Ontwerp en micro-injectie van morfolino-antisense-oligonucleotiden en mRNA in zebravisembryo's om de specifieke genfunctie in de ontwikkeling van het hart op te helderen

Samenvatting

Het huidige protocol beschrijft het ontwerpen, bereiden en micro-injecteren van een translationeel blokkerend morfolino tegen een representatief hartgen; Hart- en neurale lijstderivaten tot expressie2 (hand2) in de dooier van pas bevruchte zebravisembryo's om de genfunctie uit te schakelen. Het toont ook een voorbijgaande redding van deze "morfranten" door co-injectie van mRNA dat codeert voor dit genproduct.

Samenvatting

Het op morfolino-oligomeer gebaseerde knockdown-systeem is gebruikt om de functie van verschillende genproducten te identificeren door verlies of verminderde expressie. Morpholino's (MO's) hebben het voordeel in biologische stabiliteit ten opzichte van DNA-oligo's omdat ze niet gevoelig zijn voor enzymatische afbraak. Voor een optimale effectiviteit worden MO's geïnjecteerd in embryo's in 1-4 celstadium. De tijdelijke werkzaamheid van knockdown is variabel, maar men gelooft dat MO's uiteindelijk hun effecten verliezen als gevolg van verdunning. De morfolinoverdunning en de injectiehoeveelheid moeten nauwlettend worden gecontroleerd om het optreden van off-target effecten te minimaliseren en tegelijkertijd de werkzaamheid op het target te behouden. Aanvullende aanvullende hulpmiddelen, zoals CRISPR/Cas9, moeten worden uitgevoerd tegen het doelgen van belang om mutante lijnen te genereren en om het morfantfenotype met deze lijnen te bevestigen. Dit artikel laat zien hoe een translatieblokkerende morfolino tegen hand2 kan worden ontworpen, bereid en micro-geïnjecteerd in de dooier van zebravisembryo's in het 1-4 celstadium om de hand2-functie uit te schakelen en deze "morfanten" te redden door co-injectie van mRNA dat codeert voor het overeenkomstige cDNA. Vervolgens wordt de werkzaamheid van de morfolino-micro-injecties beoordeeld door eerst de aanwezigheid van morfolino in de dooier te verifiëren (geco-geïnjecteerd met fenolrood) en vervolgens door fenotypische analyse. Bovendien zal cardiale functionele analyse om de werkzaamheid van knockdowns te testen worden besproken. Ten slotte zal het beoordelen van het effect van morfolino-geïnduceerde blokkering van gentranslatie via western blotting worden uitgelegd.

Inleiding

Het gebruik van zebravissen als model voor de studie van cardiovasculaire ontwikkeling en ziekte biedt een verscheidenheid aan voordelen, waaronder een hoog behoud van de genfunctie, optische transparantie, snelle cardiovasculaire ontwikkeling en goedkopere kosten in vergelijking met traditionele in vivo modellen¹. Morpholino-oligonucleotiden (MO's) zijn de meest gebruikte antisense-gen-knockdown-instrumenten voor het zebravismodel. MO's worden vaak gebruikt om een fenotype te bepalen of om de genfunctie te onderzoeken. Dr. James Summerton ontwikkelde aanvankelijk het morfolino-afgiftesysteem voor de in vivo remming van mRNA-translatie als een poging om therapieën te ontwikkelen voor menselijke ontwikkelingsstoornissen ^2,3. MO's zijn gebruikt voor in vitro en in vivo modelorganismen om genen neer te halen en de gevolgen van deze knockdown op het fenotype te onderzoeken. Dit wordt gedaan door veranderingen in de ontwikkeling van specifieke organen, bijvoorbeeld het hart, waar te nemen. Knockdown van hartspecifieke genen in WT-zebravisembryo's leidde tot het falen van een goede hartslag, wat getuigt van de onmisbare functie van deze genen voor de ontwikkeling van het hart ^4,5. Deze fenotypes werden gered door co-injectie van mRNA's voor de specifieke genen. Een studie met cardiaal troponine T (Tnnt2) toonde aan dat de expressie van tnnt2-mRNA van volledige lengte sarcomere fenotypes kon redden die werden veroorzaakt door morfolino-knockdown⁶. Een andere studie toonde aan dat de integriteit van A-banden en Z-schijven kan worden hersteld door overexpressie van het regulerende myosine lichte keten ortholoog (cmlc2) mRNA in cmcl2-morcanen ⁷.

MO's worden vaak gebruikt om genexpressie te onderdrukken door zich te richten op pre-mRNA-splitsing of door translatie te blokkeren. Splice-blokkerende MO's binden en remmen pre-mRNA door het splicesoom te remmen. Translationele blokkering treedt op wanneer de MO bindt aan het 5'-niet-getransleerde gebied van complementair mRNA om de ribosoomassemblage te belemmeren. MO's zijn de meest gebruikte genspecifieke methode om genexpressie voor in vivo modellen uit te schakelen; ze zijn ook de meest efficiënte mRNA-blokkers die in celculturen worden gebruikt. De morfolino zelf bestaat meestal uit een korte keten (ongeveer 25) van morfolino-subeenheidbasen. Elke MO-subeenheid bevat een nucleïnezuurbase, een morfolinering en een niet-ionisch fosforodiamidaat. De verschillende werkingsmechanismen voor de twee soorten MO's vereisen verschillende tests om de doeltreffendheid van de knockdown te verifiëren. Voor MO's die de vertaling blokkeren, is een western blot-analyse de meest betrouwbare test van de werkzaamheid, aangezien het eiwit van belang niet mag worden geproduceerd als gevolg van blokkering van de startplaats van de ATG-vertaling. MO's degraderen hun doel-mRNA niet direct; In plaats daarvan binden ze zich aan specifieke regio's en remmen ze de expressie totdat ze op natuurlijke wijze worden afgebroken. De splice-blokkerende MO's wijzigen echter het pre-mRNA door splice-modificatie te induceren, die kan worden getest door reverse-transcriptase polymerasekettingreactie (RT-PCR) en gelelektroforese.

Drie cruciale onderdelen van het MOs-screeningproces moeten worden gestandaardiseerd: (i) De MO-dosiscurve moet worden afgestemd op fenotypische herkenning. De dosiscurve toont ook de dodelijke dosis 50 (LD50: de dosis waarbij 50% van de geïnjecteerde embryo's sterft) voor elke geteste MO om het vermogen te verbeteren om fenotypische 'signaal' versus off-target 'ruis' te ^{optimaliseren3}. (ii) De fenotyperingsnomenclatuur die werd aangepast, moet goed gedocumenteerd zijn; Een nauwkeurige en gemakkelijk te begrijpen fenotypische beschrijving is van cruciaal belang om uitgebreide uitleg te geven op basis van bestaande literatuur en ervaring van onderzoekers om het delen van informatie te vergemakkelijken tussen degenen die de embryo's niet rechtstreeks hebben onderzocht. (iii) Het hebben van goed gedefinieerde taal maakt het gemakkelijk om centraal gegevens te verzamelen uit Morpholino Database⁸.

In MO-knockdown-onderzoeken voor cardiale genen moeten de hartactiviteit en de dynamiek van de bloedstroom van dieren worden gecontroleerd om de impact van MO-knockdown-experimenten op de functie van het cardiovasculaire systeem te bepalen. Dergelijke analyses vereisen real-time visualisatie van het cardiovasculaire systeem met hoge resolutie. De huid van zebravissen is transparant voor de eerste week van ontwikkeling, waardoor visualisatie van het hart en de bloedcirculatie via microscopie mogelijk is. Voor de beoordeling van de hartfunctie zijn de meest berekende fysiologische parameters hartslag en hartminuutvolume, evenals fractionele verkorting, fractionele gebiedsverandering en ejectiefractie. Bloedstroomsnelheden kunnen worden gemeten door bewegende rode bloedcellen te volgen, en deze metingen worden gebruikt om schuifspanningsniveaus te bepalen, een cruciale mechanobiologische factor op endotheelcellen. Een dergelijke beoordeling vereist het opnemen van time-lapse-films voor kloppend hart en stromend bloed via een omgekeerde of een stereomicroscoop uitgerust met een hogesnelheidscamera.

Dit artikel laat zien hoe je een translationeel-blokkerende morfolino tegen een interessant gen kunt ontwerpen, bereiden en micro-injecteren in de dooier van pas bevruchte zebravisembryo's om de genfunctie uit te schakelen. Het zal ook aantonen dat deze "morfanten" worden gered door co-injectie van mRNA dat codeert voor dit gen. Vervolgens zullen we de werkzaamheid van de morfolino-micro-injecties analyseren door middel van fenotypische karakteriseringen en cardiale structurele en functionele analyses. Deze aanpak zal worden gedemonstreerd op een veel bestudeerd hartgen, hand2.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de geaccepteerde normen voor humane dierenzorg onder de regulering van de IACUC bij QU; dieren werden gehouden in de zebravisfaciliteit onder het Qatar University Biomedical Research Center (QU-BRC). Alle dieren die in deze experimentele studies werden gebruikt, waren jonger dan 3 dagen na de bevruchting (dpf).

OPMERKING: Voor elke experimentele groep is het raadzaam om ten minste 30 embryo's te gebruiken voor statistische nauwkeurigheid. De experimentele groepen zijn als volgt:

Controlegroep: Deze groep omvat embryo's die zonder injecties in eiwater zijn gekweekt. De resultaten vormen hier de basislijn van de controle.

Negatieve controlegroep: Deze groep omvat embryo's die zijn gekweekt in eiwater dat is geïnjecteerd met roerei MO's.

Geïnjecteerde groep: Deze groep omvat embryo's die zijn geïnjecteerd met alleen hand2 MO en hand2 MO met hand2 mRNA om het fenotype te redden. De resultaten hier zullen bevestigen dat waargenomen fenotypes verschenen als gevolg van geïnjecteerde MO's. Vergelijking van experimentele groepen zal het mogelijk maken om de invloed van remming en redding van hand2 op de hartfunctie nauwkeurig te beoordelen.

1. Morpholino-ontwerpen voor hand2.

OPMERKING: MO-sequenties kunnen worden aangepast uit de literatuur ^9,10,11. Als alternatief kunnen deze oligo's online worden ontworpen door Gene-tools. Gene-tools biedt een gratis en snelle online ontwerpservice, die toegankelijk is via hun website¹². Een MO op maat kan eenvoudig worden ontworpen door informatie te verstrekken over de genen die van belang zijn, zoals sequentie-informatie of toetredingsnummers. De volgende specifieke stappen vatten samen hoe MO's tegen hand2 in zebravissen kunnen worden ontworpen:

1. Zoek eerst naar details van het gen van belang in de NCBI-database. Voor hand2, in zebravis¹³.
2. Haal GenBank mRNA-transcriptie-ID op van NCBI¹⁴.
3. Verkrijg de mRNA-sequentie van NCBI¹⁵.
   OPMERKING: Morpholino (MO)-gemodificeerde antisense-oligonucleotiden voor het zebrafish hand2-gen zijn beschikbaar en zijn eerder gepubliceerd. hand2 MO-sequentie ^9,10,11: 5'-CCTCCAACTAAACTCATGGCGACAG-3', MO-sequenties die in het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.
4. Krijg een negatieve controle van een niet-overeenkomende of vervormde MO (vergelijkbare sequenties met willekeurige veranderingen in basenparen) van geninstrumenten¹⁶ die moeten worden geïnjecteerd. Dit zou helpen om de specificiteit van het fenotype of de fenotypes die worden waargenomen bij specifieke MO-injecties te bevestigen en het risico te minimaliseren dat de waargenomen effecten afkomstig zijn van een artefact van de injectieprocedure.

2. Bereiding van morfolino-injectie

1. Voorbereiding van de voorraad
   1. Los MO-voorraden op met ddH₂O; Diethylpyrocarbonaat (DEPC) kan MO's beschadigen en giftig zijn voor embryo's. Gebruik daarom DEPC-vrije ddH₂O. Bij bestelling worden MO's geleverd in een injectieflacon in een concentratie van 300 nM.
      OPMERKING: Hoewel Gene Tools 1 mM stockoplossingen (~8 ng/nL) aanbevelen, kan dit te laag zijn, vooral als de morfolino een hoge dosis vereist of wordt gemengd met andere MO's. Daarom is het ideaal voor het maken van verschillende concentraties MO-voorraadoplossingen (2 of 3 mM).
   2. Bereid een werkoplossing van 0,2 mM door de werkoplossing onder te verdunnen (d.w.z. voor 2 mM bouillon, 1:10 verdunning). Bereid 10 μL werkoplossing door Danieaux-oplossing (7 μL), bouillonmorfolino (1 μL) en fenolrood (2 μL van 10x bouillon) toe te voegen. Fenolrood geeft de oplossing een donkerrode kleur om het geïnjecteerde materiaal in het embryo te helpen traceren.
   3. Bewaar MO's bij kamertemperatuur (RT) in luchtdichte verpakkingen om verdamping te voorkomen. Bewaar MO's niet op ijs op het werkblad, omdat de oplossing kan neerslaan. RT-behandeling is het meest geschikt.
      OPMERKING: Gene Tools beveelt een van de twee opslagmethoden voor MO's aan: De werkoplossing kan worden bewaard bij -20 °C (vele maanden tot jaren) of RT in een afgesloten buis voor langdurige opslag. Als het bij -20 °C wordt bewaard, verwarm de oligonucleotideoplossing dan gedurende 10 minuten bij 65 °C en vortex om de morfolino vóór gebruik volledig op te lossen (het is niet nodig om het op te warmen als het op RT wordt bewaard).
2. In vitro transcriptie van mRNA
   OPMERKING: De in vitro transcriptie werd gebruikt om mRNA van Hand2 te genereren uit Plasmid HAND2 (NM_021973) Human Tagged ORF-kloon die micro-geïnjecteerd moet worden in zebravisembryo's om het fenotype te redden als gevolg van het neerhalen van zebravis HAND2 met behulp van morfolino's, plasmidedetails die in het onderzoek worden gebruikt, worden vermeld in de materiaaltabel.
   1. Lineariseer het plasmide-DNA met een geschikt restrictie-enzym en zuiver met behulp van een DNA-zuiveringskit (Materiaaltabel). Gebruik het gezuiverde gelineariseerde DNA als sjabloon voor in vitro transcriptie om mRNA te genereren voor injectie volgens de instructies van de fabrikant (Materiaalopgave).
   2. Injecteer ten slotte 250 pg humaan mRNA voor het gen van belang om de redding van het fenotype uit te voeren om te testen of het ontbreken van een fenotype inderdaad het gevolg is van het verlies van het zebravisgen door MO.
3. Voorbereiding op injectie
   1. Trek aan een naald met behulp van een micropipettrekker (Materiaaltabel), volg de stappen 2.3.2-2.3.6.
   2. Gebruik capillaire buisjes van 1 mm met filamenten en een micropipettrekker. Zet de machine aan en open het deksel
   3. Draai de modusselectieknop naar NO.2 Heater. Gebruik de NO.2-verwarming om de knop in te stellen om de warmte op 68 °C te brengen
   4. Draai de modusselectieknop terug naar de stand Stap 1 . Gebruik vier gewichten (2 Type Light / 2 Type Heavy)
   5. Plaats het capillair op de houder en sluit het deksel. Druk op de Start-knop om de getrokken naald te pakken.
      OPMERKING: Dit genereert capillaire naalden met een lange conus
   6. Knip de punt van de naalden kort af met een tang. Slijp de punt van de getrokken naald voor gemakkelijke penetratie in zebravisembryo's met behulp van een capillaire afschuiner gedurende ongeveer 30 s, wat resulteert in tips met een diameter van ongeveer 15-25 μm.
   7. Kalibreer de naald om de hoeveelheid injectie te schatten volgens de stappen 2.3.8-2.3.13.
   8. Meng mRNA/morfolino-oplossing kort voordat u deze in de naald laadt om de deeltjes op te lossen die de naald volledig zouden kunnen verstoppen.
   9. Voeg ~3-4 μL MO-oplossing toe aan het achterste deel van de injectienaald met behulp van een pipetpunt met een micronpunt. De injectienaalden zijn voorzien van een kleine sleuf om capillair opvullen te vergemakkelijken.
   10. Controleer of er geen luchtbellen in de injectienaald zitten. Monteer de naald op de micro-injector.
   11. Controleer of de punt van de naald niet verstopt is en of MO-oplossing uit de naald kan stromen door het injectiepedaal in te drukken.
   12. Kalibreer het injectievolume door de druppelgrootte te meten. Steek de punt van de naald in minerale olie op een micrometerdia. Druk het injectiepedaal in en pas de injectiedruk (Eject) (psi) en/of injectietijd (ms) aan totdat de diameter van de uitgestoten druppel 0,1 mm is, wat overeenkomt met 0,5 nL.
   13. Zorg ervoor dat het injectievolume ongeveer 0,5-1 nL is. Pas het volume aan door de injectiedruk (Eject), druk (psi) of tijd (ms) te wijzigen.
   14. Volg voor het installatieprotocol voor de picoliter-injector de stappen 2.3.15-2.3.16
   15. Gebruik picoliter injector voor zebravis injecties. Zet de voedingspomp van de injector aan.
   16. Bereid de injector voor volgens de onderstaande vereisten:
       1. P-balans: Zorg ervoor dat de P-balans rond de 0 ligt. Zorg ervoor dat deze licht negatief is om te voorkomen dat de dooier terugstroomt in de naald en verdun de MO-oplossing in de naald. Omgekeerd, als de tegendruk te hoog is, zal de MO constant uit de naald stromen, zelfs zonder druk op het pedaal uit te oefenen, wat resulteert in variabiliteit en inconsistenties in de geïnjecteerde dosis en de waargenomen fenotypes.
       2. P-injecteren: 20-25 psi is ideaal; Verander dit om het injectievolume aan te passen. Dit kan variëren van 10-30 psi, maar begin met ~20 psi om te controleren of het het gewenste volume levert.
       3. Injectie tijd: Zorg ervoor dat de injectietijd wordt verkort tot 300 ms. Voordat u het injectievolume aanpast, moet u het tijdstip van injectie aanpassen.
   17. Volg voor morfolino-injectie de stappen 2.3.18-2.3.19.
   18. Bereid de injectiekamer als volgt voor: Maak 2% agarose van 0,6 g agarose en 30 ml E3-medium. Giet de agarose in een petrischaaltje en plaats een spuitgietmatrijs op de agarose met behulp van een TU-1 spuitgietmatrijs. Eenmaal afgekoeld in een vriezer, zullen er groeven ontstaan voor het plaatsen en stabiliseren van embryo's (Figuur 1A).
       OPMERKING: Het 60x E3M bouillonoplossing recept bestaat uit 5,0 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,16 mM MgSO_{4,7H 2 O}, 0,4 mM CaCl_{2,2H 2}O in 1 L ddH₂O met een uiteindelijke pH van 7,6.
   19. Breng de verzamelde embryo's over naar de voren met behulp van een transferpipet, verwijder al het overtollige E3-medium rond de embryo's om het zweven van embryo's te voorkomen (Figuur 1B).

3. Injectie van MO- en mRNA-oplossing in de dooier

1. Steek de naald door het chorion, injecteer nabij de grens van de cel/dooier naar de embryozijde en druk het injectiepedaal in (Figuur 1C).
   OPMERKING: De geïnjecteerde MO-oplossing/fenolrood zal niet onmiddellijk in de dooier diffunderen. Er zal een rode vlek in de dooier worden waargenomen die geleidelijk verdwijnt. Het geïnjecteerde materiaal mag niet groter zijn dan 10% van de embryogrootte. MO's kunnen tot in het 8-cellige stadium micro-geïnjecteerd worden in de dooier van pas gelegde zebraviseieren, omdat de MO's gemakkelijk kunnen worden opgenomen in de cytoplasmatische stroom van de dooierzak door de zich ontwikkelende cellen^17,18. Bij injecties met plasmide of afgetopt mRNA moet de injectie worden uitgevoerd in een enkel blastomeer van een embryo in het eencellige stadium.
2. Breng de embryo's over in een petrischaaltje met E3-medium en incubeer ze bij 28 °C tot 3 dpf, met dagelijkse aanvulling van E3-medium. Voer in dat stadium de fenotypische beoordeling uit met behulp van een microscoop.
   OPMERKING: MO-oplossingen moeten voor elk onderzoek zorgvuldig worden verdund om de laagste concentratie vast te stellen die nodig is om een specifiek fenotype te induceren. De embryonale letaliteit voor elke MO's moet ook worden bepaald. Bij hogere concentraties (boven 4-10 ng, afhankelijk van de MO) hebben MO's de neiging om niet-specifieke effecten op te wekken, zoals hersen- of algemene celdood.
3. Co-injecteer MO met 250 pg mRNA van de menselijke hand2 op dezelfde manier om de redding van het fenotype te bevestigen dat wordt veroorzaakt door verlies van het zebravishand2-gen door MO.

4. Western blot om het succes van morpholino knockdown te verifiëren

1. Verzamel de embryo's op specifieke tijdstippen (48 hpf, 72 hpf) en dechorionaat indien nodig met behulp van het Pronase-enzym.
2. Deyolk de embryo's om vitellogenine te verwijderen met behulp van een eerder bekende methodologie¹⁹.
   OPMERKING: Vitellogenin is een fosfolipo-glycoproteïne dat dient als bron van voedingsstoffen voor het groeiende embryo. 2D-gelelektroforese met hoge resolutie en sterk verbeterde western blotting worden mogelijk gemaakt door de embryo's te deyolken en vitellogenine te verwijderen.
3. Voer western blotting uit zoals eerder beschreven²⁰.

5. Beoordeling van de hartstructuur en -functie:

1. Live beeldvorming van zebravissen: Beeldvorming van het ventrikel
   OPMERKING: Verschillende hartfunctie-/hemodynamische parameters kunnen worden berekend door het kloppende hart van zebravisembryo^21,22 te visualiseren. Deze parameters omvatten cardiaal volume (CO), ejectiefractie (EF), slagvolume (SV), fractionele verkorting (FS) en fractionele gebiedsverandering (FAC) (zie eerdere artikelen met gedetailleerde protocollen voor hartfunctiebeoordeling voor zebravisembryo's ^22,23). In de volgende stappen wordt kort uitgelegd hoe die parameters voor zebravisembryo's kunnen worden berekend bij ~3 dpf, een stadium waarin de huid van deze organismen transparant is, waardoor visualisatie met helderveldmicroscopie mogelijk is.
   1. Doe een druppel 3% methylcelluloseoplossing (RT) in de concave putbeelddia.
   2. Plaats het zebravisembryo in het putje met behulp van een geschikte plastic druppelaar (Figuur 2A, B)
      OPMERKING: Als u de put te vol vult, kunnen de vissen uit de put verdringen.
   3. Meng de 3% methylcellulosedruppel voorzichtig met het E3-medium om het uitgekomen embryo te stabiliseren.
      OPMERKING: Om een 3% methylcelluloseoplossing te bereiden, lost u 3 g methylcellulosepoeder op in 100 ml PBS of andere montagemedia in een kolf. Plaats een roermagneet in de kolf van het mengsel en plaats de kolf op een magnetische roerplaat. Zet de snelheid op "laag" en houd deze ~1 dag op 4 °C om alle klonten op te lossen. Zodra de methylcellulose volledig is opgelost, in kleine buisjes verdelen en bij -20 °C bewaren.
   4. Plaats de vis aan de linkerkant, met de rechterkant naar boven en de voorste punt naar links om een eenduidige beeldvorming van het ventrikel te vergemakkelijken (Figuur 2C).
   5. Zoom onder de microscoop in op het embryohart met een vergroting van 100x en begin met opnemen gedurende ~5 s. Zorg ervoor dat de ventrikelranden zich binnen het beeldvormingsvenster bevinden (Figuur 2D).
   6. Neem time-lapse-films op met een hogesnelheidscamera en stereomicroscoop met ongeveer 100 frames per seconde (fps) van het hele embryo (Figuur 2C), kloppend ventrikel (Figuur 2D) en bewegende rode bloedcellen (RBC) in grote bloedvaten, zoals de dorsale aorta of de achterste kardinale ader (Figuur 2E), voor analyse van de hartfunctie.
   7. Sla de film op in de indeling AVI-film of in de indeling TIFF (of JPEG).
2. Bereken de hartslag
   1. Bereken de tijd die nodig is om twee opeenvolgende frames op te nemen. Voor 100 fps is het tijdsinterval gelijk aan 0,01 s.
   2. Kies een bekend punt uit een geregistreerde hartcyclus (d.w.z. einddiastole of eindsystole). Bereken het aantal frames dat nodig is om de cyclus te herhalen.
   3. Vermenigvuldig het tijdsinterval van stap 5.2.1 met het aantal frames van stap 5.2.2. Het resultaat is de tijdsduur (in seconden) voor één hartslag.
   4. Om slagen per minuut te berekenen, deelt u 60 door het getal dat in de vorige stap is verkregen. Voor normale embryo's van 3 dpf moet dit ongeveer 150 bpm (2,5 Hz) zijn.
      OPMERKING: Veel softwaretoepassingen kunnen de hartslag automatisch berekenen op basis van kloppende hartregistraties, zoals ViewPoint²⁴ en DanioVision²⁵.
   5. Analyseer de hartstructuur met behulp van een time-lapse-film met ongeveer 100 fps om het hele hart te controleren op de aanwezigheid van hartoedeem of een ander structureel defect.
      OPMERKING: Figuur 3A toont een normaal embryo-hart van 3 dpf en figuur 3B toont een hart van 3 dpf met hartoedeem en hartlusdefect (langwerpig ventrikel).
3. Bereken de fractionele oppervlakteverandering (FAC):
   OPMERKING: Fractionele gebiedsverandering (FAC) is een parameter die wordt gebruikt om ventriculaire einddiastole- en eindsystolegebieden te vergelijken om de contractiliteit van het ventrikel te beoordelen.
   1. Gebruik een time-lapse-film met ongeveer 100 fps om frames te bepalen die één hartcyclus vertegenwoordigen. Extraheer de kaders die het einde van zowel de eindsystole als de einddiastole laten zien.
   2. Bereken zowel het einddiastolegebied (EDA) als het eindsystolegebied (ESA) met behulp van ImageJ of een vergelijkbare beeldanalysesoftware.
   3. Gebruik de volgende formule om FAC 22,26,27 te berekenen:
      FAC
4. Bereken de fractionele verkorting (FS):
   OPMERKING: Fractionele verkorting (FS) is een andere parameter die wordt gebruikt om de contractiliteit van het ventrikel te evalueren; om FS te bepalen, moeten de einddiastolische en eindsystolische diameters van de ventrikels worden gemeten²¹.
   1. Herhaal stap 5.3.1
   2. Gebruik ImageJ of een ander gelijkwaardig beeldanalyseprogramma om de diameters van de ventriculaire wanden te meten op de punten van de einddiastole_{D d} en de eindsystole D_s . In de meeste gevallen worden diameters met korte assen gebruikt om de fractionele gladheid (FS) te bepalen (Figuur 4).
   3. Gebruik de volgende formule om FS^22,27 te berekenen:
      FS
5. Berekening van het slagvolume (SV):
   OPMERKING: Voor elke hartslag is de SV de hoeveelheid bloed die uit het ventrikel wordt gepompt, die gemakkelijk kan worden berekend uit de einddiastole- en eindsystolevolumes van de ventrikels²⁸.
   1. Herhaal stap 5.3.1 en 5.3.2
   2. Meet de diameters van de einddiastole (D_L) en de eindsystole (_{D S}) zoals weergegeven in afbeelding 4.
      OPMERKING: Ervan uitgaande dat de ventrikels van zebravisharten de vorm hebben van een prolaat sferoïdaal^21,22, wordt het ventrikelvolume berekend met behulp van de volgende formule.
      Volume
      SV kan worden berekend volgens de onderstaande formule²⁷. Het normale SV-bereik is 0,15-0,3 nL voor 2-6 dpf embryo's²⁹. Hier is EDV end-diastole volume en ESV is end-systole volume.
      SV = (EDV - ESV)
6. Bereken de ejectiefractie (EF):
   OPMERKING: EF wordt gedefinieerd als de fractie bloed die bij elke hartslag²⁸ uit het ventrikel wordt uitgestoten.
   1. Extraheer uit de bovenstaande formules EDV en ESV voor de vissen.
   2. Bereken EF als volgt^22,27:
      EF (%)
7. Bereken het hartminuutvolume (CO):
   OPMERKING: CO is het bloedvolume dat door het hart wordt gepompt²⁸. CO heeft een waarde van 10-55 nL/min voor 2-6 dpf embryo's²⁹.
   1. Bereken SV en HR zoals vermeld in de vorige paragrafen 5.5 en 5.2.
   2. Gebruik de volgende formule om CO^22,27 te berekenen:
      CO (nL/min) = SV (nL/maat) x HR (maatstaven/min).
8. Meet de snelheden van de rode bloedcellen:
   OPMERKING: Het bepalen van de celsnelheid is van vitaal belang voor het evalueren van de stroomsnelheid, de diameter van het vat en het berekenen van de schuifspanning die wordt uitgeoefend op de endotheelcellen van het vat (dwz schuifspanning daarentegen is de wrijvingskracht die op de endotheelcellen wordt uitgeoefend door bloed te verplaatsen). Voor embryo's van 2-5 dpf is de gemiddelde snelheid van rode bloedcellen (RBC) ongeveer 300-750 μm/s²⁹. Om de snelheden van de rode bloedcellen te meten:
   1. Zoom onder de microscoop in op de staart van het dier met een vergroting van 100x. De beweging van RBC's zou zichtbaar moeten zijn bij deze vergroting (Figuur 5A, B).
   2. Begin ongeveer 8 s met opnemen. Zorg ervoor dat de dorsale aorta (DA) en de achterste kardinale ader (PCV), de twee belangrijkste axiale slagaders, 100-120 fps binnen het beeldvormingsvenster zijn. Volg individuele cellen uit opeenvolgende frames (Figuur 5A, B).
   3. Extraheer meerdere frames met behulp van ImageJ of een andere vergelijkbare beeldanalysesoftware.
   4. Bereken het verschil in afstand dat een individuele RBC beweegt (Δx).
   5. Bepaal het verschil in tijd tussen de opeenvolgende frames (Δt).
   6. Gebruik de volgende formule voor RBC-snelheid^22,27:
      RBC-snelheid (μm/s)
      OPMERKING: Maximale en gemiddelde snelheid kunnen worden afgeleid uit de herhaling van opeenvolgende frames voor individuele cellen²¹. De snelheid van RBC's vertegenwoordigt ook de snelheid van de bloedstroom. Als alternatief kan een verscheidenheid aan in de handel verkrijgbare softwaretoepassingen worden gebruikt om de snelheid van RBC's automatisch te meten. ViewPoint²⁴ en DanioVision²⁵ hebben dergelijke toepassingen (Afbeelding 5C). Bovendien zijn er weinig beschikbare plug-ins met ImageJ, zoals TrackMate³⁰ en MTrackJ³¹, die compatibel zijn met films die zijn opgenomen met meer dan 100 fps.
9. Berekening van schuifspanning uit gemeten celsnelheden
   Gemeten RBC-snelheden in bloedvaten geven ook de bloedstroomsnelheden weer (Figuur 5C). Bereken op basis van deze metingen de schuifspanning τ in een interessant vat als volgt met Poiseuille Flow-aanname^22,27:
   
   Waarbij V de gemiddelde bloedsnelheid (μm/s) is, μ de bloedviscositeit (dynes/cm²) en D de vaatdiameter (μm). Voor 3 dpf-embryo's is de schuifspanning in DA 22,26,27 ongeveer 4 dynes/cm 2.

Resultaten

De grafiek in figuur 6 illustreert het gemiddelde percentage embryo's dat overleeft bij 24, 48 en 72 hpf voor zowel HAND2-specifieke MO als controle-gecodeerde MO-geïnjecteerde embryo's. De 1 mM (8 ng/μL) en 0,8 mM (6,4 ng/μL) MO-geïnjecteerde embryo's vertoonden een significante vermindering van het overlevingspercentage in vergelijking met controle-gecodeerde MO-geïnjecteerde embryo's. Dit werd waargenomen op elk gemeten tijdstip waarop letaliteit of misvo...

Discussie

Morpholino (MO)-technologie is op grote schaal gebruikt in zebravissen, xenopus, zee-egels en meer recentelijk in celkweekmodelsystemen. Bij de meeste methoden zijn er, naast de voordelen, ook valkuilen waarvan de onderzoeker op de hoogte moet zijn. Een van de grootste valkuilen van MO-technologie is de bezorgdheid dat fenotypische effecten die worden waargenomen door de MO-gemedieerde gen-knockdown-benadering niet te wijten zijn aan het functieverlies dat verband houdt met het primaire ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Acrylamide 40%	Sigma	Sigma, cat. no. C977M88
Agarose	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich cat. no A9539-250G
All Prep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen	Qiagen cat. no. 80204.
alpha Tubulin	Abcam	Abcam- ab4074	Rabbit polyclonal to alpha Tubulin lot GR3 180877-1 (50 kDa)
Ammonium persulfate molecular grade	Sigma	Sigma, cat. no C991U65
BV10 capillary beveller	Sutter Instruments Product	Sutter Instruments Product Catalog # BV10
Chemiluminescence Imaging Gene Gnome	SYNGENE	SYNGENE
Cleaver Scientific Blotting	CVS10D_OmniPAGEMini	CVS10D_OmniPAGEMini
Coomassie	Thermo Fisher	Thermo Fisher cat. no C861C44
Electrochemiluminescence (ECL) kit	Abcam Biochemicals	Abcam Biochemicals cat. no ab65623
Glycine	Sigma	Sigma, cat. no C988U91
Goat anti Rabbit	Abcam	Abcam-  ab6721	Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) 2nd antibodies lot GR3179871-1
HAND2	Gene tools	Custom made for HAND2 (NM_021973)	5'-CCTCCAACTAAACTCATGGCGAC AG-3'
Hand2	Abcam	Abcam- ab10131	Rabbit polyclonal Anti-HAND2 antibody lot GR143200-9 (24- 26 kDa)
HAND2 (NM_021973) Human Tagged ORF Clone	OriGene Technologies, Inc	RC224436L3	Vector: pLenti-C-Myc-DDK-P2A-Puro (PS100092)
IBI DNA/RNA/Protein Extraction Kit	IBI Scientific	IBI Scientific cat. no -r IB47702
Imaging System	iBright	iBright CL1000 Imaging System
Isopropanol	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich cat. no 278475-2L
Laemmli sample loading buffer (4x)	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich cat. no 70607
Mercaptoethanol	Sigma	Sigma, cat. no M6250-1L
Microplate Spectrophotometer with the Gen5 Data Analysis software interface	Epoch	Epoch
Microscope	Ziess SteREO Lumar V12 Flourescence Microscope	Ziess SteREO Lumar V12 Flourescence Microscope
Mineral oil	Fisher Scientific	Fisher Scientific cat. no 0121-1
mMESSAGE mMACHINE T7/T3/SP6 Transcription Kit	Thermo Fisher	Thermo Fisher cat. no.AM1340	for mRNA generation
Nuclease-free water	New England Biolabs	New England Biolabs cat. no B1500L
PC-100 Micropipette Puller	NARISHIGE GROUP Product	NARISHIGE GROUP Product Catalog # PC-100
Phenol red	Sigma	Sigma, cat. no. P-0290
Picolitre Injector	Harvard Apparatus	Harvard Apparatus cataloge # PLI-90A
Pierce Bicinchoninic acid assay (BCA) Protein Assay kit	Thermo Fisher	Thermo Fisher cat. no 23227
PMSF, Protease inhibitor as protease inhibitors	Thermo Fisher	Thermo Fisher cat. no 36978
Ponceau S	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich cat. no 10165921001
Protease Inhibitor Cocktail	Thermo Fisher	Thermo Fisher cat. no 88668
Protein ladder	SMOBiO	SMOBiO cat. no PM2500
Radioimmunoprecipitation Assay (RIPA)	Thermo Fisher	Thermo Fisher cat. no 89900
Ringer’s solution	Thermofisher	Catalog No.S25513
SDS	Sigma	Sigma, cat. no 436143
Standard Control	Gene tools	SKU: PCO-StandardControl-100	5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTAT A-3'- that targets a human beta-globin intron mutation
Stripping buffer	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich cat. 21059
Temed	IBI scientific	IBI scientific cat. no C000A52
Tris Base	Thermo Fisher	Thermo Fisher cat. no BP-152-500
Tween	sigma life science	sigma life science cat. no P2287
Zebra Box Revolution-Danio Track system chamber with the EthoVision XT 11.5 software	Noldus Information Technology, NL	Noldus Information Technology, NL
Zeiss Axiocam ERc 5s	Zeiss	Stemi 508 Zeiss
Zeiss Stemi 2000-C	Zeiss	Stemi 2000-C