van het eiwit. Er zijn talrijke mutaties uitgevoerd op GFP, die varianten bieden met verhoogde stabiliteit, snelle en betrouwbare vouwing en variabele fluorescentie-eigenschappen17. Niettemin wordt in de meeste gevallen mutatie van prolineresiduen als een riskante aanpak beschouwd vanwege het feit dat geen van de resterende 19 canonieke aminozuren het conformatieprofiel van het prolineresidu27 goed kan herstellen. Daarom is een alternatieve benadering ontwikkeld, waarbij prolineresiduen worden vervangen door andere proline-gebaseerde structuren, genaamd proline-analogen28. Vanwege zijn unieke cyclische chemische structuur vertoont proline twee karakteristieke conformatieovergangen (figuur 1C): 1) de proline ring puckering, een snel proces dat de organisatie van de ruggengraat met zich meebrengt, wat voornamelijk de φ torsiehoek beïnvloedt, en 2) de peptidebinding cis / trans isomerisatie, een langzaam proces dat de ruggengraat vouwt via de ω torsiehoeken. Vanwege zijn langzame aard is de laatste overgang algemeen verantwoordelijk voor de snelheidsbeperkende stappen in het vouwproces van het hele eiwit. Het is eerder aangetoond dat peptidebinding cis / trans isomerisatie rond sommige proline residuen langzame stappen heeft in het vouwen van GFP-varianten. De vorming van de cis-peptidebinding bij Pro89 heeft bijvoorbeeld de langzame stap in het vouwproces omdat het afhankelijk is van de bindingsovergang van trans naar cis29. Een snellere hervouwing kan worden bereikt na het vervangen van Pro89 door een all-trans peptidelus, d.w.z. door een cis-naar-trans isomerisatiegebeurtenis30 af te schaffen. Naast de cis/trans isomerisatie kunnen de pucker-overgangen ook diepgaande veranderingen in eiwitvouwing veroorzaken als gevolg van de ruggengraatorganisatie en verpakking in het eiwitinterieur27,31.

Chemische modificaties resulteren in verandering van de intrinsieke conformatieovergangen van de prolineresiduen, waardoor het vermogen van het eiwit om te vouwen wordt beïnvloed. Bepaalde proline-analogen zijn bijzonder aantrekkelijke kandidaten voor proline-substitutie in eiwitten omdat ze de manipulatie en studie van de vouweigenschappen mogelijk maken. Bijvoorbeeld, (4R)-fluoroproline (R-Flp), (4S)-fluoroproline (S-Flp), 4,4-difluoroproline (Dfp) en 3,4-dehydroproline (Dhp) zijn vier analogen (Figuur 1D) die minimaal verschillen van proline in termen van zowel moleculair volume als polariteit32. Tegelijkertijd vertoont elk analoog een duidelijke ringpuckering: S-Flp stabiliseert de C 4-endo pucker, R-Flp stabiliseert de C 4-exo pucker, Dfp vertoont geen duidelijke puckervoorkeur, terwijl Dhp het puckering afschaft (figuur 1D)33. Door deze analogen in de eiwitstructuur te gebruiken, kan men manipuleren met de conformatieovergang van de prolineresiduen en daarmee de eigenschappen van de resulterende GFP-varianten beïnvloeden.

In dit werk hebben we geprobeerd de aangewezen set proline-analogen (figuur 1D) op te nemen in de structuur van GFP-varianten met behulp van de selectieve drukincorporatiemethode (SPI, figuur 3)34. Vervanging van aminozuurresiduen door hun dichtstbijzijnde isostructurele analogen is een toegepast biotechnologisch concept in eiwitontwerp35,36. De effecten van proline-analogen in een modeleiwit illustreren dus hun potentieel om te dienen als hulpmiddelen in eiwittechnologie37. De productie van eiwitten die gewenste analogen bevatten, werd uitgevoerd in gemodificeerde E. coli-stammen die niet in staat zijn om proline (proline-auxotrofie) te produceren. Zo zouden ze gedwongen kunnen worden om vervanging van substraten te accepteren in het proces van eiwitbiosynthese38. Deze globale substitutie van proline wordt mogelijk gemaakt door de natuurlijke substraatflexibiliteit van endogene aminoacyl-tRNA-synthetasen39, de belangrijkste enzymen die de verestering van tRNA's katalyseren met geschikte aminozuren40. In het algemeen, zoals beschreven in figuur 3, wordt cellulaire groei uitgevoerd in een gedefinieerd medium totdat de mid-logaritmische groeifase is bereikt. In de volgende stap wordt het te vervangen aminozuur tijdens de fermentatie intracellulair uit het expressiesysteem afgevoerd en vervolgens uitgewisseld door het gewenste analoge of ncAA. Doeleiwitexpressie wordt vervolgens geïnduceerd voor residu-specifieke niet-canonieke aminozuurabsorptie. De substitutie van het verwante aminozuur door zijn analoog vindt plaats op een proteoombrede manier. Hoewel deze bijwerking een negatieve invloed kan hebben op de groei van de gastheerstam, wordt de kwaliteit van de productie van doeleiwitten meestal niet beïnvloed, omdat bij recombinante expressie de cellulaire bronnen voornamelijk gericht zijn op de productie van het doeleiwit41,42. Daarom zijn een strak gereguleerd, induceerbaar expressiesysteem en sterke promotors cruciaal voor een hoge integratie-efficiëntie43. Onze aanpak is gebaseerd op meerdere residu-specifieke integratie van NCA's in reactie op sense codons (sense codon reassignment), waarbij binnen het doelgen het aantal posities voor Pro analoge insertie kan worden gemanipuleerd via site-directed mutagenese44. Een vergelijkbare benadering werd toegepast in ons vorige rapport over de bereiding van recombinante peptiden met antimicrobiële eigenschappen45. In dit werk hebben we de SPI-methode toegepast, waarmee alle prolineresiduen kunnen worden vervangen door verwante analogen, om eiwitten te genereren waarvan wordt verwacht dat ze verschillende fysisch-chemische eigenschappen bezitten die niet aanwezig zijn in eiwitten die zijn gesynthetiseerd met het canonieke aminozuurrepertoire. Door het vouw- en fluorescentieprofiel van de resulterende varianten te karakteriseren, willen we de effecten van atomaire substituties in varianten van GFP laten zien.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Introductie van expressieplasmiden in competente pro-auxotrofe E. coli-cellen

  1. Meng 1 ng van elk monsterplasmide, pQE-80L H6-EGFP, pQE-80L H6-NowGFP en pQE-80L H6-KillerOrange, met 50 μL chemisch competente of elektrocompetente cellen van de pro-auxotrofe E. coli K12-afgeleide stam JM83 (Addgene #50348, of ATCC #35607) voor transformatie door de hitteschokmethode of elektroporatie volgens de beschikbare protocollen46, 47.
    OPMERKING: De expressievector pQE-80L EGFP-H6 codeert voor een C-terminaal 6xHis-tagged enhanced green fluorescent protein (EGFP), de expressievectoren pQE-80L H 6-NowGFP en pQE-80L H6-KillerOrange coderen respectievelijk een N-terminally 6xHis-tagged NowGFP48 of een N-terminally 6xHis-tagged KillerOrange49, elk in een pQE-80L plasmide backbone. Alle doelgenen staan onder controle van een bacteriële T5-promotor die wordt gereguleerd door de lac-operator. Ampicillineresistentie werd gebruikt als selectiemarker en colE1 als oorsprong van replicatie. Zie de tabel met materialen voor meer informatie over het pQE-80L plasmide. Alternatieve Pro-auxotrofe E. coli afkomstig van stammen K-12 en B kan ook worden gebruikt voor expressie en zou vergelijkbare resultaten moeten opleveren. De berekende molecuulmassa van de H 6-gelabelde afzonderlijk geprotoneerde ([M+H]+) wild-type eiwitten (na chromofoorrijping) zijn 27.745,33 Da (EGFP- H6), 27.931,50 Da (H6-NowGFP) en 27.606,09 Da (H6-KillerOrange). De primaire structuren van de doeleiwitten zijn weergegeven in tabel 1 (His-tag onderstreept). De glutamine (Q) binnen de His-tag-sequentie van NowGFP werd geïdentificeerd door DNA-sequencing na subcloning van de NowGFP cDNA ontvangen van Pletnev et al.51 in het pQE-80L plasmide. Het belemmert de eiwitzuivering of de eigenschappen van het fluorescerende eiwit niet.
  2. Herstel de cellen in 950 μL SOC-medium bij 37 °C gedurende 1 uur.
  3. Verspreid 50 μL van de teruggewonnen cellen op Luria Agar (LA) mediumplaten (zie Aanvullend Materiaal) die glucose (10 g/L) en ampicilline (100 μg/ml) bevatten.
  4. Incubeer de LA medium platen bij 37 °C 's nachts of 30 °C gedurende 24 uur.

2. Productie van recombinante wild-type fluorescerende eiwitten (met canonieke proline) en procedure voor selectieve drukincorporatie (SPI) om fluorescerende eiwitten te produceren met proline-analogen (S-Flp, R-Flp, Dfp, Dhp)

  1. Nachtkweek van Pro-auxotrofische E. coli K12-afgeleide stam JM83 met pQE-80L EGFP- H6, pQE-80L H 6-NowGFP en pQE-80L H6-KillerOrange
    1. Gebruik een steriele pipetpunt of inentingslus om een enkele kolonie uit een LA-mediumplaat te selecteren en resuspend de cellen in 5 ml Lysogeny Broth (LB) medium (zie Aanvullend materiaal; met 10 g / L glucose, 100 μg / ml ampicilline) in een steriele 14 ml polystyreen kweekbuis.
      OPMERKING: Vers getransformeerde kolonies worden aanbevolen voor inenting. Cellen op LA-mediumplaten (vanaf stap 2.2.) die bij 4 °C zijn opgeslagen, moeten binnen enkele dagen worden gebruikt.
    2. Kweek de celcultuur 's nachts bij 37 °C in een orbitale shaker bij 200-250 rpm.
  2. Productie van recombinant EGFP-H6, H6-NowGFP en H6-KillerOrange met native proline en de bijbehorende eiwitvarianten met proline analogen
    1. Ent 200 ml vers NMM-medium (7,5 mM (NH4)2SO4, 50 mM K2HPO4 en 22 mM KH2PO4, 8,5 mM NaCl, 1 mM MgSO4, 20 mM D-glucose, 1 μg/ml FeCl2, 1 μg/ml CaCl2, 10 μg/ml thiamine, 10 μg/ml biotine, 0,01 μg/ml sporenelementen (CuSO4, ZnCl2, MnCl2, (NH4)2MoO4), pH ~7,2) met alle canonieke l-aminozuren (50 mg/L); zie Aanvullend materiaal) aangevuld met 100 μg/ml ampicilline met 2 ml van de nachtkweek in een erlenmeyer van 2 L.
      OPMERKING: Afhankelijk van het type eiwit kunnen alternatieve teeltmedia zoals MOPS-medium52, glucose-minerale zouten medium53, Davis minimal medium54, M9 minimal medium55 of GMML56 worden getest om de eiwitopbrengst te optimaliseren.
    2. Incubeer de cellen bij 37 °C in een orbitale shaker bij 220 rpm gedurende ~ 3 h 30 min.
    3. Meet elke 30 minuten de optische dichtheid bij600 nm (OD 600) in een spectrofotometer totdat een OD600-waarde van ~ 0,7 is bereikt.
      OPMERKING: Voor od600-bepaling in een spectrofotometer moet de cuvette een padlengte van 1 cm hebben. Het bijbehorende teeltmedium wordt gebruikt voor de referentie ("nul") meting. De incubatietijd totdat een OD600-waarde van ~ 0,7 is bereikt, kan afhankelijk zijn van het kweekvolume. 3 h 30 min is een geschatte waarde. In een variant van de protocol-substappen 2.2.1-2.2.3., de cultuur uit substep 2.1.2. wordt gebruikt om vers NMMΔPro-medium (zie aanvullend materiaal) te enten, aangevuld met een beperkte concentratie proline (bijv. 5 mg/l in plaats van 50 mg/l), en de cellen worden 's nachts gekweekt bij 37 °C in een orbitale shaker bij 220 tpm. De volgende dag wordt elke30 minuten de OD 600-bepaling uitgevoerd totdat de verschillen tussen de metingen kleiner zijn dan 0,05. De maximale OD600-waarde moet ongeveer 1 (± 0,3) zijn. De initiële, beperkte prolineconcentratie kan worden aangepast afhankelijk van de expressiestam en het kweekmedium (zie Discussie).
    4. Draai de celsuspensie gedurende 10 minuten bij 3.000 x g en 4 °C.
    5. Decanteer het bovennatuurlijk voorzichtig in afval.
    6. Wasstap: Resuspend de cellen in 50 ml ijskoud NMMΔAA (zonder aminozuur, zie Aanvullend materiaal) of NMMΔPro (zonder proline, zie Aanvullend materiaal) medium door zorgvuldig pipetteren.
      OPMERKING: Voor deze wasstap kan een van de twee vermelde buffers worden gebruikt, omdat het alleen belangrijk is om resterende proline in het incubatiemedium te verwijderen.
    7. Scheid de cellen van het medium door sedimentatie bij 4 °C in een centrifuge bij 3.000 x g gedurende 10 minuten.
    8. Decanteer het bovennatuurlijk voorzichtig in afval.
    9. Pipetteer voorzichtig op en neer om de celkorrel in 200 ml NMMΔPro-medium aangevuld met 100 μg/ml ampicilline in een erlenmeyer van 2 l te resuspenderen.
      OPMERKING: De resulterende celsuspensie kan worden gescheiden in verschillende monsters van gelijk volume om identieke startculturen te verkrijgen voor het vergelijken van eiwitexpressie in aanwezigheid van Pro- of proline-analogen (bijv. scheiding in 4 x 50 ml in Erlenmeyers van 100 ml).
    10. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C in een orbitale shaker bij 220 tpm voor de volledige uitputting van Pro.
      OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang om Pro volledig uit cellen te halen.
    11. Voeg een geschikt volume L-proline of R-Flp, S-Flp, Dfp en Dhp toe uit een 50 mM stockoplossing om de eindconcentratie van 1 mM in de celsuspensie aan te passen.
      OPMERKING: Als algemene regel geldt dat verse 50 mM-voorraadoplossingen van Pro- of proline-derivaten altijd vóór gebruik moeten worden bereid. Alleen als hydrolyse van het specifieke canonieke of niet-canonieke aminozuur in een waterige oplossing geen probleem is, mogen ook bevroren voorraden worden gebruikt.
    12. Voeg 0,5 mM IPTG toe uit een 1 M stockoplossing om doeleiwitexpressie te induceren.
    13. Druk het doeleiwit 's nachts (12 uur) bij 37 °C uit in een orbitale shaker bij 220 tpm.
    14. Maatregel OD600 op de volgende dag.
      OPMERKING: OD600-bepaling wordt gedaan om de hoeveelheid cellen na eiwitexpressie te kwantificeren. Een lagere OD600-waarde in vergelijking met de waarde gemeten vóór de wasstap 2.2.3 duidt op cytotoxiciteit van het geleverde aminozuur. In dit geval moet de procedure worden herhaald met de concentratie van het geleverde aminozuur geminimaliseerd (tot 0,1 mM).
    15. Centrifugeer en verzamel de bacteriële cellen bij 5.000 x g en 4 °C gedurende 10 minuten en decanteer het supernatant tot afval.
    16. Wasstap: Resuspend de cellen door zorgvuldig te pipetteren in 50 ml bindingsbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM DTT) met 10% glycerol en breng de celsuspensie over in een conische polystyreenbuis van 50 ml.
    17. Centrifugeer en verzamel de bacteriële cellen bij 5.000 x g en 4 °C gedurende 10 minuten en decanteer het supernatant tot afval.
    18. Bewaar de celkorrel in een conische polystyreenbuis van 50 ml bij -20 °C of -80 °C tot verder gebruik (eiwitzuivering, zie hieronder).

3. Zuiveringsprocedure van eiwitmonsters door geïmmobiliseerde metaalionaffiniteitschromatografie (IMAC)

  1. Bacteriële cellyse
    OPMERKING: Voer alle stappen van cellysis uit op ijs of bij 4 °C om afbraak van het doeleiwit te voorkomen.
    1. Ontdooi de bacteriële celkorrel op ijs of bij 4 °C in een conische polystyreenbuis van 50 ml gedurende 10-20 minuten.
    2. Voeg 10 ml ijskoude bindingsbuffer toe (zie Aanvullend materiaal) en pipetteer voorzichtig op en neer om de celkorrel opnieuw te schorsen.
    3. Voeg 100 μL 50 mg/ml lysozym, 100 μL 1 mg/ml DNase I, 100 μL 1 mg/ml RNase A, 30 μL 1 M MgCl2 toe. Keer de celsuspensie vijf keer voorzichtig om en houd de gesloten buis gedurende 60 minuten op ijs of op 4 °C.
      OPMERKING: Lysozyme induceert chemische cellysis door de bacteriële celwand te verstoren.
    4. Soniceer het monster voor celverstoring met behulp van een ultrasone homogenisator (bijv. 3 keer gedurende 3 minuten in een polystyreenbuis van 50 ml op een ijs-watermengsel, puls 2 s / pauze 4 s, 45% amplitude).
      OPMERKING: Als alternatief kunnen andere celverstoringsmethoden worden gebruikt, bijvoorbeeld hogedrukhomogenisatie in 20 cycli bij 14.000 psi. Verdun indien nodig met behulp van een bindingsbuffer (zie Aanvullend materiaal) om het minimale instrumentvolume te bereiken. Bovendien kunnen eiwitextractiereagentia worden gebruikt voor celverstoring. Zie de tabel met materialen voor voorbeelden.
    5. Centrifugeer gedurende 60 minuten bij 18.000 x g, 4 °C.
    6. Noteer het vloeistofvolume voor substap 3.1.9. en giet het supernatant in een verse polystyreenbuis van 50 ml.
    7. Verwijder het supernatant met behulp van een membraanfilter met een poriediameter van 0,45 μm.
    8. Neem een voorbeeld van "lysaat" voor SDS-PAGE (zie rubriek 4. hieronder); dit komt overeen met "oplosbare eiwitfractie", het supernatant uit substap 3.1.6.
    9. Voeg een gelijk volume ddH2O toe, zoals bepaald in substap 3.1.6. om het celafval opnieuw op te suspenderen om dezelfde verdunning van de monsters te behouden voor latere SDS-PAGE-analyse.
    10. Neem een monster van "pellet" voor SDS-PAGE (zie rubriek 4. hieronder); dit komt overeen met "onoplosbare eiwitfractie", de celresuspensie van substap 3.1.9.
  2. Zuivering van geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie (IMAC)
    OPMERKING: Zuivering van het doelfluorescentie-eiwit kan worden uitgevoerd bij 4 °C of bij kamertemperatuur (RT). Voor de laatste optie wacht u tot het lysaat, de kolom en alle buffers bij RT in evenwicht zijn om luchtbelvorming te voorkomen als gevolg van verdamping van lucht die vastzit in koude oplossing bij plaatsing in een warme kolom.
    1. Zuiver het monster met behulp van een voorverpakte of zelfverpakte IMAC FPLC-kolom (fast protein [or performance] liquid chromatography) van 1 ml volgens de instructies van de fabrikant; stel de maximale kolomdruk in op 0,3 MPa en het debiet op 1 ml / min; gebruik bindingsbuffer (zie Aanvullend materiaal) voor kolomevenwicht, wasbuffer (zie Aanvullend materiaal) voor de wasstap en elutiebuffer (zie Aanvullend materiaal) voor doeleiwitelutie.
      OPMERKING: Als alternatief kan een geautomatiseerd FPLC-systeem worden toegepast om het doeleiwit te elueren met elutiebuffer die een lineaire imidazolconcentratiegradiënt (20-200 mM) uitvoert.
    2. Verzamel en pool de eluaatfracties met fluorescerende eiwitten (kies op zichtbare groene of oranje kleur).
    3. Breng de gepoolde fracties over in een dialysemembraan (moleculaire gewichtsafsnijding (MWCO) van 5.000-10.000) volgens de instructies van de fabrikant en dialyseer ten minste drie keer tegen dialysebuffer of MS-buffer (zie Aanvullend materiaal). Voer bijvoorbeeld drie keer dialyse uit van een monster van 1 ml tegen 100 ml buffer gedurende ten minste 2 uur per ronde. Voor een gedetailleerd protocol, refereer je naar Budisa et al.34.
    4. Bereid een 1:100-voudige verdunning van de gedialyseerde elutiedractie in PBS-buffer (zie Aanvullend materiaal).
    5. Registreer het absorptiespectrum van de verdunde monsters in een UV-Vis-spectrofotometer.
    6. Bereken de eiwitconcentratie op basis van de wet van Lambert-Beer als volgt, met behulp van literatuurwaarden van de molaire extinctiecoëfficiënten ε bij specifieke golflengte (voor EGFP bij 488 nm ε488 = 55.000 cm-1· M-1, NowGFP bij 493 nm ε493 = 53.600 cm-1· M-1, KillerOrange bij 514 nm ε514 = 22.600 cm-1· M-1):
      figure-protocol-1 (Wet Lambert-Beer)
      ceiwit = eiwitconcentratie [mg/ml]
      A = absorptie bij specifieke golflengte
      ε = molaire extinctiecoëfficiënt bij specifieke golflengte [M-1·cm-1]
      d = cuvette pad lengte, hier 1 cm
      MW = molecuulgewicht van eiwit [g/mol]
      Gebruik dialysebuffer (zie Aanvullend materiaal) voor de referentiemeting ("nul").
    7. Neem een monster van "eluate" voor SDS-PAGE (zie rubriek 4 hieronder), laad 1-10 μg eiwit (berekend volgens de vorige stap) per monster goed voor Coomassie Brilliant Blue-stained gels.
      OPMERKING: Pas sds-monsterhoeveelheden aan afhankelijk van de toegepaste kleuringsmethode en gevoeligheid van de kleurstof als verbindingen die verschillen van Coomassie Brilliant Blue worden gebruikt voor eiwitbandkleuring.
    8. Vries het eiwitmonster in en bewaar het in dialysebuffer (zie Aanvullend Materiaal) bij -80 °C.
      OPMERKING: Onder deze bewaarconditie moeten eiwitmonsters ten minste 6 maanden stabiel zijn. Alternatieve laboratorium UV-Vis en fluorescentiespectrofotometers kunnen worden gebruikt voor de registratie van absorptie- en fluorescentie-emissiespectra van doeleiwitten. De volgende excitatiegolflengten kunnen worden toegepast voor fluorescentie-emissiemetingen: 488 nm (EGFP), 493 nm (NowGFP) en 510 nm (KillerOrange).

4. SDS-PAGE monstervoorbereiding

  1. Bepaal de absorptie A bij 280 nm (A280 nm) voor monsters "eluate", "lysate" en "pellet" uit sectie 3. Pas het sondevolume aan om A280nm = 2 te bereiken door een geschikte hoeveelheid elutiebuffer toe te voegen (het uiteindelijke sondevolume moet ten minste 80 μL zijn).
  2. Meng het monster in een verhouding van 4:1 (v/v) met 5x SDS-laadkleurstofbuffer (zie Aanvullend materiaal) door bijvoorbeeld 80 μL van het monster te pipetteren met 20 μL 5x SDS-laadbuffer.
  3. Kook de SDS-monsters gedurende 5 minuten bij 95 °C in een waterbad of warmteblok om de eiwitten te denatureren.
  4. Laat de monsters afkoelen tot RT en draai de sondes gedurende 1 minuut op 13.000 x g in een microcentrifuge voordat ze op de gel worden geladen.
  5. Gebruik 5-10 μL voor Coomassie Brilliant Blue-stained SDS-PAGE. Voor meer informatie over de SDS-PAGE-procedure, zie57.
    OPMERKING: Pas de SDS-monsterhoeveelheden aan, afhankelijk van de toegepaste kleuringsmethode en de gevoeligheid van de kleurstof. Het resultaat van de SDS-PAGE moet zorgvuldig worden gecontroleerd om ervoor te zorgen dat de monsters meer dan 95% van het totale eiwit bevatten in een band die overeenkomt met het verwachte molecuulgewicht van het gewenste eiwit. Maak hiervoor een foto van de Coomassie-gekleurde gel en vergelijk de intensiteit van de eiwitband met het gewenste molecuulgewicht met de intensiteit van alle andere banden in de baan (indien aanwezig) door densitometrie. Voor densitometrische evaluatie van bandintensiteiten kan de software ImageJ worden gebruikt58. Om experimenteel de integratie van de gewenste NCA's in het eiwit van belang te bewijzen, moet intacte eiwitmassaanalyse door middel van high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) gekoppeld aan elektrospray ionisatie time-of-flight massaspectrometrie (LC-ESI-TOF-MS) worden uitgevoerd zoals beschreven59 (zie protocolsectie 5 en materiaaltabel daarin voor voorbeeldige apparatuur).

5. Fluorescentie-emissie van eiwitvarianten

  1. Controleer voorafgaand aan de procedure het resultaat van het SDS-PAGE-experiment om er zeker van te zijn dat de zuiverheid van het monster >95% is (zie de OPMERKING na stap 4.5.)
  2. Pas de monsters van elke gezuiverde eiwitvariant aan tot een concentratie van 0,3 μM, waarbij de berekende absorptiewaarde op de juiste golflengte als referentie wordt genomen (substap 3.2.5.). Zorg ervoor dat het uiteindelijke monstervolume bij benadering 200 μL is.
  3. Laat de verdunde monsters gedurende 1 uur in evenwicht brengen bij RT.
  4. Breng de monsters over in een kwartscuvet van 1 cm en meet een fluorescentie-emissiespectrum van de monsters met behulp van een fluorescentiespectrometer (zie Materiaaltabel) die de volgende excitatiegolflengten toepast: 488 nm (voor EGFP), 493 nm (voor NowGFP), 510 nm (voor KillerOrange).

6. Denaturatie en hervouwen van EGFP-varianten

  1. Controleer voorafgaand aan de procedure het resultaat van het SDS-PAGE-experiment om er zeker van te zijn dat de zuiverheid van het monster >95% is (zie de OPMERKING na stap 4.5.)
  2. Bereid voor elke gezuiverde eiwitvariant twee monsters van 2 μL eindvolume in een concentratie van 300 μM (zie eiwitconcentratiebepaling in substappen 3.2.4-3.2.6).
  3. Voeg 18 μL van 1,11x PBS-buffer (zie Aanvullend Materiaal) met 8,89 M ureum en 5,56 mM DTT toe aan 2 μL van elke gezuiverde eiwitvariant (om 1x PBS met 8 M ureum en 5 mM DTT te verkrijgen) om denaturatie te induceren.
    OPMERKING: Voor stap 6.4-6.6 moet u elk monster afzonderlijk verwerken.
  4. Incubeer de monsters gedurende 5 minuten bij 95 °C.
  5. Verdun de monsters van 20 μL 100-voudig door toevoeging van 1980 μL 1x PBS (zie aanvullend materiaal) met 5 mM DTT om renaturatie te induceren, wat een eindeiwitconcentratie van 0,3 μM oplevert, en breng onmiddellijk 200 μL van de monsters over in een kwartscuvet van 1 cm.
    OPMERKING: Het is erg belangrijk om hier snel te werken, omdat de renaturatie onmiddellijk begint.
  6. Plaats het kwartscuvet in een geschikte fluorescentiespectrometer (zie materiaaltabel) en controleer het opnieuw vouwen van eiwitten in de monsters door elke 3 s gedurende 30 minuten een fluorescentiespectrum te verkrijgen. Gebruik voor elke eiwitvariant 295 nm fluorescentie-excitatie voor het eerste monster en 488 nm fluorescentie-excitatie voor het tweede.
  7. Breng de hervouwbare monsters over in microcentrifugebuizen van 1,5 ml, sluit het deksel en bewaar de monsters bij RT gedurende 24 uur in het donker om het volledig opnieuw vouwen van EGFP-varianten mogelijk te maken.
  8. Meet de fluorescentie-emissie van opnieuw gevouwen eiwitmonsters volgens stap 6.6 met dezelfde excitatiegolflengte als voorheen om het temporele eindpunt van fluorescentieherstel vast te leggen.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aan het begin van de studie selecteerden we drie verschillende fluorescerende eiwitvarianten die de ouder-GFP-architectuur delen. Het eerste geselecteerde eiwit was EGFP, een gemanipuleerde variant afgeleid van de oorspronkelijke GFP van de kwal Aequorea victoria met Phe64Leu / Ser65Thr-mutaties. Het tweede geselecteerde eiwit was NowGFP 51,60. Het is ook een variant van A. victoria GFP afgeleid door mutagenese in verschillende stappen via voorafgaande fluorescerende eiwitten. NowGFP bevat 18 mutaties in vergelijking met zijn directe voorganger fluorescerend eiwit "Cerulean"61. Op zijn beurt is het "Cerulean" -eiwit een derivaat van het verbeterde cyaan fluorescerende eiwit (ECFP)62,63, een eiwit dat eerder werd geselecteerd door gerichte laboratoriumevolutie en dat een op tryptofaan gebaseerde chromofoor bevat. Zowel EGFP als NowGFP worden veel gebruikt in celbiologie en biofysische studies, en ze bevatten tien geconserveerde prolineresiduen in hun structuren. Daarnaast heeft NowGFP een elfde proline residu op positie 230, dat verscheen als gevolg van de uitgebreide mutatiegeschiedenis van deze eiwitvariant. Het derde geselecteerde eiwit was het KillerOrange fluorescerende eiwit64,65. Het is een afgeleide van het chromoproteïne anm2CP uit het hydrozoïsche geslacht Anthoathecata. De eiwitsequentie bevat 15 prolineresiduen en de chromofoor is gebaseerd op een tryptofaan in plaats van een tyrosineresidu. Voor alle drie de geselecteerde eiwitten zijn röntgenstructuren met hoge resolutie gemeld (figuur 2)51,65,66.

In de eerste stap werden proline-analogen (figuur 1D) opgenomen in alle prolineposities van drie modeleiwitten (EGFP, NowGFP en KillerOrange) door selectieve drukincorporatie (SPI, een schema van de procedure wordt gegeven in figuur 3). Instrumenteel werd de proline-auxotrofe E. coli K12-stam JM8367 gebruikt voor expressie van de eiwitten in aanwezigheid van proline en analogen (figuur 1D), wat respectievelijk wild-type en gemodificeerde eiwitten opleverde. Pellets van cellen die het inheemse eiwit tot expressie brachten en varianten met S-Flp en Dhp hadden de typische heldere kleur vanwege de intacte chromofoor, terwijl varianten met R-Flp en Dfp kleurloos bleven, wat wijst op verkeerd vouwen en afzetting van ongevouwen eiwit in inclusielichamen (figuur 4A). SDS-PAGE-analyse van de tot expressie gebrachte monsters verifieerde de aanwezigheid van onoplosbare R-Flp-bevattende eiwitten (figuur 4B-D), waardoor verder onderzoek onmogelijk was. Hoewel dit buiten het bestek van deze studie valt, moet worden opgemerkt dat problemen met de oplosbaarheid van eiwitten en verkeerd vouwen tot op zekere hoogte kunnen worden verlicht door in vitro hervouwprocedures68. Daarentegen werden zowel inheemse eiwitten als S-Flp- en Dhp-dragende varianten voornamelijk aangetroffen in de oplosbare fracties (figuur 4B-D). Het wildtype, evenals S-Flp- en Dhp-bevattende varianten, kunnen verder worden geïsoleerd en gekarakteriseerd in fluorescentiestudies. Oplosbare eiwitten werden gezuiverd door geïmmobiliseerde metaalionaffiniteitschromatografie (IMAC), wat 20-30 mg / L kweekvolume opleverde voor EGFP, 60-80 mg voor NowGFP en KillerOrange, waarvan de opbrengsten voor wild-type en gemodificeerde eiwitten zeer vergelijkbaar waren. Vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS)-gekoppelde analyse bevestigde de verwachte identiteit en zuiverheid van de isolaten die op deze manier werden verkregen (figuur 5). In de massaspectra produceerde elke proline-vervanging met S-Flp een +18 Da-verschuiving per elk proline-residu in de sequentie, terwijl voor de proline-naar-Dhp-vervanging de verschuiving −2 Da per residu was.

In de volgende stap werden lichtabsorptie- en emissiespectra geregistreerd om de potentiële effecten van niet-canonieke proline-analogenintegratie op de spectroscopische eigenschappen van de moederfluorerende eiwitten te analyseren (figuur 6). UV-Vis absorptiespectra vertoonden een typische band rond 280 nm karakteristiek voor aromatische residuen, tyrosine en tryptofaan, terwijl de chromofoorabsorptie werd gevonden bij 488 nm voor EGFP en 493 nm voor NowGFP (Figuur 6A,B). In KillerOrange bestond het absorptiegebied van de chromofoor uit twee banden (figuur 6C), die overeenkomen met twee mogelijke configuratie- en ladingstoestanden van de complexe chromofoor. De band rond 510 nm staat bekend als de toestand waaruit fluorescentie optreedt met een hoge kwantumopbrengst 49,65. In de proline-vervangingsvarianten werd het volgende waargenomen: integratie van Dhp veranderde de absorptiespectra van EGFP en NowGFP niet, terwijl S-Flp een verbeterde UV-absorptie produceerde. Dit laatste kan worden verklaard door geïnduceerde verschillen in de micro-omgeving van tryptofaanresiduen, met name Trp57 ingeklemd tussen drie S-Flp in het PVPWP-motief (figuur 6A, B) 69. Een meer triviale verklaring voor een hogere UV-absorptie kan echter voortkomen uit een verhoogde fractie onjuist gevouwen eiwit. Aangezien de concentratie van het eiwit werd beoordeeld door kwantificering van absorptiekenmerken, kan de aanwezigheid van een eiwit met een onjuist volwassen chromofoor de absorptie verhogen, terwijl deze fractie niet wordt meegeteld in de totale concentratie (figuur 6A,B). Ter ondersteuning van deze hypothese zagen we dat de S-Flp-bevattende EGFP een duidelijk verminderde verhouding van chromofoor versus gecombineerde tryptofaan- en tyrosineabsorptie (ε (CRO) / ε (Tyr + Trp) = 0,96) vertoonde in vergelijking met een hogere waarde (1,57) in het moedereiwit (tabel 2) 70. De aanwezigheid van een niet-fluorescerende fractie in de S-Flp-bevattende EGFP zal een belangrijke factor zijn in de verdere analyse van de eiwiteigenschappen. In de KillerOrange-variant met S-Flp werd een verbeterde absorptie waargenomen naast een roodverschuiving in de chromofoorband. Dit feit gaf aan dat de chromofoorformatie de voorkeur gaf aan een configuratie met een grote fluorescentie-kwantumopbrengst (figuur 6C).

Vervolgens analyseerden we de fluorescentiespectra van de eiwitten die werden geregistreerd bij excitatie op de overeenkomstige maximale absorptiegolflengten. De resultaten tonen aan dat de spectra in wezen identiek bleven voor de onderzochte fluorescerende eiwitvarianten met proline en vervangingen, S-Flp en Dhp. Deze uitkomst impliceert dat de analogen de chemische omgeving van de chromofoor in geen geval hebben veranderd (figuur 6G-I). Ondanks dit feit werden duidelijke verschillen gezien in de fluorescentiespectra van KillerOrange, geregistreerd bij excitatie bij 295 nm, dus bij tryptofaan-excitatie. Dit experiment volgt fluorescentieresonantie-energieoverdracht (FRET) of directe excitonische koppeling die optreedt tussen de tryptofaanzijketens en de volwassen chromofoor, omdat beide zich op een korte afstand van niet meer dan 25 Å bevinden. Voor EGFP- en NowGFP-varianten werd, wanneer de emissiespectra werden gemeten met behulp van 295 nm excitatie, een sterke chromofooremissie waargenomen naast nauwelijks tryptofaanemissie (figuur 6D,E). De varianten met S-Flp vertoonden echter een iets grotere tryptofaan-specifieke emissie. Deze waarneming kan worden gekoppeld aan een ontelbare bijdrage van het ongevouwen apoproteïne dat tryptofaan bevat, maar niet de volwassen chromofoor. Aanzienlijk verhoogde tryptofaan-specifieke emissie werd gezien in KillerOrange, wat wijst op een gebrek aan fluorescentie-doven via het verwachte mechanisme van excitatie-energieoverdracht of excitonische koppeling. De eiwitvarianten die proline en S-Flp bevatten, vertoonden vergelijkbare tryptofaanemissie naast het favoriete rood-verschoven fluorescentiekenmerk van een hoge kwantumopbrengst. De variant die Dhp bevatte, vertoonde daarentegen een drastische afname van de chromofoorfluorescentie-intensiteit, vermoedelijk als gevolg van kleine structurele effecten (figuur 6F).

Vervolgens vergeleken we de vouweigenschappen van de eiwitten door een ontvouwend / renaturatie-experiment uit te voeren. Fluorescentie-emissiespectra werden geregistreerd in de gevouwen toestand (protocolsectie 5), na chemische denaturatie en vervolgens in het proces van hervouwen bewaakt gedurende een periode van 24 uur (protocolsectie 6). De spectra werden geregistreerd bij excitatie op beide relevante golflengten, 295 nm, en op de maxima van de absorptiespectra van de chromoforen, terwijl de resulterende fluorescentie wordt gepresenteerd als genormaliseerd tot de maximale waarde voor elk eiwit (figuur 7). Aan het einde van het protocol zagen we dat EGFP-varianten opnieuw konden vouwen, terwijl de NowGFP- en KillerOrange-varianten - eenmaal gedenatureerd - uitgevouwen bleven (gegevens niet getoond). De hervouwcapaciteiten van de oorspronkelijke fluorescentie-eiwitten varieerden dus aanzienlijk. Van belang is dat KillerOrange is ontwikkeld als een fotosensitizer vanaf de hydrozoïsche chromoproteïnevariant KillerRed65,71, en de hervouwing blijft meestal achter ondanks de robuuste β-barrel structuur. In onze experimenten ontdekten we dat de wild-type EGFP-chromofoorfluorescentie slechts gedeeltelijk herstelde, hoewel de tryptofaanspecifieke fluorescentie groter was na renaturatie (figuur 7A, D). In wezen werd vergelijkbaar gedrag waargenomen in de variant die Dhp bevatte (figuur 7C,F). Bij S-Flp-bevattende EGFP werd een vergelijkbaar resultaat waargenomen wanneer de excitatie werd uitgevoerd op de tryptofaan-specifieke golflengte van 295 nm (figuur 7B). Opvallend is dat de fluorescentie zich in een veel hogere mate herstelde toen de chromofoor werd opgewonden bij 488 nm (figuur 7E). Het lijkt erop dat S-Flp een veel betere opbrengst van refolding induceert in vergelijking met de andere twee varianten. Dit gunstige effect werd echter niet gezien bij het gebruik van 295 nm excitatie als gevolg van onbekende moleculaire interacties.

Vervolgens werd de hervouwsnelheid gecontroleerd door fluorescentie van zowel tryptofaan als de chromofoor afzonderlijk te registreren, terwijl het eindpunt van het proces werd bepaald op 24 uur na het begin van de renaturatie. Alleen EGFP-varianten vertoonden een relatief snelle hervouwkinetiek die betrouwbaar kon worden geëvalueerd, terwijl geen van de gedenatureerde NowGFP- en KillerOrange-varianten kon herstellen tot een waarde die verdere kwantitatieve metingen mogelijk maakte. In EGFP was het herstel van tryptofaanemissie twee keer zo snel (voltooid in 750 s) in vergelijking met het herstel van chromofooremissie (voltooid in 1.500 s), wat de complexiteit van de onderliggende processen aangeeft (figuur 8). Bij beide excitatiegolflengten werd de hervouwingssnelheid verhoogd door de aanwezigheid van S-Flp, in overeenstemming met literatuurgegevens25. Tegelijkertijd vertoonde de Dhp-bevattende variant een hervouwprofiel dat vergelijkbaar is met wild-type.

figure-results-1
Figuur 1: Groene fluorescerende eiwit (GFP) structurele steiger, chromofoorbouw, proline conformatieovergangen en synthetische analogen die in deze studie worden gebruikt. (A) De structuur van GFP bestaat uit de β-strengen die een bijna perfecte loop vormen (d.w.z. een "blik" met afmetingen 4,2 nm x 2,4 nm) die aan beide uiteinden wordt afgedekt door α-spiraalvormige deksels. Het 27 kDa GFP-eiwit vertoont een tertiaire structuur bestaande uit elf β strengen, twee korte α-helices en de chromofoor in het midden. De conformatietoestanden van aangrenzende prolines zijn gekoppeld aan chromofoorvorming. (B) Autokatalytische rijping (condensatie) van de chromofoor treedt op bij residuen Ser65, Tyr66 en Gly67 en verloopt in verschillende stappen: Ten eerste, torsieaanpassingen in de polypeptide-ruggengraat om de carboxylkoolstof van Thr65 in de buurt te brengen van de amidestikstof van Gly67. Vervolgens vindt de vorming van een heterocyclisch imidazoline-5-one ringsysteem plaats bij nucleofiele aanval op dit koolstofatoom door de amidestikstof van glycine en daaropvolgende uitdroging. Ten slotte krijgt het systeem zichtbare fluorescentie wanneer oxidatie van de tyrosine alfa-bèta koolstofbinding door moleculaire zuurstof leidt tot de uitbreiding van het geconjugeerde systeem van het imidazolineringsysteem, aan het einde inclusief de tyrosinefenylring en zijn para-zuurstofsubstituent. Het resulterende para-hydroxybenzylideen imidazolinonchromofoor in het midden van de β vat is volledig gescheiden van het bulkoplosmiddel. (C) De skeletstructuurformules en geometrieën van 1) de prolinering (puckers) en 2) de voorgaande amidebinding vertegenwoordigen de belangrijkste conformatieovergangen van het prolineresidu. (D) De proline analogen die in dit werk worden gebruikt met de aangewezen proline ring puckers. De figuur werd gegenereerd met behulp van ChemDraw en Discovery Studio Visualizer. De GFP-structuur is afkomstig van PDB-structuurvermelding 2Q6P. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Fluorescerende eiwitten die in deze studie worden gebruikt. De panelen tonen de lintweergave van de typische β-barrel structuren van drie verschillende varianten van fluorescerende eiwitten: EGFP, NowGFP en KillerOrange, waarbij lintkleur de kleur van fluorescentie-emissie van elke variant vertegenwoordigt. Proline-residuen (eenletterige code) worden gemarkeerd als stokjes en de juiste posities worden geannoteerd. Chromoforen worden weergegeven met de initiële aminozuursamenstelling vetgedrukt. Alle structuurrepresentaties werden geproduceerd met PyMol op basis van de volgende PDB-structuurvermeldingen: 2Q6P voor EGFP, 4RYS voor NowGFP, 4ZFS voor KillerOrange. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Stroomdiagrampresentatie van de SPI-methode voor residuspecifieke integratie van niet-canonieke proline-analogen. Een proline-auxotrofe Escherichia coli (E. coli) gastheerstam die het gen van belang draagt op een expressieplasmide wordt gekweekt in een gedefinieerd minimaal medium met alle 20 canonieke aminozuren totdat een OD600 van ~ 0,7 wordt bereikt waarbij de celcultuur zich in de mid-logaritmische groeifase bevindt. Cellen worden geoogst en overgebracht naar vers minimaal medium met 19 canonieke aminozuren en een proline analoog. Na de toevoeging van een inductor wordt eiwitexpressie 's nachts uitgevoerd. Ten slotte wordt het doeleiwit geïsoleerd door cellysis en gezuiverd voorafgaand aan verdere analyse. In een variatie op het protocol worden de cellen gekweekt in een gedefinieerd minimaal medium met 19 canonieke aminozuren en wordt proline in een beperkte hoeveelheid toegevoegd (bijvoorbeeld een vijfde van de concentratie van de andere aminozuren). Door deze maat putten de cellen proline uit in het medium voordat ze de logaritmische groeifase kunnen verlaten, en vervolgens wordt het analoge toegevoegd en wordt de productie van het eiwit van belang geïnduceerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Expressieanalyse van EGFP-, NowGFP- en KillerOrange-varianten. (A) Celkorrels van 1 ml expressiecultuur, genormaliseerd tot OD600 = 2. SDS-PAGE analyse van (B) EGFP, (C) NowGFP en (D) KillerOrange varianten. Oplosbare (S) en onoplosbare fracties (I) van elk fluorescerend eiwit derivaten werden geladen op 15% acrylamidegel, evenals geëlueerde fracties (E) van IMAC van oplosbare eiwitten. PageRuler Unstained Protein Ladder werd gebruikt als markering (M) in de rijstroken aangeduid met (M). De verwachte regio's van het specifieke eiwit worden omlijst. Opgenomen aminozuren op proline posities zijn Pro, R-Flp, S-Flp en Dhp (in (A) cel pellets van fluorescerende eiwitvarianten met Dfp in plaats van Dhp worden getoond). Gels werden gekleurd door 1% (w/ v) Coomassie Brillant Blue. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Massaspectrometrische analyse van fluorescerende eiwitvarianten. (A) Representatieve gedeconvolueerde ESI-MS-spectra van H 6-gelabelde EGFP (zwart), S-Flp-EGFP (oranje) en Dhp-EGFP (cyaan) met de locatie van de belangrijkste massapieken als getallen (in Da). De berekende molecuulmassa's [M+H]+ van de H 6-gelabelde eiwitten zijn: Voor EGFP 27.745,33 Da (waargenomen 27.746,15 Da); voor S-Flp-EGFP 27.925,33 Da (waargenomen 27.925,73 Da); voor Dhp-EGFP 27.725,33 Da (waargenomen 27.726,01 Da). (B) Representatieve gedeconvolueerde ESI-MS-spectra van H 6-gelabelde NowGFP (zwart), S-Flp-NowGFP (oranje) en Dhp-NowGFP (cyaan) met de locatie van de belangrijkste massapieken als getallen (in Da). De berekende massa's van de H 6-gelabelde eiwitten zijn: Voor NowGFP 27.931,50 Da (waargenomen 27.946,46 Da; het verschil van ~16 Da is waarschijnlijk te wijten aan oxidatie van een methionine in het eiwit); voor S-Flp-NowGFP 28.129,50 Da (waargenomen 28.130,08 Da); voor Dhp-NowGFP 27.909,50 Da (waargenomen 27.910,22 Da). (C) Representatieve gedeconvolueerde ESI-MS-spectra van H6-tagged KillerOrange (zwart), S-Flp-KillerOrange (oranje) en Dhp-KillerOrange (cyaan) met de locatie van de belangrijkste massapieken als getallen (in Da). De berekende massa's van de H 6-gelabelde eiwitten zijn: Voor KillerOrange 27.606,09 Da (waargenomen 27.605,91 Da); voor S-Flp-KillerOrange 27.876,09 Da (waargenomen 27.876,08 Da); voor Dhp-KillerOrange 27.576,09 Da (waargenomen 27.575,93 Da). Afwijkingen tussen de waargenomen en berekende molecuulmassa's van ongeveer 1 Da liggen binnen het foutenbereik van de ESI-MS-apparatuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Lichtabsorptie- en fluorescentie-emissiespectra van fluorescerende eiwitvarianten. Genormaliseerde UV-Vis absorptiespectra worden getoond voor de varianten (A) van EGFP, (B) van NowGFP en (C) van KillerOrange. Spectra werden genormaliseerd tot het maximum van chromofoorabsorptie (ongeveer 500 nm). Genormaliseerde fluorescentie-emissiespectra worden getoond van de varianten (D,G) van EGFP, (E,H) van NowGFP en (F,I) van KillerOrange. Spectra in (D,E,F) werden gemeten bij excitatie met ultraviolet licht (295 nm), voor de spectra in (G,H,I) werden respectievelijk 488 nm, 493 nm en 510 nm licht gebruikt voor excitatie en werden de spectra genormaliseerd tot de respectievelijke maxima van chromofooremissie (ongeveer 500 nm). In elk paneel komen zwarte curven overeen met de spectra van de fluorescerende eiwitvariant met native proline, oranje curven geven de spectra van S-Flp-gesubstitueerde eiwitten aan en blauwe curven komen overeen met Dhp-gesubstitueerde eiwitten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7: Fluorescentie-emissiespectra van EGFP-varianten in hervouwexperimenten. Genormaliseerde fluorescentie-emissiespectra van 0,3 μM-oplossingen van fluorescerende eiwitvarianten in de oorspronkelijke toestand en na denaturatie en hervouwen: Spectra in (A, B, C) werden gemeten bij excitatie met ultraviolet licht (295 nm ) (A) voor EGFP, (B) voor S-Flp-EGFP en (C) voor Dhp-EGFP. Spectra in (D,E,F) werden gemeten bij excitatie met groen licht (488 nm) (D) voor EFGP, (E) voor S-Flp-EGFP en (F) voor Dhp-EGFP. De emissiespectra van de inheemse (zwarte curven) en opnieuw gevouwen monsters (groen komt overeen met EGFP, oranje naar S-Flp-EGFP en blauw naar Dhp-EGFP, respectievelijk) van elke eiwitvariant worden genormaliseerd tot de maximale fluorescentie van de juiste inheemse toestand. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-8
Figuur 8: Monitoring eiwitvouwing en chromofoorrijping van EGFP-varianten met fluorescentie. (A) Fluorescentie-emissie in het gebied van Trp-fluorescentie (emissie was ingesteld op 330 nm) geregistreerd bij excitatie met ultraviolet licht (295 nm). (B) Ontwikkeling van de fluorescentieamplitude in het gebied van chromofooremissie bij excitatie met groen licht (488 nm). De tijdsafhankelijke fluorescentiesporen werden genormaliseerd tot eenheid (100%) volgens de fluorescentieamplitude die aan het einde van het bewakingsinterval werd bereikt. In elk paneel komen zwarte curven overeen met de spectra van de fluorescerende eiwitvariant met native proline, oranje curven geven de spectra van S-Flp-gesubstitueerde eiwitten aan en blauwe curven komen overeen met Dhp-gesubstitueerde eiwitten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

BouwenAminozuursequenties (6xHis tag onderstreept):
EGFP-H6MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVP
WPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTR
AEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNSHNVYIMADKQKNGIKVN
FKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDH
MVLLEFVTAAGITLGMDELYKHHHHHH
H6-NowGFPMRGSHHQHHHGSVSKGEKLFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGK
MSLKFICTTGKLPVPWPTLKTTLTWGMQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGY
VQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGVDFKEDGNILGHKLEYN
AISGNANITADKQKNGIKAYFTIRHDVEDGSVLLADHYQQNTPIGDGPVLLPD
NHYLSTQSKQSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGIPLGADELYK
H6-KillerorangeMRGSHHHHHHGSECGPALFQSDMTFKIFIDGEVNGQKFTIVADGSSKFPH
GDFNVHAVCETGKLPMSWKPICHLIQWGEPFFARYPDGISHFAQECFPEG
LSIDRTVRFENDGTMTSHHTYELSDTCVVSRITVNCDGFQPDGPIMRDQ
LVDILPSETHMFPHGPNAVRQLAFIGFTTADGGLMMGHLDSKMTFNGSR
AIEIPGPHFVTIITKQMRDTSDKRDHVCQREVAHAHSVPRITSAIGSDQDQD

Tabel 1: Primaire structuren van de doeleiwitten. His-tags worden in elke reeks onderstreept.

λ [nm]ε [M-1·cm-1] (EGFP)ε [M-1·cm-1] (S-Flp-EGFP)ε [M-1·cm-1] (Dhp-EGFP)
488 (≡ CRO)31.657 (± 1.341)22.950 (± 290)27.800 (± 542)
280 (≡ Tyr+Trp)20.116 (± 172)23.800 (± 715)17.300 (± 554)
Waarden voor extinctiecoëfficiënt ε (in M-1·cm-1) worden berekend op basis van geregistreerde UV-Vis absorptiespectra van geschikte EGFP-varianten met behulp van bekende eiwitconcentraties. De geselecteerde golflengte bij 280 nm komt overeen met de maximale absorptie van aromatische residuen, tyrosine en tryptofaan, en 488 nm vertegenwoordigt de chromofoorabsorptiegolflengte.

Tabel 2: Extinctiecoëfficiënten (ε) van EGFP-varianten op geselecteerde golflengten. Waarden voor de extinctiecoëfficiënt ε (in M-1·cm-1) worden berekend op basis van geregistreerde UV-Vis-absorptiespectra van geschikte EGFP-varianten met behulp van bekende eiwitconcentraties. De geselecteerde golflengte van 280 nm komt overeen met de maximale absorptie van aromatische residuen, tyrosine en tryptofaan, terwijl 488 nm de maximale chromofoorabsorptiegolflengte vertegenwoordigt.

Aanvullend materiaal: Voorbereiding van voorraadoplossingen en buffers Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de natuur treden manipulaties met eiwitstructuren en -functies meestal op als gevolg van mutaties, het fenomeen dat leidt tot een uitwisseling van een aminozuuridentiteit op bepaalde posities in de eiwitsequentie. Dit natuurlijke mechanisme wordt op grote schaal toegepast als een biotechnologische methode voor eiwittechnologie in de vorm van mutagenese en is gebaseerd op het repertoire van de 20 canonieke aminozuren die bij het proces betrokken zijn. De uitwisseling van prolineresiduen is echter problematisch. Door de speciale backbone-groepsarchitectuur is hij nauwelijks uitwisselbaar met de overige 19 resten voor vervanging72. Proline is bijvoorbeeld meestal bekend als een secundaire structuurbreker in polypeptidesequenties vanwege de slechte compatibiliteit met de meest voorkomende secundaire structuren, d.w.z. α-helix en β-streng. Deze proline-functie gaat gemakkelijk verloren wanneer het residu wordt gemuteerd tot een ander aminozuur uit het gemeenschappelijke repertoire. De vervanging van proline door zijn chemische analogen biedt een alternatieve benadering, die het mogelijk maakt om de basisbackbonekenmerken van het moederprolineresidu te behouden, terwijl vertekening wordt opgelegd aan de specifieke conformatieovergangen of modulaties van het moleculaire volume en de polariteit worden geproduceerd. Het is bijvoorbeeld mogelijk om bacterieculturen te voorzien van analoge structuren zoals hydroxy-, fluoro-, alkyl-, dehydroprolines, structuren met variabele ringgroottes en meer, waardoor de productie van een eiwit met specifieke prolineresiduveranderingen wordt vergemakkelijkt.

De selectieve drukincorporatie (SPI) methode die in deze studie wordt beschreven, maakt een globale, d.w.z. residuspecifieke vervanging van alle prolines in het doeleiwit door verwante chemische analogen mogelijk. Het belang van de methode wordt weerspiegeld door het feit dat SPI het mogelijk maakt om sequentieveranderingen te creëren die niet toegankelijk zijn voor gangbare mutagenesetechnieken. Het maakt bijvoorbeeld de productie mogelijk van een doeleiwit met vrij kleine structurele veranderingen die doorgaans niet groter zijn dan een of twee atoomvervangingen / deleties / toevoegingen, zoals aangetoond in deze studie. Dergelijke eiwitmodificaties worden "atomaire mutaties" genoemd 73,74. In een fluorescerend eiwit zoals GFP is het resultaat van deze moleculaire intrusie te zien in de snelheid van vouwing, lokale polariteiten, eiwitpakking, stabiliteit van de betrokken structurele kenmerken. De veranderingen in de absorptie- en fluorescentie-eigenschappen worden indirect geproduceerd als gevolg van de impact op eiwitvouwing en residumicro-omgevingen. De precisie van de moleculaire veranderingen die door SPI worden uitgevoerd, is meestal veel hoger, in vergelijking met mutaties van prolines naar andere canonieke residuen, waarbij de laatste meestal schadelijk zijn voor de eiwitvouwing, productie en isolatie.

Als productiemethode gebruikt de SPI-benadering de substraattolerantie van de aminoacyl-tRNA-synthetasezak naar chemische analogen van het inheemse aminozuur. Het synthetase is verantwoordelijk voor de juiste identificatie van de aminozuurstructuur, terwijl de opname in eiwitten stroomafwaarts in het translatieproces plaatsvindt. Instrumenteel worden de eiwitproductie, isolatie en zuivering in SPI uitgevoerd op een manier die typerend is voor andere recombinante eiwitexpressietechnieken; echter, met enkele toevoegingen aan het protocol als volgt: Proline, dat op weg is naar vervanging, wordt aan het begin van het fermentatieproces verstrekt, zodat de cellen kunnen groeien en hun intacte cellulaire machinerie kunnen ontwikkelen. De celkweek mag echter niet de maximale optische dichtheid bereiken, om de cellen in de logaritmische fase optimaal te houden voor eiwitexpressie. Er zijn op dit moment twee belangrijke variaties van de SPI-methode. In de eerste wordt de concentratie van proline in het initiële groeimedium (een chemisch gedefinieerd medium) zodanig aangepast dat uitputting van proline plaatsvindt zonder enige externe indringing. De cellen putten proline uit in het medium voordat ze de logaritmische groeifase kunnen verlaten, en vervolgens wordt het analoge toegevoegd en wordt de productie van het eiwit van belang geïnduceerd. In de tweede versie van de methode worden de cellen gekweekt in het medium dat proline bevat tot het midden van hun logaritmische fase. Op dit punt moeten de cellen worden verwijderd en fysiek worden overgebracht naar een ander medium, dat niet langer proline bevat, alleen het analoge, met daaropvolgende inductie van het eiwit van belang. In beide versies worden het analoge en het eiwitinductiereagens aan de voorgekweekte cellen geleverd. De isolatie en zuivering van het wild-type eiwit worden op dezelfde manier uitgevoerd als voor de varianten. In principe kan elke beschikbare Pro-auxotrofe stam worden gebruikt als expressiegastheer. Niettemin zijn expressietests om de meest geschikte host te identificeren raadzaam. Ook kunnen tests van verschillende chemisch gedefinieerde media worden gebruikt om de eiwitopbrengst te optimaliseren.

Er zijn bepaalde vereisten met betrekking tot de chemische analogen die in aanmerking moeten worden genomen voor SPI, zoals oplosbaarheid en concentratie. De metabole beschikbaarheid en opname van aminozuren zijn afhankelijk van het aantal opgeloste moleculen in het medium. Om de oplosbaarheid van een bepaalde verbinding te verhogen, kunnen licht zure of alkalische omstandigheden worden gekozen. Aangezien de kunstmatige moleculen groeiremmende effecten kunnen veroorzaken vanwege hun celtoxiciteit, moet de concentratie tot een minimum worden verlaagd om celstress te voorkomen75.

Een kleine zwakte van SPI is de afname van de integratie-efficiëntie met grotere aantallen posities die moeten worden uitgewisseld. In principe kan een vermindering van de aminozuurfrequentie in het doelbiomolecuul door plaatsgerichte mutagenese dit probleem oplossen. De structurele en functionele eigenschappen van een gewenst eiwit kunnen echter worden beïnvloed door het veranderen van de primaire structuur.

Zoals eerder vermeld, maakt SPI residu-specifieke vervanging van het canonieke aminozuur mogelijk. Dit houdt in dat niet-canonieke aminozuren in elke positie van het canonieke aminozuur in het doeleiwit worden ingebracht, inclusief geconserveerde residuen die onmisbaar zijn voor de eiwitfunctie of -vouwing. Alternatieve methoden voor locatiespecifieke integratie zijn de enige mogelijkheid om dit probleem op telossen 3. In de afgelopen decennia is de orthogonale paarmethode ontwikkeld die eiwitten kan produceren die gemodificeerde residuen bevatten op vooraf gedefinieerde locaties. De meest voorkomende wijziging van deze methode staat bekend als stopcodononderdrukking. Deze methode is gebaseerd op een technisch orthogonaal vertaalsysteem dat is bedoeld voor locatiespecifieke opname van synthetische aminozuren76. Meer dan 200 aminozuren met verschillende zijketenmodificaties zijn tot nu toe met behulp van deze aanpak in eiwitten opgenomen77. Deze translatiesystemen zijn echter nog steeds niet geschikt voor het inbrengen van proline-analogen in doeleiwitten. Bovendien worden de prestaties van de methode als laag beschouwd in het geval van kleine aminozuurmodificaties omdat enige achtergrondpromiscuïteit van het aminoacyl-tRNA-synthetase meestal in de gemanipuleerde translatiesystemen achterblijft.

Met behulp van SPI produceerden we een aantal β-barrel fluorescerende eiwitvarianten en bestudeerden we de uitkomsten van de uitwisseling van proline met zijn onnatuurlijke analogen. In het geval van proline-vervanging door R-Flp en Dfp werd een disfunctioneel eiwit geproduceerd door de expressiegastheer. Het effect wordt waarschijnlijk veroorzaakt door het verkeerd vouwen van eiwitten. Dit laatste kan afkomstig zijn van de C 4-exo conformatie bevorderd door R-Flp, die niet wordt gewaardeerd door de moeder-eiwitstructuren27. Met Dfp wordt de misplooiing waarschijnlijk geproduceerd door de verminderde snelheid van de trans-to-cis peptidebindingsisomerisatie bij het prolineresidu 27. Van dit laatste is bekend dat het een van de beperkende stappen is in het kinetische profiel van de eiwitvouwing die β-vatvorming en daaropvolgende chromofoorrijping beïnvloedt. Inderdaad, voor beide aminozuren, R-Flp en Dfp, resulteerde de eiwitproductie in een geaggregeerd en onoplosbaar eiwit. Bijgevolg kon chromofoorvorming niet plaatsvinden en ging de fluorescentie volledig verloren. Met S-Flp en Dhp werd echter een goede eiwitrijping waargenomen, wat resulteerde in fluorescerende eiwitmonsters voor elke analoge / eiwitcombinatie. Ondanks enkele modulaties in de absorptie- en fluorescentiekenmerken van het eiwit, bleven deze grotendeels vergelijkbaar met die van de wild-type eiwitten. Het effect van de aminozuursubstitutie werd onthuld in de hervouwkinetiekstudies. Deze laatste toonde een snellere hervouwing in het geval van vervanging door S-Flp. Modelstudies hebben aangetoond dat dit residu enige verbetering van de trans-naar-cis amiderotatiesnelheid kan veroorzaken en kan leiden tot de vorming van de C 4-endo-conformatie. Beide factoren zullen waarschijnlijk bijdragen aan de gunstige kinetische effecten van dit residu in EGFP. Dhp daarentegen produceerde kinetische vouwprofielen die maximaal vergelijkbaar waren met het moedereiwit. De diversiteit van de uitkomsten geproduceerd door louter atomaire mutaties in de onderzochte fluorescerende eiwitten illustreert het potentieel van de SPI-productiemethode bij het veranderen van doeleiwiteigenschappen. De eiwitveranderingen geïnduceerd door proline-vervanging door de analogen hebben verdere implicaties in de engineering van enzymen 78,79,80 en ionkanalen81,82, evenals in de algemene engineering van eiwitstabiliteit.

De basisbeperking van de SPI-methode is de "alles-of-geen" -modus bij het uitwisselen van proline bevindt zich met gerelateerde analogen. Het zou van groot voordeel zijn om precies te kunnen selecteren, welke prolineresiduen moeten worden vervangen door de analogen en welke ongewijzigd moeten blijven. Op dit moment is er echter geen techniek die zo'n geavanceerde productie zou kunnen uitvoeren met behulp van een microbiële productiegastheer. Chemische synthese van eiwitten83,84, evenals celvrije productie85,86, zijn de twee alternatieve methoden die positiespecifieke proline-modificaties kunnen produceren. Niettemin maken hun operationele complexiteit en lage productieopbrengsten ze inferieur in vergelijking met de productie in levende cellen. Vanaf nu blijft SPI de meest operationeel eenvoudige en robuuste aanpak voor de productie van complexe eiwitten met atomaire mutaties. Door onnatuurlijke aminozuurvervangers te introduceren, maakt de methode het mogelijk om eiwitkenmerken op een gerichte manier te wijzigen, zoals hier geïllustreerd door veranderingen in vouwing en lichtabsorptie / emissie van fluorescerende eiwitten gegenereerd door proline-vervangingen.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs onthullen alle belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de German Research Foundation (Cluster of Excellence "Unifying Systems in Catalysis) aan T.F. en N.B. en door het federale ministerie van Onderwijs en Wetenschap (BMBF-programma "HSP 2020", TU-WIMIplus Project SynTUBio) aan F.-J.S. en T.M.T.T.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AcetonitrileVWRHiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642LC-MS grade vereist
Acrylamide en bisacrylamide waterige stockoplossing in een verhouding van 37,5:1 (ROTIPHORESE Gel 30)Carl Roth3029.1
Agar-agarCarl Roth5210
Ammoniummolybdaat ((NH4)2MoO4)Sigma-Aldrich277908
Ammoniumperoxydisulfaat (APS)Carl Roth9592.2≥98 %, p.a., ACS-kwaliteit vereist
Ammoniumsulfaat ((NH4)2SO4)Sigma-AldrichA4418
AmpicillinnatriumzoutCarl RothK029
BiotineSigma-AldrichB4501
BroomfenolblauwSigma-AldrichB0126
Calciumchloride (CaCl2)Sigma-AldrichC5670
Coomassie Brillant Blauw R 250Carl Roth3862
Kopersulfaat (CuSO4)Carl RothCP86.1
D-glucoseCarl Roth6780
1,2-Bis-(dimethylamino)-ethaan, N,N,N',N'-Tetramethyleendiamine (TEMED)Carl Roth2367.3≥99 %, p.a., voor elektroforese
1,4-dithiothreitol (DTT)Carl Roth6908
Dichloormethaan (DCM)Sigma-Aldrich270997
di-kaliumwaterstoffosfaat (K2HPO4)Carl RothP749.1
di-natriumwaterstoffosfaat (Na2HPO4)Carl RothX987
DNase ISigma-AldrichD5025
Dowex 50WX8-100 (waterstofform)Acros Organics / Thermo Fisher Scientific (Waltham, U.S.A.)10731181kationenuitwisselingshars
EthanolCarl Roth9065.1
MierenzuurVWRHiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865LC-MS grade vereist
IJsazijnzuurCarl Roth3738.5100 %, p. a.
GlycerolCarl Roth3783
ImidazoolCarl RothX998
Waterstofchloride (HCl)Merck295426
IJzer(II)chloride (FeCl2)Sigma-Aldrich380024
IsopropanolCarl RothAE73.1
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG)Sigma-AldrichI6758
LysozymSigma-AldrichL6876
Magnesiumchloride (MgCl2)Carl RothKK36.1
Magnesiumsulfaat (MgSO4)Carl Roth8283.2
Mangaanchloride (MnCl2)Sigma-Aldrich63535
β-mercaptoethanolCarl Roth4227.3
PageRuler Unstained Protein LadderThermo Fisher Scientific26614
Kaliumchloride (KCl)Carl Roth6781.3
Kaliumdiwaterstoffosfaat (KH2PO4)Sigma-AldrichP5655
RNase ACarl Roth7156
Natriumchloride (NaCl)Carl RothP029
Natriumdiwaterstoffosfaat (NaH2PO4)Carl RothT879
Natriumdodecylsulfaat (NaC12H25SO4)Carl Roth0183
ThiamineSigma-AldrichT4625
Trifluorazijnzuur (TFA)Sigma-AldrichT6508
Trishydrochloride (Tris-HCl)Sigma-Aldrich857645
Tris(hydroxymethyl)-aminomethaan (Tris)Carl Roth5429
TryptoneCarl Roth8952
GistextractCarl Roth2363
Zinkchloride (ZnCl2)Sigma-Aldrich229997
L-alanineSigma-AldrichA7627
L-arginineSigma-AldrichA5006
L-asparagineSigma-AldrichA8381
L-aspartic acidSigma-AldrichA0884
L-cysteineSigma-AldrichC7352
L-glutamineSigma-AldrichG3126
L-glycineSigma-AldrichG7126
L-histidineSigma-AldrichH8000
L-isoleucineSigma-AldrichI2752
L-leucineSigma-AldrichL8000
L-lysineSigma-AldrichL5501
L-methionineSigma-AldrichM9625
L-phenylalanineSigma-AldrichP2126
L-prolineSigma-AldrichP0380
L-serineSigma-AldrichS4500
L-threonine

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Agostini, F., Völler, J. -S., Koksch, B., Acevedo-Rocha, C. G., Kubyshkin, V., Budisa, N. Biocatalysis with unnatural amino acids: Enzymology meets xenobiology. Angewandte Chemie (International ed. In English). 56 (33), 9680-9703 (2017).
  2. Minks, C., Alefelder, S., Moroder, L., Huber, R., Budisa, N. Towards new protein engineering: In vivo building and folding of protein shuttles for drug delivery and targeting by the selective pressure incorporation (SPI) method. Tetrahedron. 56 (48), 9431-9442 (2000).
  3. Hoesl, M. G., Budisa, N. Expanding and engineering the genetic code in a single expression experiment. Chembiochem: A, European Journal of Chemical Biology. 12 (4), 552-555 (2011).
  4. Wiltschi, B., Budisa, N. Natural history and experimental evolution of the genetic code. Applied Microbiology and Biotechnology. 74 (4), 739-753 (2007).
  5. Hoesl, M. G., et al. Lipase congeners designed by genetic code engineering. ChemCatChem. 3 (1), 213-221 (2011).
  6. FPbase avGFP. , Available from: https://www.fpbase.org/protein/avgfp/ (2011).
  7. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).
  8. Zhang, Y., et al. Identification of genes expressed in C. elegans touch receptor neurons. Nature. 418 (6895), 331-335 (2002).
  9. Misteli, T., Spector, D. L. Applications of the green fluorescent protein in cell biology and biotechnology. Nature Biotechnology. 15 (10), 961-964 (1997).
  10. Hanson, M. R., Köhler, R. H. GFP imaging: methodology and application to investigate cellular compartmentation in plants. Journal of Experimental Botany. 52 (356), 529-539 (2001).
  11. Sakamoto, S., Shoyama, Y., Tanaka, H., Morimoto, S. Application of green fluorescent protein in immunoassays. Advances in Bioscience and Biotechnology. 05 (6), 557-563 (2014).
  12. Akbar, M., Kim, H. Y. Green fluorescent protein tagging: A novel tool in biomedical research. Indian Journal of Biotechnology. 4, 466-470 (2005).
  13. Kobayashi, T., Morone, N., Kashiyama, T., Oyamada, H., Kurebayashi, N., Murayama, T. Engineering a novel multifunctional green fluorescent protein tag for a wide variety of protein research. PloS One. 3 (12), 3822(2008).
  14. Kent, K. P., Oltrogge, L. M., Boxer, S. G. Synthetic control of green fluorescent protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (44), 15988-15989 (2009).
  15. Born, J., Pfeifer, F. Improved GFP variants to study gene expression in Haloarchaea. Frontiers in Microbiology. 10, 1200(2019).
  16. Pakhomov, A. A., Martynov, V. I. GFP family: structural insights into spectral tuning. Chemistry & Biology. 15 (8), 755-764 (2008).
  17. Zimmer, M. Green fluorescent protein (GFP): applications, structure, and related photophysical behavior. Chemical Reviews. 102 (3), 759-781 (2002).
  18. Valbuena, F. M., Fitzgerald, I., Strack, R. L., Andruska, N., Smith, L., Glick, B. S. A photostable monomeric superfolder green fluorescent protein. Traffic. 21 (8), Copenhagen, Denmark. 534-544 (2020).
  19. Craggs, T. D. Green fluorescent protein: structure, folding and chromophore maturation. Chemical Society Reviews. 38 (10), 2865-2875 (2009).
  20. Maddalo, S. L., Zimmer, M. The role of the protein matrix in green fluorescent protein fluorescence. Photochemistry and Photobiology. 82 (2), 367-372 (2006).
  21. Cui, G., Lan, Z., Thiel, W. Intramolecular hydrogen bonding plays a crucial role in the photophysics and photochemistry of the GFP chromophore. Journal of the American Chemical Society. 134 (3), 1662-1672 (2012).
  22. Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. The molecular structure of green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).
  23. Andrews, B. T., Roy, M., Jennings, P. A. Chromophore packing leads to hysteresis in GFP. Journal of Molecular Biology. 392 (1), 218-227 (2009).
  24. Xie, J. -B., Zhou, J. -M. Trigger factor assisted folding of green fluorescent protein. Biochemistry. 47 (1), 348-357 (2008).
  25. Steiner, T., Hess, P., Bae, J. H., Wiltschi, B., Moroder, L., Budisa, N. Synthetic biology of proteins: tuning GFPs folding and stability with fluoroproline. PloS One. 3 (3), 1680(2008).
  26. Andrews, B. T., Schoenfish, A. R., Roy, M., Waldo, G., Jennings, P. A. The rough energy landscape of superfolder GFP is linked to the chromophore. Journal of Molecular Biology. 373 (2), 476-490 (2007).
  27. Kubyshkin, V., Davis, R., Budisa, N. Biochemistry of fluoroprolines: the prospect of making fluorine a bioelement. Beilstein Journal of Organic Chemistry. 17, 439-460 (2021).
  28. Renner, C., Alefelder, S., Bae, J. H., Budisa, N., Huber, R., Moroder, L. Fluoroprolines as tools for protein design and engineering. Angewandte Chemie (International ed. In English). 40 (5), 923-925 (2001).
  29. Fukuda, H., Arai, M., Kuwajima, K. Folding of green fluorescent protein and the cycle3 mutant. Biochemistry. 39 (39), 12025-12032 (2000).
  30. Rosenman, D. J., et al. Green-lighting green fluorescent protein: faster and more efficient folding by eliminating a cis-trans peptide isomerization event. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 23 (4), 400-410 (2014).
  31. Vitagliano, L., Berisio, R., Mastrangelo, A., Mazzarella, L., Zagari, A. Preferred proline puckerings in cis and trans peptide groups: implications for collagen stability. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 10 (12), 2627-2632 (2001).
  32. Kubyshkin, V. Experimental lipophilicity scale for coded and noncoded amino acid residues. Organic and Biomolecular Chemistry. 19 (32), 7031-7040 (2021).
  33. Kubyshkin, V., Budisa, N. cis-trans-Amide isomerism of the 3,4-dehydroproline residue, the 'unpuckered' proline. Beilstein Journal of Organic Chemistry. 12, 589-593 (2016).
  34. Budisa, N. Prolegomena to future experimental efforts on genetic code engineering by expanding its amino acid repertoire. Angewandte Chemie (International ed. In English). 43 (47), 6426-6463 (2004).
  35. Beatty, K. E., Tirrel, D. A. Noncanonical amino acids in protein science and engineering. Protein Engineering. Nucleic Acids and Molecular Biology. 22, Springer. Berlin, Heidelberg. (2009).
  36. Budisa, N. Engineering the Genetic Code: Expanding the Amino Acid Repertoire for the Design of Novel Proteins. , WILEY-VCH. Weinheim. (2006).
  37. Merkel, L., Budisa, N. Organic fluorine as a polypeptide building element: in vivo expression of fluorinated peptides, proteins and proteomes. Organic & Biomolecular Chemistry. 10 (36), 7241-7261 (2012).
  38. van Eldijk, M. B., van Hest, J. C. M. Residue-specific incorporation of non-canonical amino acids for protein engineering. Methods in Molecular Biology. 1728, Clifton, N.J. 137-145 (2018).
  39. Hartman, M. C. T. Non-canonical amino acid substrates of E. coli aminoacyl-tRNA synthetases. Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. , (2021).
  40. Gomez, M. A. R., Ibba, M. Aminoacyl-tRNA synthetases. RNA. 26 (8), 910-936 (2020).
  41. Grant, M. M., Brown, A. S., Corwin, L. M., Troxler, R. F., Franzblau, C. Effect of l-azetidine 2-carboxylic acid on growth and proline metabolism in Escherichia coli. Biochimica et Biophysica Acta. 404 (2), 180-187 (1975).
  42. Budisa, N., Steipe, B., Demange, P., Eckerskorn, C., Kellermann, J., Huber, R. High-level biosynthetic substitution of methionine in proteins by its analogs 2-aminohexanoic acid, selenomethionine, telluromethionine and ethionine in Escherichia coli. European Journal of Biochemistry. 230 (2), 788-796 (1995).
  43. Budisa, N., Pal, P. P. Designing novel spectral classes of proteins with a tryptophan-expanded genetic code. Biological Chemistry. 385 (10), 893-904 (2004).
  44. Hoesl, M. G., Budisa, N. Recent advances in genetic code engineering in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 751-757 (2012).
  45. Nickling, J. H., et al. Antimicrobial peptides produced by selective pressure incorporation of non-canonical amino acids. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57551(2018).
  46. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
  47. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
  48. Sarkisyan, K. S., et al. fluorescent protein with anionic tryptophan-based chromophore and long fluorescence lifetime. Biophysical Journal. 109 (2), 380-389 (2015).
  49. Sarkisyan, K. S., et al. KillerOrange, a genetically encoded photosensitizer activated by blue and green light. PloS One. 10 (12), 0145287(2015).
  50. Grigorenko, B. L., Krylov, A. I., Nemukhin, A. V. Molecular modeling clarifies the mechanism of chromophore maturation in the green fluorescent protein. Journal of the American Chemical Society. 139 (30), 10239-10249 (2017).
  51. Pletnev, V. Z., et al. Structure of the green fluorescent protein NowGFP with an anionic tryptophan-based chromophore. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 71, Pt 8 1699-1707 (2015).
  52. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
  53. Hörnsten, E. G. On culturing Escherichia coli on a mineral salts medium during anaerobic conditions. Bioprocess Engineering. 12 (3), 157-162 (1995).
  54. Davis, B. D. The Isolation of biochemically deficient mutants of bacteria by means of penicillin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 35 (1), 1-10 (1949).
  55. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY, USA. (2001).
  56. Wang, Y. -S., et al. The de novo engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase for genetic incorporation of L-phenylalanine and its derivatives. Molecular bioSystems. 7 (3), 714-717 (2011).
  57. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. ImageJ at (2021).
  58. ImageJ. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/ (2021).
  59. Baumann, T., et al. Engineering 'Golden' fluorescence by selective pressure incorporation of non-canonical amino acids and protein analysis by mass spectrometry and fluorescence. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57017(2018).
  60. FPbase NowFFP. , Available from: https://www.fpbase.org/protein/nowgfp/ (2021).
  61. Markwardt, M. L., et al. An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching. PloS One. 6 (3), 17896(2011).
  62. Gotthard, G., von Stetten, D., Clavel, D., Noirclerc-Savoye, M., Royant, A. Chromophore isomer stabilization is critical to the efficient fluorescence of cyan fluorescent proteins. Biochemistry. 56 (49), 6418-6422 (2017).
  63. Lelimousin, M., et al. Intrinsic dynamics in ECFP and Cerulean control fluorescence quantum yield. Biochemistry. 48 (42), 10038-10046 (2009).
  64. FPbase mKillerOrange. , Available from: https://www.fpbase.org/protein/mkillerorange/ (2021).
  65. Pletneva, N. V., et al. Crystal structure of phototoxic orange fluorescent proteins with a tryptophan-based chromophore. PloS One. 10 (12), 0145740(2015).
  66. Royant, A., Noirclerc-Savoye, M. Stabilizing role of glutamic acid 222 in the structure of Enhanced Green Fluorescent Protein. Journal of Structural Biology. 174 (2), 385-390 (2011).
  67. Larregola, M., Moore, S., Budisa, N. Congeneric bio-adhesive mussel foot proteins designed by modified prolines revealed a chiral bias in unnatural translation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 421 (4), 646-650 (2012).
  68. Yamaguchi, H., Miyazaki, M. Refolding techniques for recovering biologically active recombinant proteins from inclusion bodies. Biomolecules. 4 (1), 235-251 (2014).
  69. Ghisaidoobe, A. B. T., Chung, S. J. Intrinsic tryptophan fluorescence in the detection and analysis of proteins: A focus on Förster resonance energy transfer techniques. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 22518-22538 (2014).
  70. Pal, P. P., et al. Structural and spectral response of Aequorea victoria green fluorescent proteins to chromophore fluorination. Biochemistry. 44 (10), 3663-3672 (2005).
  71. Pletnev, S., et al. Structural basis for phototoxicity of the genetically encoded photosensitizer KillerRed. The Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 32028-32039 (2009).
  72. Kubyshkin, V., Budisa, N. Anticipating alien cells with alternative genetic codes: away from the alanine world. Current Opinion in Biotechnology. 60, 242-249 (2019).
  73. Minks, C., Huber, R., Moroder, L., Budisa, N. Atomic mutations at the single tryptophan residue of human recombinant annexin V: effects on structure, stability, and activity. Biochemistry. 38 (33), 10649-10659 (1999).
  74. Budisa, N., Huber, R., Golbik, R., Minks, C., Weyher, E., Moroder, L. Atomic mutations in annexin V thermodynamic studies of isomorphous protein variants. European Journal of Biochemistry. 253, 1-9 (1998).
  75. Lin, X., Yu, A. C. S., Chan, T. F. Efforts and challenges in engineering the genetic code. Life. 7, Basel, Switzerland. (2017).
  76. Völler, J. -S., Budisa, N. Coupling genetic code expansion and metabolic engineering for synthetic cells. Current Opinion in Biotechnology. 48, 1-7 (2017).
  77. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annual Review of Biochemistry. 79, 413-444 (2010).
  78. Lukesch, M. S., Pavkov-Keller, T., Gruber, K., Zangger, K., Wiltschi, B. Substituting the catalytic proline of 4-oxalocrotonate tautomerase with non-canonical analogues reveals a finely tuned catalytic system. Scientific Reports. 9 (1), 2697(2019).
  79. Acevedo-Rocha, C. G., et al. Non-canonical amino acids as a useful synthetic biological tool for lipase-catalysed reactions in hostile environments. Catalysis Science & Technology. 3 (5), 1198(2013).
  80. Holzberger, B., Marx, A. Replacing 32 proline residues by a non-canonical amino acid results in a highly active DNA polymerase. Journal of the American Chemical Society. 132 (44), 15708-15713 (2010).
  81. Mosesso, R., Dougherty, D. A., Lummis, S. C. R. Proline residues in the transmembrane/extracellular domain interface loops have different behaviors in 5-HT3 and nACh receptors. ACS Chemical Neuroscience. 10 (7), 3327-3333 (2019).
  82. Mosesso, R., Dougherty, D. A., Lummis, S. C. R. Probing proline residues in the prokaryotic ligand-gated ion channel, ELIC. Biochemistry. 57 (27), 4036-4043 (2018).
  83. Torbeev, V. Deciphering protein folding using chemical protein synthesis. Total Chemical Synthesis of Proteins. 1st ed. , WILEY-VCH. Weinheim. (2021).
  84. Torbeev, V. Y., Hilvert, D. Both the cis-trans equilibrium and isomerization dynamics of a single proline amide modulate β2-microglobulin amyloid assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20051-20056 (2013).
  85. Kawakami, T., Ishizawa, T., Murakami, H. Extensive reprogramming of the genetic code for genetically encoded synthesis of highly N-alkylated polycyclic peptidomimetics. Journal of the American Chemical Society. 135 (33), 12297-12304 (2013).
  86. Cui, Z., Johnston, W. A., Alexandrov, K. Cell-free approach for non-canonical amino acids incorporation into polypeptides. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1031(2020).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Selectieve drukincorporatieEiwitvouwingEiwitstabiliteitChromofoorrijpingSDS PAGEMassaspectrometrieEiwitrefoldingProtein engineering

Gerelateerde artikelen