Methodenartikel

Snelle inkapseling van gereconstitueerd cytoskelet in gigantische unilamellaire blaasjes

DOI:

10.3791/63332

⸱

10 november 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 2John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences, Harvard University, 3Department of Cellular and Molecular Biophysics, Max Planck Institute of Biochemistry, 4Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 5Department of Biophysics, University of Michigan, Ann Arbor, 6Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, Ann Arbor

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel introduceert een eenvoudige methode voor snelle productie van gigantische unilamellaire blaasjes met ingekapselde cytoskeletale eiwitten. De methode blijkt nuttig te zijn voor bottom-up reconstitutie van cytoskeletstructuren in opsluiting en cytoskelet-membraaninteracties.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gigantische unilamellaire blaasjes (GUVs) worden vaak gebruikt als modellen van biologische membranen en zijn dus een geweldig hulpmiddel om membraangerelateerde cellulaire processen in vitro te bestuderen. In de afgelopen jaren is inkapseling binnen GUV's een nuttige benadering gebleken voor reconstitutie-experimenten in celbiologie en aanverwante gebieden. Het bootst beter de opsluitingsomstandigheden in levende cellen na, in tegenstelling tot conventionele biochemische reconstitutie. Methoden voor inkapseling in GUVs zijn vaak niet eenvoudig te implementeren en slagingspercentages kunnen aanzienlijk verschillen van laboratorium tot laboratorium. Een techniek die succesvol is gebleken voor het inkapselen van complexere eiwitsystemen wordt continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) genoemd. Hier wordt een op cDICE gebaseerde methode gepresenteerd voor het snel inkapselen van cytoskeletale eiwitten in GUVs met een hoge inkapselingsefficiëntie. In deze methode worden eerst lipide-monolaagdruppels gegenereerd door een eiwitoplossing te emulgeren die van belang is in een lipide / oliemengsel. Nadat ze zijn toegevoegd aan een roterende 3D-geprinte kamer, gaan deze lipide-monolagige druppels vervolgens door een tweede lipide monolaag op een water / olie-interface in de kamer om GUVs te vormen die het eiwitsysteem bevatten. Deze methode vereenvoudigt de algemene procedure van inkapseling binnen GUV's en versnelt het proces, en stelt ons dus in staat om de dynamische evolutie van netwerkassemblage in lipide bilayer blaasjes te beperken en te observeren. Dit platform is handig voor het bestuderen van de mechanica van cytoskelet-membraaninteracties in opsluiting.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lipide dubbellaagse compartimenten worden gebruikt als model synthetische cellen voor het bestuderen van ingesloten organische reacties en op membraan gebaseerde processen of als dragermodules in toepassingen voor medicijnafgifte 1,2. Bottom-up biologie met gezuiverde componenten vereist minimale experimentele systemen om eigenschappen en interacties tussen biomoleculen, zoals eiwitten en lipiden, te onderzoeken 3,4. Met de vooruitgang van het veld is er echter een toegenomen behoefte aan complexere experimentele systemen die de omstandigheden in biolo....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereiding van olie-lipidenmengsel

OPMERKING: De stap moet worden uitgevoerd in een zuurkast volgens alle veiligheidsrichtlijnen voor het hanteren van chloroform.

  1. Neem 0,5 ml chloroform in een glazen injectieflacon van 15 ml. Voeg 88 μL 25 mg/ml dioleoylfosfocholine (DOPC), 9,3 μL 50 mg/ml cholesterol en 5 μL 1 mg/ml dioleoyl-fosfoethanolamine-lissamine rhodamine B (rhodamine PE) (zie Materiaaltabel) toe aan de glazen injectieflacon van 15 ml.
    OPMERKING: De uiteindelijke molfracties van DOPC en cholesterol in siliconenolie / minerale olie zijn respectievelijk 69,9% en 30%. Er werd vastgesteld....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de succesvolle generatie van cytoskeletale GUVs met behulp van het huidige protocol aan te tonen, werden fascin-actinebundelstructuren in GUV's gereconstitueerd. Fascin is een korte crosslinker van actinefilamenten die stijve parallel uitgelijnde actinebundels vormt en wordt gezuiverd van E. coli als glutathion-S-Transferase (GST) fusie-eiwit26. 5 μM actine werd voor het eerst gereconstitueerd, inclusief 0,53 μM ATTO488 actine in de actinepolymerisatiebuffer en 7,5% van het dichtheidsg.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verschillende methoden voor het genereren van GUVs zijn onderzocht voor de creatie van synthetische cellen De complexiteit van de procedures, de langere tijd om inkapseling te bereiken, beperking van lipidetypen en moleculaire samenstelling van het inkapselingsmiddel, behoefte aan niet-fysiologische chemicaliën om inkapseling te vergemakkelijken, lage GUV-opbrengst en inconsistenties in inkapselingsefficiëntie blijven onderzoekers op dit gebied uitdagen. Gezien het brede scala aan potentiële studies die kunnen worden ges.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

APL erkent steun van een Humboldt Research Fellowship for Experienced Researchers en van de National Science Foundation (1939310 and 1817909) en National Institutes of Health (R01 EB030031).

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
18:1 Liss Rhod PE lipid in chloroformAvanti Polar Lipids810150C
96 Well Optical Btm Pit PolymerBaseThermoFisher Scientific165305
Actine uit konijnskeletspierCytoskeletonAKL99-A
ATTO 488-actine uit konijnskeletspierHypermol8153-01
Axygen microtubes (200 µL)Fisher Scientific14-222-262voor het hanteren van ABP's
Zwarte harsFormlabsRS-F2-GPBK-04
Cholesterol (poeder)Avanti Polar Lipids700100P
CholoroformSigma Aldrich67-66-3
Heldere harsFormlabsRS-F2-GPCL-04
CSU-X1 Confocal Scanner UnitYOKOGAWACSU-X1
Dichtheidsgradiënt medium (Optiprep)Sigma-AldrichD1556
DOPC lipid in chloroformAvanti Polar Lipids850375C
FascinzelfgemaaktN/A
F-bufferzelfgemaaktN/A
Fisherbrand microtubes (1.5 mL)Fisher Scientific05-408-129
FS02 SonicatorFischer ScientificFS20
G-bufferzelfgemaaktN/A
GlucoseSigma-Aldrich158968
iXon X3 cameraAndorDU-897E-CS0
MineralolieAcros Organics8042-47-5
Olympus IX81 Inverted MicroscopeOlympusIX21
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope ObjectiveOlumpus1-U2B933
Silicone olieSigma-Aldrich317667

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Groaz, A., et al. Engineering spatiotemporal organization and dynamics in synthetic cells. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (3), 1685(2021).
  2. Diltemiz, S. E., et al. Use of art....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Inkapseling van het cytoskeletcDICE methodelipidemoonlaagdruppelsactinepolymerisatieonderzoek naar synthetische cellenactinebindende eiwittenconfocale microscopieeiwitreconstitutiemembraanbeperking

Gerelateerde artikelen