Methodenartikel

Longitudinale intravitale microscopie met behulp van een mammabeeldvormingsvenster met vervangbaar deksel

DOI:

10.3791/63326

⸱

20 januari 2022

 ,  ,  , 
1Center for Cancer Biology, VIB (BE), 2Department of Oncology, KU Leuven (BE), 3Netherlands Cancer Institute, Department of Molecular Pathology, Oncode Institute (NL)

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een nieuw mammabeeldvormingsvenster met een vervangbaar deksel (R.MIW). Intravitale microscopie na implantatie van de R.MIW maakt longitudinale en meerdaagse beeldvorming van de gezonde en zieke borstklier mogelijk met een cellulaire resolutie tijdens de verschillende ontwikkelingsstadia.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De vertakte structuur van de borstklier is zeer dynamisch en ondergaat verschillende fasen van groei en remodellering na de geboorte. Intravitale microscopie in combinatie met huidflapchirurgie of implantatie van beeldvormende vensters is gebruikt om de dynamiek van de gezonde borstklier in verschillende ontwikkelingsstadia te bestuderen. De meeste mamma-beeldvormingstechnologieën zijn beperkt tot een tijdsbestek van uren tot dagen, terwijl de meeste borstklierremodelleringsprocessen plaatsvinden in tijdsbestekken van dagen tot weken. Om de remodellering van de borstklier te bestuderen, zijn methoden nodig die optische toegang tot het weefsel van belang voor langere tijdframes mogelijk maken. Hier wordt een verbeterde versie van het titanium borstbeeldvormingsvenster met een vervangbaar deksel (R.MIW) beschreven dat beeldvorming met hoge resolutie van de borstklier met een cellulaire resolutie tot enkele weken mogelijk maakt. Belangrijk is dat de R.MIW weefseltoegang biedt gedurende de gehele duur van het intravitale beeldvormingsexperiment en daarom kan worden gebruikt voor lokale weefselmanipulatie, etikettering, toediening van geneesmiddelen of beeldgeleide microdissectie. Alles bij elkaar maakt de R.MIW karakterisering met hoge resolutie van de cellulaire dynamiek mogelijk tijdens de ontwikkeling van de borstklier, homeostase en ziekte.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het borstepitheel is een uniek secretoir orgaan dat aanwezig is bij zoogdieren, dat melk produceert en afscheidt om nakomelingen te voeden. Gedurende het hele leven ondergaat de borstklier meerdere ontwikkelings- en groeirondes, die gepaard gaan met structurele en functionele veranderingen van het weefsel1. Afhankelijk van het ontwikkelingsstadium zijn de celtypen die bijdragen aan weefselremodellering verschillend, evenals de locatie binnen de ductale boom.

Multifotonen intravitale microscopie (IVM) maakt de studie van de dynamiek van borstcellen in vivo mogelijk in de inheemse en minimaal verstoorde instelling 2,3,4. Om visuele toegang tot de borstklier te verkrijgen, zijn verschillende tijdelijke ex vivo of huidflap beeldvormingstechnieken gepubliceerd tijdens verschillende stadia van de ontwikkeling van de borstklier, waaronder de puberteit 4,5,6,7, volwassenheid 2,8, lactatie 9,10,11,12 en tumordynamica 13,14 ,15. Hoewel deze technieken resulteren in een hoge ruimtelijk en temporeel opgeloste beeldvorming van de dynamiek van borstcellen, is het tijdsbestek beperkt tot uren, terwijl de meeste reconstructieprocessen van de borstklier dagen tot weken duren. Daarom zijn methoden vereist die optische toegang tot het weefsel van belang gedurende langere tijdframes mogelijk maken. In de loop der jaren zijn verschillende permanente beeldvormingsvensters ontwikkeld voor borsttumorbeeldvorming 15,16,17,18, waaronder een titanium mamma-beeldvormingsvenster (MIW)2,3,19. Hoewel zeer nuttig om de groei van borsttumoren te bestuderen, bleef de visualisatie van de gezonde borstklierstructuur beperkt tot een paar dagen. Onlangs is een flexibel siliciumbeeldvormingsvenster ontwikkeld, waarmee de puberale borstklier gedurende meerdere wekenkan worden gevisualiseerd 20. De borstklier is echter ingebed in een adipocytenrijk vetkussen, wat leidt tot uitgebreide lichtverstrooiing en als gevolg daarvan beperkte zichtbaarheid van de borstkanaalstructuren. Daarom zijn te allen tijde superieure beeldvormingsomstandigheden vereist om de weefseldynamiek gedurende langere tijd in de borstklier te visualiseren. Noch de klassieke MIW, noch het flexibele siliciumvenster maken weefselmanipulatie of optimalisatie van de fysieke weefsellocatie mogelijk vóór beeldvorming, omdat het venster een gesloten systeem vormt na chirurgie en implantatie. Als gevolg hiervan zal optimale optische toegang tot het onderliggende borstweefsel waarschijnlijk over langere tijdsperioden worden uitgesloten. Daarentegen zorgt de huidflaptechniek wel voor optimalisatie en herpositionering van het weefsel tijdens de beeldvormingssessie en kan een huidflap meerdere keren worden herhaald2. Herhaalde beeldvormingssessies via een huidflap zijn echter alleen mogelijk wanneer er voldoende tijd (ten minste 7 dagen) tussen de operaties wordt toegewezen om herstel van de huid mogelijk te maken en is daarom meestal geschikt voor studieprocessen op langere tijdschalen. Bovendien is het raadzaam om deze procedure niet vele malen uit te voeren vanwege het invasieve karakter en het grote risico op infecties en littekens bij wondsluiting.

Om deze beperkingen te overwinnen, d.w.z. om gedurende een langere periode optimale beeldvormingsomstandigheden met een hoge frequentie te garanderen en tegelijkertijd weefselmanipulatie mogelijk te maken, werd een verbeterde titaniumversie van de MIW met een vervangbaar deksel (R.MIW) ontworpen om de gezonde en zieke borstklier gedurende meerdere dagen tot week2 te visualiseren (figuur 1A, B). De R.MIW is op maat ontworpen om optimale weefseltoegang te bieden, waardoor directe weefselmanipulatie mogelijk is gedurende de gehele duur van het IVM-experiment en daardoor visualisatie van de borstklier op de juiste tijd en plaats gedurende langere tijd mogelijk is. In gesloten toestand vormt de R.MIW een luchtdicht systeem dat vergelijkbaar is met de klassieke MIW (figuur 1C). Wanneer geopend onder aseptische omstandigheden, maakt de R.MIW lokale weefselmanipulatie mogelijk om de optische toegang te verbeteren en maakt het ook lokale toediening van stoffen mogelijk, zoals pathwayremmers of agonisten, injectie van verschillende celtypen van belang, zoals kankercel- of immuuncelpopulaties, of toevoeging van weefseletiketteringskleurstoffen. Het deksel kan op elk moment tussen de beeldvormingssessies door worden geopend zonder schade aan het onderliggende weefsel te veroorzaken.

figure-introduction-1
Figuur 1: Ontwerp van het borstbeeldvormingsvenster met een vervangbaar deksel. (A) Bovenaanzicht en zijaanzicht van het vervangbare deksel van het borstbeeldvormingsvenster met een 10 mm afdekglas dat op de ring is gelijmd. (B) Bovenaanzicht en zijaanzicht van het borstbeeldvormingsvenster, dat bestaat uit een buitenring en binnenring met een groef ertussen om het venster in de huid van de muis vast te zetten met behulp van een tas-string hechting. De buitenste ring heeft een kleine groef die past op de vier projecties (armen) van het deksel. (C) Cartoon en foto's die de openings- en sluitingsmechanismen van het deksel demonstreren. De schuine projecties zorgen ervoor dat het deksel in het raamkozijn wordt bevestigd. Dit cijfer is aangepast van Messal et al. 2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Dit protocol beschrijft de ontwerp- en implantatieprocedure van de R.MIW, evenals een longitudinale IVM-strategie om dezelfde borstkanalen en hun visualisatie met een cellulaire resolutie opnieuw te bekijken. De R.MIW maakt het mogelijk om celdelingen en morfologische veranderingen tijdens verschillende ontwikkelingsfasen van de borstklier te volgen in diverse fluorescerende reportermuismodellen. Alles bij elkaar vergemakkelijkt de R.MIW de karakterisering van de cellulaire dynamiek met hoge resolutie tijdens de ontwikkeling van de borstklier, homeostase en ziekte.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle in dit document beschreven procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het IACUC en de KU Leuven en werden uitgevoerd in het kader van de goedgekeurde projectaanvraag P160/2020. Voordat u dit protocol uitvoert, moet u de analgesiestrategie met de institutionele dierenarts doornemen en pre- en postoperatieve analgesie toedienen volgens de institutionele richtlijnen.

1. Voorbereiding van de R.MIW (geschatte timing: 2 uur)

OPMERKING: Voor de constructie van de R.MIW is het raadzaam om een lokale fabrikant te vinden die gespecialiseerd is in het werken met harde materialen zoals titanium, omdat dit speciale gereedschappen en expertise vereist. Werkplaatsen die gespecialiseerd zijn in het ontwerp en de productie van titaniumprothesen hebben meestal de machines en expertise om de R.MIW-onderdelen te produceren.

  1. Plaats het deksel van de R.MIW op een steriel oppervlak met de buitenkant van het deksel naar boven gericht (en de armen van het deksel schuin naar beneden; Figuur 1A).
  2. Breng cyanoacrylaatlijm aan rond de hele rand van het deksel en plaats voorzichtig een 10 mm ronde glazen afdekplaat op het deksel.
    OPMERKING: Bereid altijd een reservedeksel voor met een glazen afdeksel als back-up tijdens de chirurgische ingreep.
  3. Gebruik een steriele houten stok om de glazen afdekplaat te positioneren en oefen wat kracht uit om deze naar beneden te duwen om een luchtdichte afdichting tussen de glazen afdekplaat en het frame van het deksel te garanderen. Zorg ervoor dat de gaten in de armen van het deksel niet worden afgedekt door het glas.
  4. Desinfecteer de deksels en de R.MIW door gedurende ten minste 30 minuten onder te dompelen in 80% ethanol in een gesloten petrischaal.
    OPMERKING: Laat de deksels niet langer dan 1 uur in 80% ethanol om het oplossen van de cyanoacrylaatlijmlijm te voorkomen.
  5. Verwijder de overtollige cyanoacrylaatlijm van de glazen afdekplaat met behulp van een katoenen punt gedrenkt in aceton.
  6. Bewaar de deksels en de R.MIW in een steriele omgeving tot verder gebruik.
    LET OP: Het R.MIW frame en deksels zijn maximaal 1 week in een steriele buis of zak te bewaren. Controleer bij het hervatten van het experiment altijd of de glazen afdekplaat nog steeds goed aan het deksel is bevestigd voordat u doorgaat met het protocol.

2. Voorbereiding op de operatie (geschatte timing: 15 min)

OPMERKING: Voor de R.MIW-implantatieprocedure kunnen vrouwelijke muizen (>3,5 weken oud) van elke stam worden gebruikt.

  1. Behoud de steriliteit door steriele handschoenen te gebruiken en steriliseer alle items die in contact komen met de muis. Was chirurgische gereedschappen met water en milde zeep, droog aan de lucht, wikkel in aluminiumfolie zonder blootgestelde hoeken of randen en steriliseer met behulp van een autoclaaf gedurende een cyclus van 20 minuten bij 120 °C voorafgaand aan de operatie.
  2. Bereid een steriel chirurgisch platform voor en steriliseer de oppervlakken met 80% ethanol.
    OPMERKING: Om steriliteit te garanderen, kan de operatie worden uitgevoerd in een stroomkast.
  3. Zet het verwarmingskussen aan en bedek de mat met een steriel gordijn. Plaats de steriele instrumenten op het steriele gordijn en plaats de R.MIW en minimaal twee met glas bedekte deksels in steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in een petrischaaltje (sluit het deksel om externe besmetting te voorkomen).
  4. Verdoof de muis in een inductiekamer met behulp van een 3% isofluraan/O2 mengsel. Zorg ervoor dat het dier ontspannen genoeg is om gemakkelijk te worden gemanipuleerd en zonder enige moeite op het neusmasker te worden overgebracht.
  5. Breng de muis over van de inductiekamer naar een anesthesie neusmasker en verlaag het isofluraangehalte tot 1,5% - 2% isofluraan/O2 mengsel. Controleer de volledige anesthesie door een pootontwenningstest uit te voeren.
  6. Om de pootonttrekkingstest uit te voeren, knijpt u stevig in de dierenpoot met vingernagels of stompe eindtangen. Bij afwezigheid van een spierreflex, beschouw het dier als bewusteloos en ga over tot chirurgische voorbereiding. Voer deze test uit vóór diermanipulatie en herhaal regelmatig tijdens de verdoving en chirurgische procedures om de anesthesie te bevestigen.
  7. Breng oogzalf aan om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen.
  8. Scheer het gebied rond de4e borstklier met een scheermesje (figuur 2A). Gebruik de4e tepel als oriëntatiepunt. Verwijder losse haren met plakband.
    OPMERKING: Als alternatief kan ontharingscrème worden gebruikt om de haren te verwijderen.
  9. Desinfecteer de blootgestelde huid met 80% ethanol of povidon-jodium en plaats de muis in het steriele chirurgische gebied op zijn rug met de snuit in een anesthesieneusmasker met behulp van 1,5% isofluraan / O2-mengsel .
  10. Bevestig de voorste en achterpoten van de muis met papieren tape.
    OPMERKING: Laat de verdoofde en herstellende muis zoveel mogelijk op het verwarmingskussen liggen, tijdens en na de operatie.
  11. Gebruik een voorgesneden steriel chirurgisch gordijn of gaas om de muis te bedekken terwijl het chirurgische gebied bloot blijft.

3. R.MIW implantatie (geschatte timing: 30 min)

  1. Controleer of het dier voldoende verdoofd is door een pootonttrekkingstest uit te voeren. Til de huid voorzichtig op met een fijne Graefe-tang en maak een diagonale incisie van 10-15 mm met een kleine veerschaar in de huid bovenop het4e borstvetkussen met behulp van de4e tepel als oriëntatiepunt (figuur 2A). Zorg ervoor dat u het buikvlies of de borstklier niet snijdt of beschadigt.
  2. Definieer het interessegebied (ROI) op basis van macroscopische kenmerken van het borstweefsel, inclusief de locatie van de lymfeklier of een tumorlaesie, en probeer de ROI centraal te houden met betrekking tot de incisie.
  3. Scheid de huid van het borstvetkussen en de onderliggende weefsellagen met behulp van een stompe dissectie van maximaal 5-8 mm rondom de incisielijn om een zak te creëren die past bij het R.MIW-frame (figuur 2BI).
  4. Pak de R.MIW op met een steriele tang en test of de incisie groot genoeg is om het venster in te brengen. Vergroot indien nodig de incisie enigszins totdat de R.MIW erin past.
  5. Verwijder de R.MIW en plaats een ring-string hechting rondom de incisie met behulp van een 5-0 zijden hechtdraad (gevlochten, niet-resorbeerbaar). Plaats de hechting 1-2 mm van de rand van de incisie van de buitenkant naar de binnenkant van de huid, beginnend bij het caudale uiteinde van de incisie.
  6. Beweeg ongeveer 5 mm omhoog langs de incisie en laat de hechtdraad van binnen naar buiten door de huid lopen. Herhaal deze procedure langs de rand van de incisie, waardoor een cirkelvormige hechting ontstaat die bestaat uit 5-6 lussen (figuur 2BII). De uiteindelijke uitgang van de hechtdraad moet zich op ongeveer 2-5 mm afstand van de eerste ingang bevinden.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u de hechting niet te dicht bij de rand van de incisie plaatst, omdat dit het risico op huidscheur verhoogt. Het plaatsen van de hechting te ver van de rand van de incisie verhoogt het risico op infectie tussen de overtollige huid en de groef van de R.MIW.
  7. Plaats de R.MIW in de incisie en gebruik de Graefe-tang om de huid voorzichtig in de groef van de R.MIW te plaatsen. Zorg ervoor dat u de lussen van de hechting buiten laat.
  8. Trek aan de lussen van de tas-snaar hechting en span de hechting in de groef van de R.MIW aan door voorzichtig aan beide uiteinden van de hechtdraad te trekken (figuur 2BIII). Knoop af met chirurgische knopen en knip de overtollige draad weg.
  9. Breng vaseline aan op de binnenrand van de R.MIW met behulp van een tandenstoker, terwijl u ervoor zorgt dat het onderliggende weefsel wordt vermeden. Duw het raamkozijn voorzichtig naar beneden met een steriele tang of twee vingertoppen en plaats het deksel in het R.MIW-frame (figuur 1B). Dit voorkomt een hoeveelheid lucht tussen het borstklierweefsel en het R.MIW-deksel.
  10. Plaats de uiteinden van een dunne tang door de gaten in de armen van het deksel en draai het deksel vast door het deksel met de klok mee te draaien (ongeveer 5°) (figuur 1C en figuur 2BIV).
  11. Als er wat lucht achterblijft na het aandraaien van het R.MIW-deksel, gebruik dan een steriele insulinenaald om de overtollige lucht te verwijderen. Breng de naald door de huid in de holte tussen het borstweefsel en het deksel en trek langzaam de zuiger eruit, waardoor een vacuüm ontstaat tussen het borstklierweefsel en het R.MIW-deksel.
  12. Dien na de operatie analgesie toe, zoals buprenorfine (0,1 mg/kg verdund in steriele 0,9% NaCl) door subcutane injectie. Herhaal subcutane injectie met buprenorfine na 8 uur en 16 uur na de operatie.
  13. Plaats de muis terug in de kooi om te herstellen en nauwlettend te controleren totdat hij volledig wakker is, of ga verder met stap 4 voor onmiddellijke beeldvorming.
  14. Controleer in dit postoperatieve stadium de muizen nauwlettend op tekenen van ongemak of complicaties op basis van vitale parameters, zoals ademhaling, reactiviteit, gedrag, houding en lichaamsgewicht. Controleer de huid rond het venster zorgvuldig op tekenen van ontsteking en necrose. Als er geen complicaties optreden, zal de R.MIW herhaalde IVM-sessies mogelijk maken gedurende enkele weken na implantatie.

figure-protocol-1
Figuur 2: Overzicht van de chirurgische ingreep en raamimplantatie. (A) Een diagonale incisie wordt gemaakt in de buurt van de4e tepel van een vrouwelijke muis en de huid en het onderliggende weefsel worden losgekoppeld door stompe dissectie. (B) De inguinale lymfeklier en vorm van het vetkussen kunnen worden gebruikt voor de juiste oriëntatie van het weefsel (I). Een tas-string hechting wordt in de huid rond de incisie (II) geplaatst en na het plaatsen van het raamkozijn wordt de hechting in de groef aangespannen om het raamkozijn vast te zetten en beveiligd door chirurgische knopen (III). De laatste stap is het inbrengen en vergrendelen van het deksel in het raamkozijn (IV). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Herhaalde intravitale microscopie via de R.MIW

OPMERKING: De herhaalde IVM-strategie die hier wordt beschreven, is geoptimaliseerd voor een omgekeerd multifotonen confocaal systeem uitgerust met een gemotoriseerd podium en een donkere klimaatkamer bij 35,8 °C.

  1. Verdoof de muis in een inductiekamer met behulp van een 3% isofluraan/O2 mengsel. Controleer het bewustzijnsverlies door een pootonttrekkingstest uit te voeren (beschreven in stap 2.6). Breng oogzalf aan om uitdroging van het hoornvlies tijdens de beeldvormingssessie te voorkomen.
  2. Inspecteer de staat van het R.MIW-frame en deksel, inclusief de stabiliteit van de hechtingen of mogelijke schade aan het deksel. In geval van schade aan het deksel kan het deksel worden vervangen zoals beschreven in stap 5.
  3. Breng de muis over naar een voorverwarmde (37 °C), op maat gemaakte beeldbuis (figuur 3A) en plaats de muis met de kop in de neuskegel. De imaging box bestaat uit een frame dat past binnen het geautomatiseerde stadium van de microscoop. Het frame is ontworpen om een op maat gemaakte inlay te houden met een gat met de diameter van de R.MIW (figuur 3A).
  4. Een inlaat met een neuskegel is verbonden met de voorkant van de doos en bevestigd aan een isofluraan vaporizer station met behulp van 2% -3% isofluraan / O2 mengsel. Een uitlaat is aangesloten op een anestheticum opruimingseenheid om de circulatie te garanderen en ophoping van isofluraan in de doos te voorkomen. De beeldvormende doos kan worden gesloten met behulp van een transparant deksel.
  5. Plaats de muis op de inlay zodanig dat de R.MIW in het gat van de inlay van de beelddoos valt (figuur 3A). Breng parafilm en papieren tape aan op de achterkant van de muis om de muis te stabiliseren en de beweging van het weefsel als gevolg van ademhaling te verminderen.
  6. Sluit de beeldvormende doos met het deksel en plaats de afbeeldingsdoos in het stadium van de microscoop.
  7. Verlaag de dosis isofluraan geleidelijk in de loop van de beeldvormingssessie om een stabiele, maar oppervlakkige anesthesie te behouden (meestal tussen 1,5% -0,8% isofluraan / O2-mengsel ).
  8. Zorg voor de juiste voeding tijdens de beeldvorming zoals hieronder beschreven.
    1. Voor beeldvormingssessies <3 uur, injecteer de muis subcutaan met 200-300 μL steriel PBS voor hydratatie.
    2. Voor beeldvormingssessies >3 uur volgt u de onderstaande stappen.
      1. Voor beeldvorming op lange termijn, infundeer de muis met voedingsstoffen. Gebruik hiervoor een in de handel verkrijgbaar steriel infuse mengsel dat aminozuren en glucose bevat. Plaats een flexibele naald subcutaan in de nek van de muis en bevestig deze met papieren tape.
      2. Bevestig een spuit van 10 ml met de bereide voedingsmix aan een flexibele siliconenbuis en duw de voedingsmix door totdat deze het einde van de buis heeft bereikt.
      3. Sluit de siliconen buis aan op de flexibele naald. Neem het uiteinde van de buis en plaats deze door een van de gaten van de beeldvormende doos (van binnen naar buiten, waarbij de naaldbevestigingszijde in de doos blijft).
      4. Injecteer elke 30 min 50 μL infuse-oplossing.
  9. Bevestig de beelddoos in het stadium van de microscoop en definieer het interessegebied met behulp van de epifluorescentiemodus van de microscoop.
  10. Pas de gewenste microscoopinstellingen toe, afhankelijk van het muismodel (figuur 3B). Vaatstructuren, collageenpatronen (gevisualiseerd door de tweede harmonische generatie) en andere stabiele anatomische structuren, waaronder de inguinale lymfeklier, kunnen als oriëntatiepunten worden gebruikt. Verkrijg beelden met behulp van een omgekeerde multifoton confocale microscoop op een 12-bits diepte en een 25x waterobjectief met behulp van een Z-stapgrootte variërend van 1,0 tot 4,0 μm (totale z-stack variërend van 150 tot 800 μm). Pas de volgende standaardinstellingen toe: 1024 x 1024-indeling, 600 Hz scansnelheid, bidirectionele modus.
  11. Visualiseer collageen I-vezels door een tweede harmonische generatie uit te voeren met behulp van een excitatiegolflengte van 860 nm en detectie bij 425-435 nm. Excitatie- en detectiegolflengten voor de verschillende fluoroforen zijn aangegeven in tabel 1.

Tabel 1. Klik hier om deze tabel te downloaden.

  1. Gebruik de spiral-functie in de navigatormodus van de beeldvormingssoftware om een groot overzicht te genereren om een referentiekaart van het weefsel te maken (figuur 3B). Definieer de ROI's in het spiraaloverzicht, definieer de bovenste en onderste Z-vlakken om de Z-stack te bepalen. Druk op Start om gedetailleerde driedimensionale (xyz) of vierdimensionale Z-stacks (xyzt) van het weefsel te verkrijgen.
    OPMERKING: Tijdens het gehele beeldvormingsexperiment moet de muis nauwlettend in de gaten worden gehouden. Voor lange beeldvormingssessies worden een pulsoximeter en temperatuursonde aanbevolen. De ademhaling van de muis moet regelmatig en in hetzelfde tempo zijn. Als de muis tekenen van hijgen begint te vertonen, moet de hoeveelheid isofluraan worden verminderd.
  2. Houd aan het einde van elke beeldvormingssessie de muis op een verwarmingskussen totdat hij volledig wakker is. Als de muis tekenen van ongemak of verminderde mobiliteit vertoont, houd de kooi dan langer op het verwarmingskussen en zorg voor voedingsgels in plaats van de gewone chow.
    OPMERKING: Tussen de beeldvormingssessies door moet de muis nauwlettend worden gecontroleerd op tekenen van ongemak, zoals verminderde voedsel- en waterconsumptie, snelle ademhaling, verminderde beweging, tremor, abnormale lichaamshouding of een niet-gebroken vacht. In geval van duidelijke tekenen van ongemak, volg de institutionele richtlijnen met betrekking tot dierenwelzijn en beëindig het experiment wanneer het humane eindpunt is bereikt.
  3. Herhaal stap 4.1-4.12 voor elke herhaalde beeldvormingssessie en gebruik de overzichtstegelscan om dezelfde positie(s) over meerdere tijdstippen te volgen (figuur 3B). De frequentie van beeldvorming is afhankelijk van de onderzoeksvraag en de timing van het bestudeerde proces en varieert meestal van beeldvormingssessies twee keer per dag tot één keer per week.
  4. Aan het einde van de gewenste experimentele periode, euthanaseer de dieren met een geïmplanteerde R.MIW met behulp van diepe anesthesie met isofluraan gevolgd door cervicale dislocatie. Ontleed desgewenst de organen van belang voor verdere ex vivo analyses.
  5. U kunt het dier ook in leven houden voor toekomstige in vivo analyses. Verwijder in dat geval de buidelbevestiging die de R.MIW vasthoudt door deze met een veerschaar te knippen en maak de raamring voorzichtig los van de muizenhuid met een stompe tang. Reinig de randen van de huid die eerder het venster vasthielden en ga verder met een eenvoudige continue hechting (absorbeerbaar materiaal, zoals polyglycolzuur).
  6. Zodra de huid gesloten is, bindt u de begin- en eindnaaddraden met twee vierkante knopen (4 worpen). Om weefselischemie te minimaliseren, moeten de knopen los genoeg zijn om de bloedstroom aan de huidrand mogelijk te maken. Desinfecteer de wond met povidon-jodium om ontstekingen te voorkomen en de genezing van de huid te bevorderen.

figure-protocol-2
Figuur 3: Longitudinale IVM-workflow. (A) Schematische weergave van een typisch meerdaags IVM-experiment. (B) Beeldvorming van een tumorigen gebied in de volwassen borstklier. Voorafgaand aan elke beeldvormingssessie kan een overzichtstablet met lage resolutie (bovenpaneel) de identificatie van de regio('s) van belang in de daaropvolgende beeldvormingsdagen vergemakkelijken. Het collageen I-patroon (tweede harmonische generatie, magenta), weefselstructuur en patronen van differentieel gelabelde cellen met fluorescerende eiwitten (afgebeeld in groen, geel en rood) kunnen worden gebruikt om hetzelfde weefselgebied te traceren. Schaalbalken vertegenwoordigen 1 mm (overzichtstegelscan) en 100 μm (onderste panelen). (C) Schematische weergave van de R26-Confetti reporter constructie. Bij tamoxifen-geïnduceerde Cre-recombinatie recombineert het confetticonstruct stochastisch, wat resulteert in de expressie van een van de vier fluoroforen (nGFP, YFP, RFP of mCFP). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. Het openen en sluiten van het deksel van de R.MIW tussen de beeldvormingssessies door

  1. Behoud de steriliteit door steriele handschoenen te gebruiken en steriliseer alle items die in contact komen met de muis. Autoclaaf chirurgische hulpmiddelen voorafgaand aan de operatie (zie stap 2 voor details).
  2. Zet het verwarmingskussen aan en bedek de mat met een steriel gordijn en verdoof de muis in een inductiekamer met een mengsel van 3% isofluraan/O2 . Controleer voldoende anesthesie door een pootonttrekkingsreflextest uit te voeren.
  3. Breng de muis over van de inductiekamer naar een anesthesie neusmasker en verlaag het isofluraangehalte tot 1,5% -2% isofluraan / O2 mengsel.
  4. Plaats de uiteinden van een dunne tang door de gaten in de armen van het deksel en maak het deksel los door het deksel tegen de klok in te draaien. Breng indien nodig wat voorverwarmd steriel PBS (37 °C) aan op het raam om het losmaken van het deksel te vergemakkelijken.
  5. Plaats het deksel van de R.MIW in een steriele schaal met steriel PBS tot verder gebruik. Reinig de coverglas van het deksel met demi-water en vervolgens 80% ethanol. Bewaar het deksel in steriel PBS tot verder gebruik.
  6. Voorkom dat het blootgestelde weefsel uitdroogt door enkele druppels steriel PBS aan het weefseloppervlak toe te voegen.
  7. Breng een stof of cellen van belang aan op het blootgestelde weefsel, een maximaal volume van 50 μL kan worden gebruikt. Wacht een paar minuten totdat de vloeistof door het weefsel is opgenomen. Als alternatief kan het weefsel worden gemanipuleerd of geherpositioneerd met behulp van steriele, stompe tangen om de beeldvormingsomstandigheden voor specifieke ROI's te optimaliseren.
  8. Breng vaseline aan op de binnenrand van de R.MIW en zorg ervoor dat u het onderliggende weefsel vermijdt. Plaats het deksel in het R.MIW-frame zoals beschreven in stap 3.9, plaats de uiteinden van een dunne tang door de gaten in de armen van het deksel en draai het deksel vast door het deksel met de klok mee te draaien (ongeveer 5°).

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de proliferatieve dynamiek van borstepitheelcellen tijdens de verschillende ontwikkelingsstadia van de borstklier te bestuderen, werd het beschreven protocol uitgevoerd. Het ontwerp van de R.MIW is afgebeeld in figuur 1 en de procedure om een R.MIW te implanteren is samengevat in figuur 2. De R.MIW wordt chirurgisch geïmplanteerd tussen de borstklier en de huid. Een hechting wordt gebruikt om binnen de raamring te houden en te voorkomen dat de muizen aan de hechtingen trekken (figuur 2). De hechtingen die de R.MIW vasthouden, zijn gemaakt van niet-absorbeerbare zijde, die hypoallergene eigenschappen heeft, een zachte textuur heeft en gemakkelijk te hanteren is. De R.MIW-ring is gemaakt van titanium, een van de meest biocompatibele materialen die geen ontsteking of necrose bevorderen na implantatie21. Als de aseptische aandoeningen worden gevolgd en de hechtingen goed worden uitgevoerd, vormt de R.MIW borstklierimplantatie een laag risico op postoperatieve complicaties. Bovendien is R.MIW-implantatie, in tegenstelling tot abdominale beeldvormingsvensterimplantatie22, geen beperkende factor voor de overleving van muizen, omdat de borstklier geen vitaal orgaan is en dagelijkse beeldvorming mogelijk maakt tot de limiet die is gespecificeerd in het ethische protocol. De enige factor die de duur van de vensterimplantatie beperkt, is de homeostatische omzet van de huid, die er uiteindelijk toe zal leiden dat de hechtingen na 4 - 6 weken uitvallen. Daarom is het belangrijk om de stabiliteit van de hechtingen regelmatig te inspecteren. Indien gewenst kunnen de hechtingen worden verwijderd en vervangen door een nieuwe tas-string hechting onder aseptische omstandigheden (zoals beschreven in stappen 3.5 - 3.8) om de stabiliteit van het venster te garanderen.

Een grote uitdaging bij het gebruik van de meerdaagse beeldvormingsbenadering is het traceren van een ROI op opeenvolgende dagen. Hiertoe kan een snelle overzichtsscan worden opgenomen voordat de ROI('s) worden geselecteerd (figuur 3B). Meerdere weefseloriëntatiepunten kunnen worden gebruikt om hetzelfde gebied van het weefsel te traceren, inclusief het collageennetwerksignaal (gevisualiseerd door de tweede harmonische generatie), weefselstructuur, evenals lokale patronen van cellen differentieel of stochastisch gelabeld met kleurstoffen of fluorescerende eiwitten (figuur 3B). In dit representatieve voorbeeld werd een R.MIW geïmplanteerd op de 4e borstklier van een MMTV-PyMT; R26-CreERT2het; R26-Confettide vrouwelijke muis bij het begin van palpabele tumorvorming. Vervolgens werd stochastische recombinatie geïnduceerd door injectie van 1,5 mg tamoxifen, wat resulteerde in recombinatie van het confetticonstruct in sommige cellen (figuur 3C). De gerecombineerde tumorcellen werden gedurende een periode van 20 dagen gevolgd (figuur 3B,C). Als beeldvorming van hetzelfde gebied van de borstklier gedurende opeenvolgende dagen is uitgesloten, kan het venster worden geopend in een aseptische omgeving (zoals beschreven in stap 5.1) om verder op te helderen en het weefsel te herpositioneren om de zichtbaarheid en beeldacquisitie te verbeteren (figuur 3A).

Met behulp van deze methode werd de zich ontwikkelende borstklier tijdens de puberteit gevolgd op het niveau van één cel. Herhaalde IVM via een R.MIW werd uitgevoerd met behulp van R26-CreERT2het; R26-mTmGde vrouwelijke muizen tussen de 4-6 weken oud, waarbij alle cellen zijn gelabeld met membraan tdTomato (figuur 4A)23. Muizen werden geïnjecteerd met een lage dosis tamoxifen (0,2 mg/25 g lichaamsgewicht), wat resulteerde in sporadische recombinatie van het mTmG-construct, waardoor sommige cellen in alle weefsels, inclusief de borstklier, een verandering van rood naar groen veroorzaakten (figuur 4B). Dezelfde ROI's werden gedurende meerdere dagen opnieuw bezocht om morfologische veranderingen in de borstklier te visualiseren, waaronder ductale elongatie en ductale vertakking (figuur 4C) met een cellulaire resolutie. Belangrijk is dat deze combinatie van stochastische celetikettering en meerdaagse IVM het ook mogelijk maakt om de dynamische veranderingen van de ductale omgeving te visualiseren, zoals de dynamiek van afzonderlijke cellen in het stroma rond de langwerpige en vertakkende kanalen (figuur 4D) en de cellulaire dynamiek binnen de inguinale lymfeklier (figuur 4E).

figure-results-1
Figuur 4: Meerdaagse IVM van puberale vertakkende morfogenese. (A) Puberale R26-CreERT2; R26-mTmG-muizen in de leeftijd tussen 4-6 weken werden geïnjecteerd met een lage dosis tamoxifen, wat leidde tot Cre-gemedieerde recombinatie van het R26-mTmG-allel en werden op dag 1, 3 en 5 in beeld gebracht om de dynamische veranderingen in de zich ontwikkelende borstklier te volgen. (B) Schematische weergave van het R26-mTmG muisconstruct , dat in niet-gerecombineerde omstandigheden resulteert in alomtegenwoordige expressie van membraan tdTomato (mT). Bij Cre-gemedieerde recombinatie wordt mT geschakeld voor membraan eGFP (mG) expressie. (C) 3D-weergave van een langwerpig en vertakkend borstkanaal gedurende meerdere dagen, afgebeeld via een R.MIW in een R26-CreERT2; R26-mTmG vrouwelijke muis op de leeftijd van 6 weken. (D) Enkele Z-vlak afbeeldingen van de vertakkende punt (bovenste panelen) en de langwerpige tak (onderste panelen). mT wordt weergegeven in rood en mG in cyaan, schaalbalken vertegenwoordigen 100 μm (A en B). Afzonderlijke cellen in het stroma worden gemarkeerd door witte sterretjes. Merk op dat de signaalintensiteit handmatig werd verhoogd om de afzonderlijke cellen in het stroma te markeren, wat leidde tot een enigszins overbelicht uiterlijk van de borstepitheelcellen. (E) Representatieve beelden van de inguinale lymfeklier van een R26-CreERT2; R26-mTmG vrouwelijke muis afgebeeld via een R.MIW, met een overzicht tegelscan (linkerpaneel), zoomafbeeldingen (rechterpanelen) van een enkel Z-vlak (boven) en een 3D-rendering (onder). Tweede harmonische generatie (collageen I) wordt weergegeven in groen, mT in rood en mG in cyaan. Schaalbalken vertegenwoordigen 500 μm (overzichtstegelscan) en 100 μm (zoomafbeeldingen). Figuurpanelen C en D zijn gewijzigd van Messal et al. 2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Evenzo maakt de voorgestelde R.MIW-benadering in de volwassen borstklier visualisatie van dezelfde ductale structuren gedurende meerdere dagen mogelijk met compromisloze zichtbaarheid. Zelfs het gebruik van minder heldere fluorescerende reportermodellen24, zoals het Cdh1-mCFP (Ecadherin-mCFP) muismodel, maakt visualisatie van ductale stabiliteit en subtiele morfologische veranderingen bij een cellulaire resolutie mogelijk (figuur 5). Merk op dat het zicht tussen dag 3 en dag 5 aanzienlijk verbeterde na weefselherpositionering (figuur 5).

figure-results-2
Figuur 5: Meerdaagse beeldvorming van de volwassen borstklier. 3D gerenderde beelden van een borst ductale structuur van een volwassen vrouwelijke Cdh1-mCFP (cyaan, het markeren van de Ecadherine-positieve luminale cellen expressie) muis over meerdere opeenvolgende dagen. Het collageen I-patroon (tweede harmonische generatie, magenta) werd gebruikt om dezelfde ROI te traceren en het Cdh1-mCFP-signaal werd gebruikt om de ductale (luminale) cellen te markeren. Merk op dat het zicht na dag 3 werd verbeterd door het openen van het R.MIW-deksel en het herpositioneren van het weefsel. Schaalbalken vertegenwoordigen 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Om de proliferatieve heterogeniteit van de borstepitheelcellen tijdens de hormonale cyclus op eencellig niveau te beoordelen, werd de foto-converteerbare Kikume Green-Red (KikGR) reporter muis model25,26 gebruikt, die alomtegenwoordige expressie van het KikGR-eiwit heeft. KikGR is een heldere fluorofoor die groen-rode omzetting ondergaat bij blootstelling aan violet licht en de rood/groene verhouding kan worden gebruikt als proxy voor de proliferatieve activiteit van een cel2 (figuur 6A,B). Met behulp van de R.MIW-benadering volgden we dezelfde cellen in de ductale boom van de volwassen borstklier gedurende meerdere dagen en vonden we eerder onverwachte proliferatieve heterogeniteit in de ductale boom (figuur 6C). Hoge en lage proliferatieve cellen waren gelijk verdeeld over de verschillende geconverteerde gebieden (figuur 6C,D). Opvallend is dat op lokaal niveau naburige cellen grote verschillen vertoonden in hun rood/groen verhouding (figuur 6C,D). Kwantificering van de rood/groene verhouding van verschillende cellen (als proxy voor hun proliferatieve activiteit) 10 dagen na fotoconversie, onthulde zeer variabele verdunningssnelheden van sommige cellen binnen dezelfde ductale micro-omgeving (figuur 6E). Samen onthullen deze gegevens een opmerkelijke lokale proliferatieve heterogeniteit binnen de volwassen borstklier en tegelijkertijd een wereldwijde uniforme omloopsnelheid.

figure-results-3
Figuur 6: Longitudinale IVM van proliferatieve heterogeniteit in de volwassen borstklier met behulp van het KikGR-muismodel. (A) KikGR-muizen werden afgebeeld op dag 0 voor en na blootstelling aan violet licht. De beeldvormingssessies werden herhaald op dag 2, 6 en 10 na conversie. (B) Schematische weergave van de hypothetische uitkomsten bij fotoconversie van KikGR-borstepitheelcellen na proliferatie (linkerpaneel) en geen proliferatie (rechterpaneel) als functie van de tijd. (C) Hetzelfde gebied van de borstklier werd in beeld gebracht door middel van een R.MIW gedurende een periode van 10 dagen. Kleinere regio's werden op dag 0 met foto's geconverteerd en vertonen een vergelijkbare verdunningssnelheid van het Kikume-rode signaal in de loop van de tijd, wat wijst op een gelijke omloopsnelheid in het epitheel. (D) Zoombeelden (enkele Z-vlakken) van de aangegeven gebieden in paneel C tonen proliferatieve heterogeniteit op cellulair niveau 6 en 10 dagen na fotoconversie. Schaalstaven vertegenwoordigen 100 μm (paneel C) en 10 μm (paneel D). (E) Kwantificering van de rood/groene verhouding van willekeurig geselecteerde cellen (n = 48 cellen) in drie foto-geconverteerde gebieden. Een hoge rood/groen-verhouding wijst op een lage verdunningssnelheid en een lage proliferatieve activiteit, terwijl een lage rood/groen-verhouding wijst op een hoge verdunningssnelheid en proliferatie. Figuurpanelen C- E zijn aangepast van Messal et al. 2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De R.MIW maakt longitudinale beeldvorming van de gezonde en zieke borstklier in zijn oorspronkelijke en minimaal verstoorde omgeving mogelijk en maakt herhaalde visualisatie van de borstklier in verschillende ontwikkelingsstadia mogelijk. Het R.MIW-ontwerp maakt het mogelijk om het venster op elk moment tijdens het experiment te openen. Langdurige visuele toegang tot het weefsel van belang kan bijvoorbeeld worden belemmerd door de ophoping van celresten op de coverslip. In dergelijke gevallen kan de R.MIW voor of onmiddellijk na een beeldvormingssessie worden geopend om het volledige zichtbare weefselgebied en deksel te reinigen. Het verwijderbare deksel maakt ook manipulaties van het weefsel mogelijk, evenals lokale toepassing van stoffen, zoals specifieke remmers en therapieën, etiketteringskleurstoffen of specifieke celtypen van belang.

Deze methode overwint de beperking van de eerder beschreven huidflapprocedures bij de borst 4,7,8,13, die beperkt zijn tot één beeldvormingssessie, en kan processen visualiseren zoals vertakkende morfogenese (figuur 5), homeostatische weefselvernieuwing (figuur 6) of tumorgroei op cellulair niveau (figuur 3B). ). Maar tegelijkertijd maakt de R.MIW lokale manipulatie van het weefsel tussen beeldvormingssessies mogelijk, wat een grote troef van de R.MIW omvat in vergelijking met de eerder gepubliceerde MIW 3,18 en alle andere beeldvormingsvensters20,22. Bij het openen van de R.MIW is het belangrijk om te allen tijde aseptische omstandigheden te handhaven om elke bron van infectie te voorkomen. De mogelijkheid om de R.MIW in een aseptische omgeving te openen, maakt het mogelijk om de beeldvormingsomstandigheden voorafgaand aan elke beeldvormingssessie te optimaliseren, wat de visuele toegang op lange termijn tot het weefsel van belang aanzienlijk verbetert. Specifiek in de borstklier, die is ingebed in een adipocytenrijk stroma, is dit van grote waarde. Bovendien zou het vervangbare deksel op unieke wijze de lokale toediening van therapeutica, verschillende celtypen, etiketteringskleurstoffen, beeldgeleide microdissectie of andere lokale manipulatie van het weefsel mogelijk kunnen maken zonder dat het IVM-experiment hoeft te worden beëindigd. Om bijvoorbeeld tumorinitiatie te bestuderen, kunnen specifieke kankercelpopulaties rechtstreeks in de ductale boom of stroma worden geïnjecteerd op een bepaald IVM-tijdstip en een precieze borstklierlocatie, zolang deze ROI toegankelijk is via de R.MIW-ring. Om tumorprogressie te bestuderen, kunnen specifieke kankercelpopulaties (op een specifieke locatie, in een specifieke micro-omgeving of met een specifiek gedrag) tijdens de IVM-sessie worden gefotografeerd en vervolgens worden gemicrodisseceerd met behulp van een fluorescerende dissectiemicroscoop na de opening van de R.MIW. Geïsoleerde cellen kunnen verder worden verwerkt voor downstream analyses, zoals (single-cell) mRNA sequencing. Door deze benadering te gebruiken, zou men in vivo celgedrag kunnen koppelen aan moleculaire expressieprofielen. Het voordeel van lokale toediening van geneesmiddelen, mogelijk gemaakt door de R.MIW, maakt het mogelijk om het weefsel voorafgaand aan en direct na de behandeling in beeld te brengen. Het interval dat nodig is om de muis uit de beeldvormingsdoos te verwijderen en vervolgens lokale toediening van geneesmiddelen uit te voeren na het openen van het R.MIW-deksel, kan binnen enkele minuten worden uitgevoerd, waardoor de onmiddellijke faseopname van snelwerkende geneesmiddelen mogelijk is.

We laten zien dat IVM van de borstklier via de R.MIW compatibel is met veel verschillende fluorescerende reportermuismodellen. De vetrijke omgeving is een uitdaging om in beeld te brengen en daarom wordt het gebruik van heldere fluoroforen aanbevolen. Zoals hier echter wordt getoond, kunnen zelfs minder heldere fluoroforen zoals mCFP door de R.MIW worden gevisualiseerd in optimale beeldvormingsomstandigheden. Onvermijdelijk zal het vetkussen de beeldvorming van de diepere ductale structuren uitsluiten en de beeldvorming beperken tot de meer oppervlakkige kanalen. Een overzichtsbeeld met lage resolutie aan het begin van elk IVM-experiment zal helpen om de ductale structuren van belang te identificeren die voldoende oppervlakkig zijn voor beeldvorming met hoge resolutie. Lokale weefselmanipulatie, verwijdering van bindweefsel of herpositionering van het vetweefsel na het openen van de R.MIW kan de IVM optimaliseren voor specifieke ROI's die worden bedekt door vetweefsel. Dit is een belangrijk voordeel ten opzichte van alle eerdere raamontwerpen, die het niet mogelijk maken om deze manipulaties uit te voeren en volledige verwijdering van het raam zelf vereisen. Specifiek voor visualisatie van de inguinale lymfeklier wordt aanbevolen om het bovenliggende vetweefsel voorzichtig te verwijderen, wat lichtverstrooiing vermindert en beeldvorming met hoge resolutie mogelijk maakt. Houd bij het manipuleren van het weefsel altijd aseptische omstandigheden aan en voorkom bloedingen of ernstige schade aan het weefsel, omdat deze de processen kunnen beïnvloeden die tijdens het IVM-experiment worden bestudeerd.

De R.MIW is gemaakt van titanium, een materiaal dat in de klinische praktijk vaak wordt gebruikt om harde weefsels zoals gewrichten of botplaten te vervangen. Titanium heeft verschillende voordelen ten opzichte van stalen ramen, waaronder het lichte en inerte karakter21. Onlangs werden verschillende andere materialen gebruikt om nieuwe beeldvormende venstertypen te genereren, waaronder het flexibele siliciumvenster20. In tegenstelling tot de R.MIW heeft het flexibele venster geen hechtingen nodig voor implantatie en is het geschikt voor bijna elke anatomische positie, met name in het geval van zachte en fragiele weefsels. Siliciumvensters hebben een minimale impact op de beweeglijkheid van dieren vanwege hun lichtgewicht en vervormbare aard en zijn misschien meer geschikt voor experimenten die snelle weefselexpansie en -groei bestuderen20. Een ander voordeel ten opzichte van de titanium versie is dat siliciumvensters compatibel zijn met andere beeldvormingsmodaliteiten, waaronder magnetische resonantie beeldvorming20,27. Het is echter belangrijk om in gedachten te houden dat doelstellingen zijn geoptimaliseerd voor 0,17 mm glazen afdekplaten. Bovendien is borstweefsel gevoelig voor ademhalingsbewegingen, die moeilijk te beperken zijn met behulp van het flexibele venster, vooral bij gebruik van een omgekeerde microscoop. Ademende artefacten worden geminimaliseerd door het R.MIW-ontwerp en de fixatie van de R.MIW in de inlay van de beelddoos. Als gevolg hiervan worden beelden die zijn verkregen met behulp van de voorgestelde R.MIW-opstelling niet vervormd als gevolg van ademende artefacten. Er kunnen echter kleine afwijkingen in weefsellokalisatie optreden, die meestal geleidelijk zijn en kunnen worden gecorrigeerd met behulp van post-acquisitie bewegingscorrectiesoftware28. Met de toenemende toolbox van IVM-technologieën 2,20, zullen de specifieke vereisten voor elk experiment uiteindelijk de beste manier bepalen om het weefsel van belang in vivo te visualiseren. Verschillende raamontwerpen hebben verschillende voor- en nadelen en afhankelijk van de onderzoeksvraag, de beschikbare microscopie-opstelling, de vereiste ruimtelijke en temporele resolutie en de totale tijdspanne van het bestudeerde proces, moet de optimale aanpak worden bepaald.

Samenvattend vergemakkelijkt de R.MIW karakterisering met hoge resolutie van de cellulaire dynamiek tijdens de ontwikkeling van de borstklier, homeostase en ziekte gedurende meerdere dagen tot weken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door het Fonds Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (Doctoraatsbeurs fundamenteel onderzoek 11L7222N tot M.C.), de Boehringer Ingelheim Stichting (PhD Fellowship aan C.L.G.J.S), een EMBO postdoctoraal mandaat (schenk ALTF 1035-2020 aan C.L.G.J.S.), en de Doctor Josef Steiner Award (aan J.v.R).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.9% NaClBD306573Andere merken beschikbaar
10 mm ronde dekglasFisher scientific10696365Andere merken beschikbaar
5-0 gevlochten zijden hechtdraadEthiconW580
80% EthanolzelfgemaaktNA
Anesthesie-inductieboxKentscientificVetFlo-MSEKIT
Buprenorfine (Vetergesic®)EcupharNA
Katoenen punten (sterieel)Fisher scientific13113743Andere merken beschikbaar
CyanoacrylaatlijmLoctiteNAAndere merken beschikbaar
OogzalfDuratearsNA
Flexibele vlindernaaldGreiner Bio-One450120Andere merken beschikbaar
Graefe-tang (bot)Fine Science Tools11051-10
VerwarmingskussenKentscientificRightTemp Jr.Andere merken beschikbaar
BeeldvormingsboxOp maat gemaaktNA
Voedingsmengsel infuserenBraunNutriflex speciaal 70/240
Insuline-spruitjesBD324911Andere merken beschikbaar
Omgekeerde multifotonenmicroscoop met geautomatiseerde stageLeica MicrosystemsNA
IsofluraandampverdamperKentscientificVetFlo-1231K
NadelhouderFine Science Tools12510-14
ParafilmSigma-AldrichP7793semi-transparant tape
Papiertape tesaTesaNA
VaselinVaselineNA
ScheermesjesFisher scientific11904325Andere merken beschikbaar
Siliconen buisSolutions ElastomeresNAElk huishoudartikel
Voetjesschaar (klein)Fine Science Tools15018-10
Steriele PBSThermoFisher Scientific10010023
Spuit (10 ml)BD305482Andere merken beschikbaar
Dunne tangFine Science Tools11413-11
Titanium deksel voor mammabeeldvormingsvensterOp maat gemaaktNA
Titanium mammabeeldvormingsvensterOp maat gemaaktNA
HoutstokjesFisher scientificNC1678836Andere merken beschikbaar

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Watson, C. J., Khaled, W. T. Mammary development in the embryo and adult: new insights into the journey of morphogenesis and commitment. Development. 147 (22), Cambridge, England. (2020).
  2. Messal, H. A., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J. An Intravital Microscopy Toolbox to Study Mammary Gland Dynamics from Cellular Level to Organ Scale. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 26 (1), 9-27 (2021).
  3. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  4. Dawson, C. A., Mueller, S. N., Lindeman, G. J., Rios, A. C., Visvader, J. E. Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue. Nature Protocols. 16 (4), 1907-1935 (2021).
  5. Scheele, C. L., et al. Identity and dynamics of mammary stem cells during branching morphogenesis. Nature. 542 (7641), 313-317 (2017).
  6. Kotsuma, M., et al. Nondestructive, serial in vivo imaging of a tissue-flap using a tissue adhesion barrier. IntraVital. 1 (1), 69-76 (2012).
  7. Ingman, W. V., Wyckoff, J., Gouon-Evans, V., Condeelis, J., Pollard, J. W. Macrophages promote collagen fibrillogenesis around terminal end buds of the developing mammary gland. Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 235 (12), 3222-3229 (2006).
  8. Entenberg, D., et al. large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods (San Diego, Calif). 128, 65-77 (2017).
  9. Masedunskas, A., Weigert, R., Mather, I. H. Intravital Imaging of the Lactating Mammary Gland in Transgenic Mice Expressing Fluorescent Proteins. Advances in Intravital Microscopy. , Springer. Netherlands. 187-204 (2014).
  10. Masedunskas, A., Chen, Y., Stussman, R., Weigert, R., Mather, I. H. Kinetics of milk lipid droplet transport, growth, and secretion revealed by intravital imaging: lipid droplet release is intermittently stimulated by oxytocin. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 935-946 (2017).
  11. Mather, I. H., Masedunskas, A., Chen, Y., Weigert, R. Symposium review: Intravital imaging of the lactating mammary gland in live mice reveals novel aspects of milk-lipid secretion. Journal of Dairy Science. 102 (3), 2760-2782 (2019).
  12. Stevenson, A. J., et al. Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally mature mammary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (43), 26822-26832 (2020).
  13. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of Mice for Long-Term Intravital Imaging of the Mammary Gland. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562(2011).
  14. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of Vital Signs for Long-Term Survival of Mice under Anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563(2011).
  15. Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54042(2016).
  16. Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2+ mammary cancer. Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).
  17. Sobolik, T., et al. Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging. IntraVital. 5 (1), 1125562(2016).
  18. Shan, S., Sorg, B., Dewhirst, M. W. A novel rodent mammary window of orthotopic breast cancer for intravital microscopy. Microvascular Research. 65 (2), 109-117 (2003).
  19. Zomer, A., et al. Intravital imaging of cancer stem cell plasticity in mammary tumors. Stem Cells. 31 (3), 602-606 (2013).
  20. Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).
  21. Niinomi, M. Recent research and development in titanium alloys for biomedical applications and healthcare goods. Science and Technology of Advanced Materials. 4 (5), 445-454 (2003).
  22. Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
  23. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, N., Luo, L. A global double-fluorescent cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), New York, N.Y. 593-605 (2007).
  24. Snippert, H. J., et al. Intestinal Crypt Homeostasis Results from Neutral Competition between Symmetrically Dividing Lgr5 Stem Cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
  25. Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos. BMC Developmental Biology. 9, 49(2009).
  26. Kurotaki, Y., Hatta, K., Nakao, K., Nabeshima, Y. I., Fujimori, T. Blastocyst Axis Is Specified Independently of Early Cell Lineage But Aligns with the ZP Shape. Science. 316 (5825), New York, N.Y. 719-723 (2007).
  27. Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818(2016).
  28. Warren, S. C., et al. Removing physiological motion from Intravital and clinical functional imaging data. eLife. 7, 35800(2018).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Longitudinale beeldvormingremodellering van de melkklierweefselmanipulatiehoge resolutie beeldvormingtumorprogressiesingle cell beeldvormingmelkklier van de muis

Gerelateerde artikelen