Dit artikel beschrijft een nieuw diermodel dat is ontwikkeld om de anatomie en histologie van het hoornvlies en zijn genezingsprocessen te bestuderen. Dit nieuwe diermodel maakt gebruik van de Mongoolse gerbil, die een hoornvlies heeft met veel overeenkomsten met het menselijk hoornvlies.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Mongoolse Gerbils als een diermodel voor wondgenezing
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Cornea wondgenezingsstudies worden al lange tijd uitgevoerd en hebben geholpen om lijden te verminderen en behandelingen te ontwikkelen die bijdragen aan het verbeteren van de ooggezondheid van patiënten. Historisch gezien is corneagenezing bestudeerd bij knaagdieren zoals muizen en ratten, maar deze modellen bootsen menselijke aandoeningen mogelijk niet volledig na. Informatie over andere knaagdieren zoals Mongoolse gerbils (Meriones unguiculatus) is echter schaars in hoornvliesonderzoek.
Hier beschrijven we een techniek om een nieuw diermodel te ontwikkelen voor het bestuderen van corneagenezing na fotorefractieve keratectomie. Vanwege de beperkte literatuur die beschikbaar is over het hoornvlies van M. unguiculatus, beschrijven we ook een histologische analyse van het normale hoornvlies. Deze onderzoekstechnieken kunnen ook worden gebruikt bij de studie van oogziekten vanwege de gelijkenis tussen de hoornvliezen van Mongoolse gerbils en mensen op het gebied van genetica, anatomie en fysiologie.
Inleiding
Enkele van de belangrijkste aspecten van cornea wondgenezing, die belangrijke aandachtspunten zijn voor anterieure segmentchirurgie, zijn de integriteit van de epitheliale architectuur, het behoud van de transparantie van het corneastroma en ten slotte de uitkomst in termen van de brekingseigenschappen van het hoornvlies1.
Het hoornvlies is het buitenste heldere weefsel aan de voorkant van de oogbol en is daarom vatbaar voor trauma, infecties en brandwonden; de verminderde genezing van deze wonden kan de visuele gezondheid in gevaar brengen2.
Op dit moment zijn er verschillende diermodellen beschikbaar om de genezing van het hoornvlies te bestuderen, en sommige zijn beter dan andere, afhankelijk van de soort en het type mechanisme dat moet worden bestudeerd1. Er zijn een paar verslagen van eerdere onderzoeken op het netvlies van gerbils2. Tot nu toe is er echter geen gepubliceerde literatuur over de littekenprocessen in het hoornvlies van deze knaagdieren.
Hier presenteren we Meriones unguiculatus (Mongoolse gerbil) als een diermodel van wondgenezing in het hoornvlies. Procedures om corneagenezing na fotorefractieve keratectomie uit te lokken worden beschreven, waardoor we de verschillende soorten cornealittekenprocessen kunnen bestuderen, wondgenezing kunnen begrijpen in termen van de dynamische fasen van levend weefsel en ten slotte geschikte toekomstige behandelingen kunnen plannen3. Fototherapeutische keratectomie is een zeer reproduceerbare techniek met de mogelijkheid om parameters zoals de diepte en diameter van het hoornvliesletsel nauwkeurig te regelen4. Bovendien vereist deze techniek geen procedures met chirurgische instrumenten of chemische oplossingen (bijv. zoutoplossing, formaline, alcohol, enz.) die variabelen kunnen toevoegen die specifiek zijn voor de instrumenten of voor de operator die de procedure uitvoert5.
Drie 6 maanden oude mannelijke gerbils van vergelijkbare groottes en gewichten (ongeveer 90 g) werden gebruikt voor het experiment dat in dit artikel wordt gepresenteerd. De ingrepen werden alleen in de rechter ogen uitgevoerd. Eén gerbil (aangeduid als gerbil 1 of controle) onderging geen fototherapeutische keratectomie en werd geïnsufficiënteerd om alle normale oculaire structuren te evalueren. Fototherapeutische keratectomie omvat de gecontroleerde afgifte van excimeer lasergegenereerd ultraviolet licht aan het hoornvlies en is ontwikkeld om refractieve chirurgie uit te voeren6. Het is gebruikt bij andere knaagdieren, zoals muizen7. De andere twee gerbils werden onderworpen aan fototherapeutische keratectomie. Een van hen werd na 24 uur (gerbil 2 genoemd) en de andere na de operatie (gerbil 3) en de andere om 96 uur (gerbil 3 genoemd).
Om dit experiment uit te voeren, werd een willekeurig geselecteerde gerbil gefilmd voor elke te bestuderen aandoening, maar dit experiment werd eerder uitgevoerd met 16 gerbils in totaal voor elke aandoening. Om bewerkingsredenen werd besloten om voor elke aandoening (drie gerbils in totaal) een willekeurig geselecteerde gerbil te gebruiken.
Het belangrijkste doel van dit onderzoek is om het beste diermodel te verkennen dat beschikbaar is. Het is echter belangrijk op te merken dat niet alle soorten oogkenmerken hebben die vergelijkbaar zijn met die van het menselijk oog8. Dit artikel beschrijft de methodologie die wordt gebruikt om het hoornvlies van Meriones unguiculatus te bestuderen en de procedure die wordt uitgevoerd om de hoornvliesbeschadiging te genereren, waardoor we het genezingsproces kunnen bestuderen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle onderzoeksprocedures werden goedgekeurd door de "Institutionele Commissie voor de verzorging en het gebruik van proefdieren" van Universidad Católica de Córdoba en volgden de Gids van de Nationale Onderzoeksraad voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Deze procedures werden ook goedgekeurd door de autoriteiten van de "Facultad de Ciencias de la Salud" van Universidad Católica de Córdoba en "Instituto de la Visión Cerro".
1. Gerbil behandeling en anesthesie
OPMERKING: Alle dieren waren specifieke pathogeenvrije (SFP) mannelijke Mongoolse gerbils en werden gehouden in de faciliteiten van het Center for Research and Development in Immunology and Infectious Diseases (CIDIE) (Córdoba, Argentinië). Ze werden verkregen van Universidad de La Plata (Buenos Aires, Argentinië).
- Huis de gerbils sociaal in polysulfonkooien bezaaid met maïskolfstrooisel. Zorg voor voedsel en gefilterd kraanwater in waterflessen ad libitum. Zorg ervoor dat het kamertemperatuurbereik 18 °C tot 24 °C is en dat een licht-donkercyclus van 12:12 uur wordt gebruikt.
- Weeg elke gerbil afzonderlijk en identificeer ze allemaal om verwarring te voorkomen. Maak een markering met een onuitwisbare inktmarkering op de basis van de staart van de gerbil. Gebruik een pincet om het oor van de gerbil vast te houden en maak een markering met behulp van de onuitwisbare marker op het oor van het knaagdier. Als een laboratorium en een groot biotherium beschikbaar zijn, wijs dan een unieke kooi toe voor elk knaagdier met de bijbehorende identificatie.
- Desinfecteer de laminaire stromingskap met 70% ethanoloplossing. Plaats alle chirurgische en wegwerpinstrumenten, inclusief naalden, spuiten en rekken, in het werkgebied in de kap. Plaats ook een wegwerp chirurgisch schuim in de kap.
- Gebruik een kleine open plastic container om het knaagdier op de precisiebalans te houden om de meting te vergemakkelijken.
- Gebruik drie 6 maanden oude mannelijke Mongoolse gerbils van vergelijkbare groottes en gewichten (~ 80 g) voor dit experiment. Plaats elke kooi één voor één met het knaagdier in de laminaire stromingskap. Open de kooien, identificeer elk van de gerbils en weeg ze op de weegschaal.
OPMERKING: Gerbils zijn onschadelijke maar delicate dieren. Draag wegwerphandschoenen bij het hanteren van de gerbils. - Pak de gerbil vast met de niet-dominante hand om hem stevig bij de staart vast te houden. Gebruik de dominante hand, met de duim en wijsvinger achter de oren, om het dier vast te houden met het ventrale gebied naar boven gericht. Gebruik de pink om de staart vast te houden.
- Vul een spuit met een naald van 30 G met 1 ml ketamine en xylazine. Dien de anesthesie intraperitoneaal toe aan het knaagdier (50-100 mg/kg ketamine en 2 mg/kg xylazine)9 met behulp van de dominante hand. De duur van het effect zal ongeveer 20-50 minuten zijn (variaties kunnen optreden).
- Om ervoor te zorgen dat de gerbil volledig verdoofd is, controleert u met een teenknijper, staartknel en hoornvliesreflectie, enz., Voordat u incisies in het hoornvlies maakt.
OPMERKING: Voer alle procedures alleen in het rechteroog uit.
2. Optische coherentietomografie (OCT) van het hoornvlies
- Plaats steriele chirurgische gordijnen om de apparatuur te beschermen tegen afscheidingen of dierenhaar.
- Zorg ervoor dat een van de operators het dier vasthoudt terwijl een andere operator de beelden maakt. De operator moet zijn handen op de apparatuur laten rusten terwijl hij de gerbil vasthoudt, zodat het oog van de gerbil zo stabiel en nog steeds te bestuderen is. Laat de hand rusten met de gerbil op de kinsteun..
- Start de software die de OCT bestuurt en druk op Afbeelding nemen en vervolgens op Gewenste afbeelding opslaan. Voer meerdere sagittale en coronale plakjes van het hoornvlies uit. Beeld het oog onder de OCT af en maak meerdere plakjes om het voorste segment van het hoornvlies van het knaagdier te bekijken.
OPMERKING: Als het verkregen beeld niet scherp is en het oog enigszins is bewogen, herhaalt u de procedure meerdere keren om voldoende beelden te verkrijgen. - Voer met behulp van de OCT-software pachymetrische metingen uit van de centrale en perifere regio's. Druk in het hoofdscherm van de software op Afbeelding maken en druk vervolgens op de knop Gewenste afbeelding opslaan .
- Voer metingen uit op het normale of controleoog en onmiddellijk na fototherapeutische keratectomie op de andere knaagdierogen.
3. Excimer laser fototherapeutische keratectomie (PTK)
- Plaats steriele chirurgische gordijnen op het excimeerlaserapparaat om de apparatuur te beschermen tegen afscheidingen of dierenhaar.
- Instilleer een druppel topisch proparacaïnehydrochloride (0,5%) in het oog dat 5 minuten voor de chirurgische ingreep moet worden behandeld.
- Gebruik de niet-dominante hand om de gerbil stevig vast te houden. Open met de dominante hand de oogleden van het dier zodat de beelden goed kunnen worden vastgelegd. Om scherp te kunnen stellen en een scherp beeld te verkrijgen, moet u ervoor zorgen dat de handen van de persoon die de gerbil vasthoudt op het hoofd van de apparatuur rusten. Plaats de handen die het dier vasthouden op de plaats waar een patiënt zijn nek zou plaatsen.
- Voer PTK-ablatie uit op het rechteroog. Gebruik de volgende parameters: een ablatie tussen 60 μm en 62 μm dik, een optische zone van 3 mm, een duur van 4 s en een totaal van 1.867 pulsen.
OPMERKING: PTK wordt alleen uitgevoerd op gerbil 2 en gerbil 3. In deze stap bereidt en activeert de tweede operator de laser om het hoornvliesweefsel te aborteren. - Neem onmiddellijk na de procedure foto's en voer OCT-analyses uit om oppervlakteveranderingen in de behandelde ogen vast te leggen en te documenteren.
- Zodra de procedure is voltooid, plaatst u het knaagdier terug in de kooi, controleert u de vitale functies (hartslag: 360 slagen per minuut; rectale temperatuur: 37-38,5 ° C; ademhalingsfrequentie: 90 ademhalingen per minuut) en laat u het dier herstellen van de anesthesie.
4. Ontwaken van de gerbils na cornea PTK
- Dien buprenorfine (0,1 mg/kg tot 0,05 mg/kg) en atipamezol (0,1-1 mg/kg) toe via intraperitoneale injecties.
- Plaats elke gerbil in zijn respectievelijke thuiskooi en controleer de vitale functies voor normaal ontwaken (de normale lichaamstemperatuur is 37-39 ° C).
- Breng een erytromycinezalf aan om het oppervlak schoon te houden en infectie te voorkomen. Voer deze procedure twee keer per dag uit.
- Dien buprenorfine (elke 6-12 uur) subcutaan (0,01-0,05 ml) toe voor analgesie en oogzalf op twee opeenvolgende dagen na PTK.
5. Euthanasiemethode
- Voer waar mogelijk euthanasie uit in de thuiskooi.
- Breng samengeperst koolstofdioxide (CO2) gas in de thuiskooi. Een vulsnelheid van 30% -70% van het kamervolume per minuut met CO2 toegevoegd aan de bestaande lucht in de thuiskooi is voldoende om een mengsel te bereiken dat aan de doelstelling voldoet (gebruik voor een volumekamer van 10 L een debiet van 3-7 L / min). Gebruik cervicale dislocatie (als een secundaire methode van euthanasie) om de dood van het knaagdier te garanderen.
- Verwijder het dier na 24 uur en 96 uur na de operatie voor respectievelijk gerbil 2 en gerbil 3 uit de thuiskooi om de enucleatie van de oogbol (zowel de normale oogbol als die welke een operatie ondergaat) uit te voeren om de genezing van het hoornvlies te observeren.
- Plaats het dier op de operatietafel en controleer op de afwezigheid van een hartslag gedurende ongeveer 1 minuut.
6. Oogchirurgie
- Verwijder de bovenste en onderste oogleden om toegang te krijgen tot de oogbol. Gebruik een chirurgische tang en een schaar om de oogleden te verwijderen. De grootte van het werkgebied is zo klein en delicaat dat het verwijderen van de oogleden het mogelijk maakt om de oogbol te enucleren zonder deze te beschadigen.
- Om de oogbol te enucleeren, maakt u een incisie in de externe canthus en leidt u de schaar in een achterste richting. Herhaal deze procedure vanuit de interne canthus door de oogbol van de baan te scheiden.
- Sectie van de oogzenuw aan de achterkant van de oogbol. Er moet worden verduidelijkt dat de posterieure orbitale plexus meestal lichte bloedingen genereert bij het uitvoeren van deze techniek, wat het werk moeilijk maakt.
- Breng de oogbol gedurende 30 s tot 1 minuut in een microcentrifugebuis met steriele zoutoplossing om eventueel achtergebleven bloed weg te spoelen.
- Plaats de oogbol in een microcentrifugebuis met 10% formaldehyde voor daaropvolgende anatomo-pathologische analyse zoals hieronder beschreven. Maak meerdere foto's en foto's.
7. Anatomo-pathologische analyse
- Integreer het hele oog in 10% gebufferd formaline gedurende 6-24 uur.
- Snijd het weefsel met behulp van een microtoom. Zorg ervoor dat het gesneden weefsel een dikte heeft van 3 mm.
- Week het weefsel in 96% alcohol gedurende 30-90 minuten en herhaal deze procedure twee keer.
- Plaats het weefsel gedurende 30-90 minuten in isopropylalcohol en herhaal deze procedure tweemaal.
- Doe het weefsel in xyleen of xyleenvervanger gedurende 1-3 uur.
- Sluit het weefsel minimaal 1 uur in vloeibare kerosine in.
- Gebruik een blok om het weefsel te plaatsen en in vloeibare paraffine in te bedden. Laat het stollen (plaats het op een koude plaats) en snijd het.
- Bereid de microtoom voor op secties volgens de instructies van de fabrikant.
- Gebruik vervolgens vlekken zoals hematoxyline en eosine.
- Maak foto's met de camera toegevoegd aan de microscoop.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In deze studie werd de volledige corneastructuur grondig geanalyseerd met behulp van histologische technieken en aanvullende studies van het voorste segment, zoals optische coherentietomografie. De beeldanalyse met behulp van optische coherentietomografie van de voorste segmentstructuren toont een normaal epitheel en stroma (figuur 1), met centrale en perifere hoornvliesdiktes van respectievelijk 160 μm en 106 μm ± 2 μm. Andere publicaties hebben ook aangetoond dat het hoornvlies van andere ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De fysiologie van cornea wondgenezing is een balans tussen weefselregeneratie en het behoud van homeostase. Overmatige wondgenezing kan leiden tot fibrose en littekens, wat uiteindelijk kan leiden tot het verlies van de orgaanfunctie. Met de snelle evolutie van corneachirurgische procedures kan het belang van het begrijpen van corneawondgenezing en de fysiologische en pathologische gebeurtenissen die ermee gepaard gaan niet worden overschat11.
Meerdere onderzoekswerken...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We willen ingenieur Rodrigo de la Fuente bedanken voor zijn onschatbare hulp en technische ondersteuning. We bedanken ook María Eugenia Corbela voor de vertelling en Priscilla Hazrún voor de uitgave van de figuren. Hugo Luján stond ons toe om gebruik te maken van de faciliteiten van het Center for Research and Development in Immunology and Infectious Diseases (CIDIE).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Anesthesie | Tododrogas | ||
| Eppendorfbuisjes | Tododrogas | ||
| Excimerlaser | Technolas | 2022445 | |
| Fluoresceïne | Poen | ||
| Pincetten | Ofcor | 3339 | |
| Formaldehyde | Tododrogas | ||
| Handschoenen | Tododrogas | ||
| Ketamine | Sigma-Aldrich | ||
| Optische coherentietomografie | Optovue | 659007 | |
| Proparacaïne | Poen | ||
| Scharen | Ofcor | 3336 | |
| Steriele schermen | Soporte hospitalario | ||
| Steriele gaasjes | Soporte hospitalario | ||
| Spuiten en naalden | Tododrogas | ||
| Xylazin | Sigma-Aldrich |
Referenties
- Kuo, I. C. Corneal wound healing. Current Opinion in Ophthalmology. 15 (4), 311-315 (2004).
- Agrawal, V. B., Tsai, R. J. Corneal epithelial wound healing. Indian Journal of Ophthalmology. 51 (1), 5-15 (2003).
- Lu, L., Reinach, P. S., Kao, W. W. Corneal epithelial wound healing. Experimental Biology and Medicine. 226 (7), 653-664 (2001).
- Rathi, V. M., Vyas, S. P., Sangwan, V. S. Phototherapeutic keratectomy. Indian Journal of Ophthalmology. 60 (1), 5-14 (2012).
- Baumeister, M., Bühren, J., Ohrloff, C., Kohnen, T. Corneal re-epithelialization following phototherapeutic keratectomy for recurrent corneal erosion as in vivo model of epithelial wound healing. Ophthalmologica. 223 (6), 414-418 (2009).
- Fagerholm, P. Phototherapeutic keratectomy: 12 years of experience. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 81 (1), 19-32 (2003).
- Mohan, R. R., Stapleton, W. M., Sinha, S., Netto, M. V., Wilson, S. E. A novel method for generating corneal haze in anterior stroma of the mouse eye with the excimer laser. Experimental Eye Research. 86 (2), 235-240 (2008).
- Shah, D., Aakalu, V. K. Murine corneal epithelial wound modeling. Methods in Molecular Biology. 2193, 175-181 (2021).
- Gerbil-Specific Anesthesia Guidance. Animal Resources Center. The University of Texas at Austin. , Available from: research.utexas.edu/wp-content/uploads/sites/7/2020/02/Gerbil_Anesthesia_Guidance_ARC_112519.pdf (2020).
- Zorio, D. A. R., et al. De novo sequencing and initial annotation of the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus) genome. Genomics. 111 (3), 441-449 (2019).
- Kalha, S., Kuony, A., Michon, F. Corneal epithelial abrasion with ocular burr as a model for cornea wound. Journal of Visualized Experiments. (137), e58071(2018).
- Yang, S., et al. The electroretinogram of Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus.): Comparison to mouse. Neuroscience Letters. 589, 7-12 (2015).
- Baker, A. G., Emerson, V. F. Grating acuity of the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus). Behavioural Brain Research. 8 (2), 195-209 (1983).
- Govardovskii, V. I., Röhlich, P., Szél, A., Khokhlova, T. V. Cones in the retina of the Mongolian gerbil, Meriones unguiculatus: An immunocytochemical and electrophysiological study. Vision Research. 32 (1), 19-27 (1992).
- Zanandréa, L. I., Oliveira, G. M., Abreu, A. S., Pereira, F. E. Ocular lesions in gerbils (Meriones unguiculatus) infected with low larval burden of Toxocara canis: Observations using indirect binocular ophthalmoscopy. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 41 (6), 570-574 (2008).
- Cheng, S., et al. Enhancement of de novo sequencing, assembly and annotation of the Mongolian gerbil genome with transcriptome sequencing and assembly from several different tissues. BMC Genomics. 20 (1), 903(2019).
- Henriksson, J. T., McDermott, A. M., Bergmanson, J. P. Dimensions and morphology of the cornea in three strains of mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 50 (8), 3648-3654 (2009).
- Panagiotopoulos, M., Gan, L., Fagerholm, P. Stroma remodelling during healing of corneal surface irregularities induced by PTK. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 85 (4), 387-394 (2007).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
