Methodenartikel

Het meten van eigenschappen van het membraan periodieke skelet van het Axon Initial Segment met behulp van 3D-gestructureerde verlichting microscopie (3D-SIM)

DOI:

10.3791/63327

⸱

11 februari 2022

 ,  , 
1Minerva Foundation Institute for Medical Research, 2Department of Computer Science, Aalto University School of Science, 3HiLIFE - Neuroscience Center, University of Helsinki, 4HiLIFE - Institute of Biotechnology, University of Helsinki

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het huidige protocol beschrijft een methode om actineringen en andere componenten van het periodieke membraanskelet van het axoninitiële segment te visualiseren en te meten met behulp van gekweekte hippocampale neuronen van ratten en 3D-gestructureerde verlichtingsmicroscopie (3D-SIM).

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het axoninitiesegment (AIS) is de plaats waar actiepotentialen initiëren en vormt een transportfilter en diffusiebarrière die bijdragen aan het behoud van neuronale polariteit door somato-dendritische lading te sorteren. Een membraan periodiek skelet (MPS) bestaande uit periodieke actineringen biedt een steiger voor het verankeren van verschillende AIS-eiwitten, waaronder structurele eiwitten en verschillende ionkanalen. Hoewel recente proteomische benaderingen een aanzienlijk aantal nieuwe AIS-componenten hebben geïdentificeerd, ontbreken details over de structuur van de MPS en de rollen van de afzonderlijke componenten ervan. De afstand tussen individuele actineringen in de MPS (~ 190 nm) vereist het gebruik van superresolutiemicroscopietechnieken om de structurele details van de MPS op te lossen. Dit protocol beschrijft een methode voor het gebruik van gekweekte hippocampusneuronen van ratten om de precieze lokalisatie van een AIS-eiwit in de MPS ten opzichte van sub-vliezige actineringen te onderzoeken met behulp van 3D-gestructureerde verlichtingsmicroscopie (3D-SIM). Daarnaast wordt ook een analytische benadering beschreven om de periodiciteit van individuele componenten en hun positie ten opzichte van actineringen kwantitatief te beoordelen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het axon initial segment (AIS) is een kort, uniek gespecialiseerd gebied van het proximale axon van gewervelde neuronen1. De AIS omvat een transportfilter en diffusiebarrière die essentieel zijn voor het behoud van neuronale polariteit door somato-dendritische lading te sorteren2,3,4,5,6,7. Bovendien maakt de unieke structuur van het AIS het mogelijk om clusters van spanningsafhankelijke ionkanalen te huisvesten die zijn functie als de plaats van actiepotentiaalinitiatie vergemakkelijken8. Een zeer stabiel structureel complex ligt ten grondslag aan de unieke functies van het AIS. Onderzoek in het afgelopen decennium heeft de aanwezigheid aangetoond van een membraan periodiek skelet (MPS) met actineringen verbonden door spectrine en een steiger voor het verankeren van verschillende AIS-eiwitten9,10.

De afstand tussen actineringen in de MPS (~190 nm)9,10 ligt onder de resolutiegrens van conventionele lichtmicroscopie. Vroege pogingen om elektronenmicroscopie te gebruiken om de MPS te visualiseren waren niet succesvol, omdat de zware voorbereidingsprocedures die ermee gepaard gingen, de structuur van de MPS niet konden behouden. Superresolutiemicroscopietechnieken zijn dus van onschatbare waarde gebleken bij het ophelderen van enkele van de structurele details van de MPS11. Het begrip van het structurele AIS-complex, de identiteit en functies van de componenten en de spatiotemporele regulatie zijn echter nog steeds onvolledig. Recente proteomische studies zijn erin geslaagd om een aanzienlijke lijst van eiwitten te creëren die zich lokaliseren naar de AIS dicht bij structurele componenten van de AIS12,13. Toch ontbreken details over hun functie en precieze plaats in het AIS-complex. Superresolutiemicroscopietechnieken dienen dus als een essentieel hulpmiddel om de nauwkeurige posities van deze eiwitten ten opzichte van andere MPS-componenten te onderzoeken en hun functies te onderzoeken. Verschillende lichtmicroscopietechnieken kunnen resoluties bereiken die hoger zijn dan de diffractielimiet van licht, sommige zelfs in staat om afzonderlijke moleculen te lokaliseren. Veel van deze technieken vereisen echter meestal gespecialiseerde fluoroforen of beeldbuffers en beeldacquisitie is vaak tijdsintensief14.

3D-gestructureerde verlichtingsmicroscopie (3D-SIM), vanwege het gebruiksgemak en de eenvoudige vereisten voor monstervoorbereiding, vereist geen speciale reagentia voor beeldvorming of monstervoorbereiding, werkt goed met een breed scala aan fluoroforen en monsters, kan gemakkelijk in meerdere kleuren worden geïmplementeerd en is in staat tot live-cell imaging15. Hoewel de best mogelijke resolutie die SIM biedt (~ 120 nm) laag is in vergelijking met veel andere superresolutietechnieken, is het voldoende voor veel toepassingen (bijvoorbeeld voor het oplossen van de componenten van de MPS in neuronen). Het is dus van cruciaal belang om rekening te houden met de vereiste voor specifieke toepassingen om te bepalen of SIM een geschikte keuze is of dat een nog hogere resolutie nodig is. Hier wordt een protocol beschreven voor het gebruik van gekweekte hippocampusneuronen en 3D-gestructureerde verlichtingsmicroscopie (3D-SIM) om de positie en organisatie van vermeende AIS-eiwitten ten opzichte van actineringen in de MPS te onderzoeken, zoals geïmplementeerd in Abouelezz et al.16

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Primaire hippocampusneuronen die in deze experimenten werden gebruikt, werden geoogst16 van embryonale dag 17 Wistar-rattenembryo's van beide geslachten onder de ethische richtlijnen van de Universiteit van Helsinki en de Finse wet.

1. Monstervoorbereiding

  1. Laat op high-fidelity glazen coverslips de hippocampusneuronen van ratten groeien in schaarse kweekomstandigheden (~ 5.000-10.000 cellen / cm2) gedurende 14 dagen (14 dagen-in-vitro).
    OPMERKING: Het gebruik van schaarse culturen vermindert de kans op overlappende neurieten, wat helpt bij het kwantificeren van de MPS.
  2. Fix neuronen met behulp van 4% paraformaldehyde gedurende 12 minuten bij kamertemperatuur. Was de coverslip eenmaal in 0,2% BSA in PBS (BSA-PBS) en incubeer vervolgens gedurende 10 minuten in een 1% oplossing van Triton-X in PBS bij kamertemperatuur. Eenmaal wassen in BSA-PBS.
  3. Verdun anti-ankyrine G-antilichamen (1:200) in BSA-PBS. Voeg antilichaamoplossing toe aan de coverslip en incubeer een nacht bij 4 °C. Voeg eventueel anti-MAP2-antilichamen (zie Tabel met materialen) toe aan de antilichaamoplossing om het somato-dendritische domein af te bakenen.
  4. Was cellen eenmaal in BSA-PBS, gevolgd door 0,1% Triton-X in PBS en doe vervolgens een laatste wasbeurt in BSA-PBS.
  5. Verdun fluorofoor-gelabelde antimuis secundaire antilichamen (1:200) (zie Tabel met materialen) in BSA-PBS, voeg toe aan de coverslip en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Was de cellen eenmaal in BSA-PBS, eenmaal in 0,1% Triton-X in PBS en eenmaal in PBS.
  6. Bereid een 1 μM-oplossing van gelabeld falloïdine in PBS (zie Materiaaltabel) en voeg deze toe aan de cellen. Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Was cellen eenmaal in PBS, eenmaal in 0,1% Triton-X in PBS en eenmaal in PBS.
    OPMERKING: AlexaFluor488-gelabelde falloïdeïne werd hier gebruikt, maar andere tags zullen ook werken.
  7. Voor het monteren van de coverslip op een glazen dia, breng een druppel montagemedium aan op een glasplaat, dompel de coverslip in gedeïoniseerd water en dep met een zachte papieren handdoek (om overtollig water te verwijderen).
    1. Plaats de dekplaat op de glasplaat. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 24 uur.
      OPMERKING: Er werden geen nadelige effecten op het monster waargenomen met behulp van hard-setting montagemedia (brekingsindex 1,47 na uitharding).

2. Beeldvorming

  1. Raadpleeg indien mogelijk het personeel van de microscopiefaciliteit voordat u een beeld afbeeldt. Gebruik een dompeloliecalculator (zie Tabel met materialen) om de dompelolie te selecteren die geschikt is voor het monster.
  2. Zodra de monsters klaar zijn, moet u ervoor zorgen dat de coverslips schoon zijn en vrij van eventuele resten of overtollige montagemedia. Gebruik indien nodig een wattenstaafje gedoopt in water of ethanol om schoon te maken. Plaats het monster in een microscoop die geschikt is voor 3D SIM (zie Materiaaltabel) en zoek een cel om in beeld te brengen.
  3. Pas het vermogen van de relevante laserlijnen en de belichtingstijden aan om de signaal-ruisverhouding te maximaliseren zonder het monster aanzienlijk te bleken.
    OPMERKING: Een goede signaal-ruisverhouding toont een duidelijk rasterachtig uiterlijk gericht op het monster en leidt tot nauwkeurige reconstructies met hoge resolutie. 488 nm en 640 nm laserlijnen werden gebruikt om respectievelijk F-actine en ankyrine G te visualiseren.
  4. Stel de boven- en ondergrenzen van het monster in de z-dimensie in en ga verder met het verkrijgen van een stapel.
    OPMERKING: hier werd een z-stapgrootte van 125 nm gebruikt.
  5. Voor een succesvolle SIM-reconstructie moet u ervoor zorgen dat de microscopiesoftware (zie Materiaaltabel) een optisch overdrachtsbestand (OTF) heeft dat geschikt is voor de gebruikte kleurstoffen.
    OPMERKING: Deze worden meestal gemaakt en onderhouden door gespecialiseerd personeel. Bij gebrek aan een functionele OTF zijn er ook open-source tools beschikbaar om reconstructies uit te voeren op basis van schattingen17. In dit werk werden up-to-date OTF-bestanden gebruikt die werden beheerd door gespecialiseerd personeel.
  6. Voer het reconstructiealgoritme op de stapel uit om een superopgeloste reconstructie te verkrijgen. Controleer de reconstructies op bekende artefacten en pas indien nodig de parameters aan om ze te corrigeren.
    OPMERKING: De standaard algoritmeparameters geven meestal nauwkeurige resultaten. Veel van deze artefacten omvatten enkele herhalende patronen: gestreepte lijnen samen met meerdere richtingen op één z-vlak, 'ghosting' (herhaalde kenmerken die in verschillende z-vlakken verschijnen), of een zeshoekig 'honingraat'-patroon dat in sommige gebieden opduikt. Deze artefacten kunnen vaak worden opgelost met een betere monstervoorbereiding, een betere signaal-ruisverhouding, het aanpassen van de parameters van het reconstructiealgoritme of ervoor zorgen dat de brekingsindex van de gekozen dompelolie geschikt is voor het montagemedium en monster. Voor een meer gedetailleerde bespreking van SIM-artefacten en een vrij beschikbare tool om te controleren op de aanwezigheid van artefacten, zie Ball et al. 18
  7. Vergelijk de SIM-reconstructie met een grootveldbeeld om verbeteringen in de resolutie te zien.
  8. Gebruik bij het uitvoeren van meerkleurige SIM het uitlijningsalgoritme om de verschillende kanalen correct uit te lijnen zodra een bevredigende reconstructie klaar is.
    OPMERKING: Het uitlijningsalgoritme maakt gebruik van een uitlijningsreferentiebestand dat is gegenereerd met behulp van een microsfeerparelpreparaat volgens de instructies van de microscoopfabrikant.

3. Beeldanalyse

  1. Actineringen in de MPS hebben een onderscheidend periodiek uiterlijk. Maak met behulp van beeldanalysesoftware (zie Tabel met materialen) een projectiebeeld met maximale intensiteit met behulp van alle brandpuntsvlakken waar actineringen zichtbaar zijn.
  2. Teken op het projectiebeeld met maximale intensiteit een loodrechte lijn over zichtbare aangrenzende ringen en noteer de fluorescentie-intensiteit samen met de lijn 'Plot Profile'-functie van de software.
  3. Om de gemiddelde interpiekafstand te berekenen, noteert u de lokale maxima in het lijnprofiel en meet u de afstand tussen individuele aangrenzende fluorescentie-intensiteitspieken.
    OPMERKING: Dit kan eenvoudig worden berekend, bijvoorbeeld met behulp van de 'findpeaks'-functie in MATLAB of het (open-source) GNU Octave-platform.
  4. Om de colocalisatie van verschillende eiwitten met actineringen in de MPS te evalueren, voert u een colocalisatieanalyseprocedure19,20,21 uit op SIM-reconstructies van actine en het kandidaat-eiwit. Teken handmatig een selectie om de AIS te definiëren als een regio van belang voor de EzColocalization-plug-in in het softwareplatform19 en voer de analyse uit om de Pearson-correlatiecoëfficiënt (PCC) van co-lokalisatie19,20,21 te berekenen. Een PCC-waarde in de buurt van 1 duidt op een sterke colocalisatie.
    OPMERKING: Dit protocol is samengevat in figuur 1.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van gekweekte hippocampusneuronen van ratten en 3D-SIM wordt een protocol beschreven om actineringen en andere componenten van de MPS in de AIS te visualiseren en te meten. Reconstructies van beeldstapels toonden een duidelijke periodiciteit van actineringen (figuur 2A). In onze handen was de gemiddelde inter-piekafstand van actineringen in de MPS, gevisualiseerd met Alexa 488-gelabelde falloïdine, 190,36 ± 1,7 nm (gemiddelde ± SEM). Dit is in lijn met de eerder gerapporteerde gem...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het hier beschreven protocol biedt een methode voor het visualiseren en meten van MPS-eiwitten met behulp van de superresolutietechniek. Aangezien actineringen en andere MPS-componenten een periodiciteit van ~190 nm9,10 vertonen, kunnen conventionele diffractiebeperkte beeldvormingsbenaderingen de details van de MPS niet onthullen. Verschillende microscopie-opstellingen kunnen diffractie-beperkte structuren in superresolutie oplossen, en SIM vertegenwoordigt een ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Pirta Hotulainen wordt erkend voor haar kritische opmerkingen, van onschatbare waarde voor het voorbereiden van dit manuscript. Dr. Rimante Minkeviciene wordt erkend voor haar hulp bij het voorbereiden van de neuronale culturen die werden gebruikt voor de oorspronkelijke experimenten. Alle beeldvorming werd uitgevoerd in de Biomedicum Imaging Unit. Dit werk werd ondersteund door de Academy of Finland (D.M., SA 266351) en doctoraatsprogramma Brain & Mind (A.A.)

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
24-well platesCorning3524
4% Paraformaldehyde
Alexa-488 PhalloidinThermoFisherA12379
Alexa-647 anti-mouseThermoFisherA31571
Anti-Ankyrin G antibodyUC Davis/NIH NeuroMab Facility, Clone 106/3675-146
Anti-MAP2 antibodyMerck MilliporeAB5543
B-27Invitrogen17504044
Bovine Serum Albumin (BSA)BioWestP6154
Deltavision OMX SRGE Healthcare Life SciencesN/A
Fiji softwarepakketImageJ
GNU OctaveGNU
Hoge prestaties dekselsMarienfeld117530
Immersion Oil CalculatorCytiva Life Scienceshttps://tinyurl.com/ImmersionOilCalculator
L-GlutamineVWRICNA1680149
MATLAB R2020aMathworks
Neurobasal mediaInvitrogen21103049
OMX SRDelta Vision OMX
PrimocinInvivoGenant-pm-1
ProLong Gold montagemediaInvitrogenP10144
softWoRx DeconvolutionCytiva Life Sciences
Superfrost SlidesEprediaISO 8037/1
TetraSpeck microspheres 0.1 µmThermoFisherT7279
Triton-XSigmaX100

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Leterrier, C. The Axon initial segment, 50 years later: A nexus for neuronal organization and function. Current Topics in Membranes. 77, 185-233 (2016).
  2. Leterrier, C., Dargent, B. No pasaran! Role of the axon initial segment in the regulation of protein transport and the maintenance of axonal identity. Seminars in Cell & Developmental Biology. 27, 44-51 (2014).
  3. Brachet, A., et al. Ankyrin G restricts ion channel diffusion at the axonal initial segment before the establishment of the diffusion barrier. Journal of Cell Biology. 191 (2), 383-395 (2010).
  4. Nakada, C., et al. Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization. Nature Cell Biology. 5 (7), 626-632 (2003).
  5. Song, A. H., et al. A selective filter for cytoplasmic transport at the axon initial segment. Cell. 136 (6), 1148-1160 (2009).
  6. Sun, X., et al. Selective filtering defect at the axon initial segment in Alzheimer's disease mouse models. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (39), 14271-14276 (2014).
  7. Winckler, B., Forscher, P., Mellman, I. A diffusion barrier maintains distribution of membrane proteins in polarized neurons. Nature. 397 (6721), 698-701 (1999).
  8. Kole, M. H., et al. Action potential generation requires a high sodium channel density in the axon initial segment. Nature Neuroscience. 11 (2), 178-186 (2008).
  9. Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. Actin, spectrin, and associated proteins form a periodic cytoskeletal structure in axons. Science. 339 (6118), 452-456 (2013).
  10. Leterrier, C., et al. Nanoscale architecture of the axon initial segment reveals an organized and robust scaffold. Cell Reports. 13 (12), 2781-2793 (2015).
  11. Leterrier, C. The axon initial segment: An updated viewpoint. The Journal of Neuroscience. 38 (9), 2135-2145 (2018).
  12. Hamdan, H., et al. Mapping axon initial segment structure and function by multiplexed proximity biotinylation. Nature Communications. 11 (1), 100(2020).
  13. Zhou, R., et al. Proteomic and functional analyses of the periodic membrane skeleton in neurons. bioRxiv. , (2020).
  14. Valli, J., et al. Seeing beyond the limit: A guide to choosing the right super-resolution microscopy technique. Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100791(2021).
  15. Wang, T., et al. Radial contractility of actomyosin rings facilitates axonal trafficking and structural stability. Journal of Cell Biology. 219 (5), 201902001(2020).
  16. Abouelezz, A., Stefen, H., Segerstråle, M., Micinski, D., Minkeviciene, R., Lahti, L., Hardeman, E., Gunning, P., Hoogenraad, C., Taira, T., Fath, T., Hotulainen, P. Tropomyosin Tpm3.1 is required to maintain the structure and function of the axon initial segment. iScience. 23 (5), 101053(2020).
  17. Muller, M., Monkemoller, V., Hennig, S., Hubner, W., Huser, T. Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ. Nature Communications. 7, 10980(2016).
  18. Ball, G., et al. SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy. Scientific Reports. 5, 15915(2015).
  19. Stauffer, W., Sheng, H., Lim, H. N. EzColocalization: An ImageJ plugin for visualizing and measuring colocalization in cells and organisms. Scientific Reports. 8 (1), 15764(2018).
  20. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).
  21. Lahti, L. Data analysis supplement to the research article Abouelezz, Stefen, Segerstråle, Micinski, Minkeviciene, Lahti, Hardeman, Gunning, Hoogenraad, Taira, Fath, & Hotulainen. Tropomyosin Tpm3.1 Is Required to Maintain the Structure and Function of the Axon Initial Segment. , (2021).
  22. Abouelezz, A., Micinski, D., Lipponen, A., Hotulainen, P. Sub-membranous actin rings in the axon initial segment are resistant to the action of latrunculin. Journal of Biological Chemistry. 400 (9), 1141-1146 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Membrane Periodic SkeletonAxon Initial SegmentStructured Illumination MicroscopyActin RingsSuper Resolution MicroscopyProtein ColocalizationHippocampal NeuronsFluorescence MicroscopyAnkyrin GPearson Correlation

Gerelateerde artikelen