Snelle inkapseling van gereconstitueerd cytoskelet in gigantische unilamellaire blaasjes

Summary

Dit artikel introduceert een eenvoudige methode voor snelle productie van gigantische unilamellaire blaasjes met ingekapselde cytoskeletale eiwitten. De methode blijkt nuttig te zijn voor bottom-up reconstitutie van cytoskeletstructuren in opsluiting en cytoskelet-membraaninteracties.

Abstract

Gigantische unilamellaire blaasjes (GUVs) worden vaak gebruikt als modellen van biologische membranen en zijn dus een geweldig hulpmiddel om membraangerelateerde cellulaire processen in vitro te bestuderen. In de afgelopen jaren is inkapseling binnen GUV's een nuttige benadering gebleken voor reconstitutie-experimenten in celbiologie en aanverwante gebieden. Het bootst beter de opsluitingsomstandigheden in levende cellen na, in tegenstelling tot conventionele biochemische reconstitutie. Methoden voor inkapseling in GUVs zijn vaak niet eenvoudig te implementeren en slagingspercentages kunnen aanzienlijk verschillen van laboratorium tot laboratorium. Een techniek die succesvol is gebleken voor het inkapselen van complexere eiwitsystemen wordt continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) genoemd. Hier wordt een op cDICE gebaseerde methode gepresenteerd voor het snel inkapselen van cytoskeletale eiwitten in GUVs met een hoge inkapselingsefficiëntie. In deze methode worden eerst lipide-monolaagdruppels gegenereerd door een eiwitoplossing te emulgeren die van belang is in een lipide / oliemengsel. Nadat ze zijn toegevoegd aan een roterende 3D-geprinte kamer, gaan deze lipide-monolagige druppels vervolgens door een tweede lipide monolaag op een water / olie-interface in de kamer om GUVs te vormen die het eiwitsysteem bevatten. Deze methode vereenvoudigt de algemene procedure van inkapseling binnen GUV's en versnelt het proces, en stelt ons dus in staat om de dynamische evolutie van netwerkassemblage in lipide bilayer blaasjes te beperken en te observeren. Dit platform is handig voor het bestuderen van de mechanica van cytoskelet-membraaninteracties in opsluiting.

Introduction

Lipide dubbellaagse compartimenten worden gebruikt als model synthetische cellen voor het bestuderen van ingesloten organische reacties en op membraan gebaseerde processen of als dragermodules in toepassingen voor medicijnafgifte ^1,2. Bottom-up biologie met gezuiverde componenten vereist minimale experimentele systemen om eigenschappen en interacties tussen biomoleculen, zoals eiwitten en lipiden, te onderzoeken ^3,4. Met de vooruitgang van het veld is er echter een toegenomen behoefte aan complexere experimentele systemen die de omstandigheden in biolo....

Protocol

1. Bereiding van olie-lipidenmengsel

OPMERKING: De stap moet worden uitgevoerd in een zuurkast volgens alle veiligheidsrichtlijnen voor het hanteren van chloroform.

1. Neem 0,5 ml chloroform in een glazen injectieflacon van 15 ml. Voeg 88 μL 25 mg/ml dioleoylfosfocholine (DOPC), 9,3 μL 50 mg/ml cholesterol en 5 μL 1 mg/ml dioleoyl-fosfoethanolamine-lissamine rhodamine B (rhodamine PE) (zie Materiaaltabel) toe aan de glazen injectieflacon van 15 ml.
   OPMERKING: De uiteindelijke molfracties van DOPC en cholesterol in siliconenolie / minerale olie zijn respectievelijk 69,9% en 30%. Er werd vastgesteld....

Results

Om de succesvolle generatie van cytoskeletale GUVs met behulp van het huidige protocol aan te tonen, werden fascin-actinebundelstructuren in GUV's gereconstitueerd. Fascin is een korte crosslinker van actinefilamenten die stijve parallel uitgelijnde actinebundels vormt en wordt gezuiverd van E. coli als glutathion-S-Transferase (GST) fusie-eiwit²⁶. 5 μM actine werd voor het eerst gereconstitueerd, inclusief 0,53 μM ATTO488 actine in de actinepolymerisatiebuffer en 7,5% van het dichtheidsg.......

Discussion

Verschillende methoden voor het genereren van GUVs zijn onderzocht voor de creatie van synthetische cellen De complexiteit van de procedures, de langere tijd om inkapseling te bereiken, beperking van lipidetypen en moleculaire samenstelling van het inkapselingsmiddel, behoefte aan niet-fysiologische chemicaliën om inkapseling te vergemakkelijken, lage GUV-opbrengst en inconsistenties in inkapselingsefficiëntie blijven onderzoekers op dit gebied uitdagen. Gezien het brede scala aan potentiële studies die kunnen worden ges.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
18:1 Liss Rhod PE lipid in chloroform	Avanti Polar Lipids	810150C
96 Well Optical Btm Pit PolymerBase	ThermoFisher Scientific	165305
Actin from rabbit skeletal muscle	Cytoskeleton	AKL99-A
ATTO 488-actin from rabbit skeletal muscle	Hypermol	8153-01
Axygen microtubes (200 µL)	Fisher Scientific	14-222-262	for handling ABPs
Black resin	Formlabs	RS-F2-GPBK-04
Cholesterol (powder)	Avanti Polar Lipids	700100P
Choloroform	Sigma Aldrich	67-66-3
Clear resin	Formlabs	RS-F2-GPCL-04
CSU-X1 Confocal Scanner Unit	YOKOGAWA	CSU-X1
Density gradient medium (Optiprep)	Sigma-Aldrich	D1556
DOPC lipid in chloroform	Avanti Polar Lipids	850375C
Fascin	homemade	N/A
F-buffer	homemade	N/A
Fisherbrand microtubes (1.5 mL)	Fisher Scientific	05-408-129
FS02 Sonicator	Fischer Scientific	FS20
G-buffer	homemade	N/A
Glucose	Sigma-Aldrich	158968
iXon X3 camera	Andor	DU-897E-CS0
Mineral oil	Acros Organics	8042-47-5
Olympus IX81 Inverted Microscope	Olympus	IX21
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective	Olumpus	1-U2B933
Silicone oil	Sigma-Aldrich	317667