Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor mitochondriale isolatie van de skeletspieren van muizen en de daaropvolgende analyse van ademhaling door oxygen consumption rate (OCR) met behulp van op microplaten gebaseerde respirometrische assays. Deze pijplijn kan worden toegepast om de effecten van meerdere omgevings- of genetische interventies op het mitochondriale metabolisme te bestuderen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie van mitochondriën uit de skeletspieren van muizen voor respirometrische assays
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het grootste deel van de energie van de cel wordt verkregen door de afbraak van glucose, vetzuren en aminozuren door verschillende routes die samenkomen op het mitochondriale oxidatieve fosforyleringssysteem (OXPHOS), dat wordt gereguleerd als reactie op cellulaire eisen. Het lipidemolecuul Co-enzym Q (CoQ) is essentieel in dit proces door elektronen over te brengen naar complex III in de elektronentransportketen (ETC) door constante oxidatie/ reductiecycli. Mitochondriale status en, uiteindelijk, cellulaire gezondheid kunnen worden beoordeeld door etc zuurstofverbruik te meten met behulp van respirometrische assays. Deze studies worden meestal uitgevoerd in gevestigde of primaire cellijnen die gedurende meerdere dagen zijn gekweekt. In beide gevallen kunnen de verkregen ademhalingsparameters afwijken van de normale fysiologische omstandigheden in een bepaald orgaan of weefsel.
Bovendien belemmeren de intrinsieke kenmerken van gekweekte enkelvoudige vezels geïsoleerd uit skeletspieren dit type analyse. Dit artikel presenteert een bijgewerkt en gedetailleerd protocol voor de analyse van ademhaling in vers geïsoleerde mitochondriën van muizenskeletspieren. We bieden ook oplossingen voor mogelijke problemen die zich in elke stap van het proces kunnen voordoen. De hier gepresenteerde methode kan worden toegepast om zuurstofverbruikssnelheden in verschillende transgene muismodellen te vergelijken en de mitochondriale respons op medicamenteuze behandelingen of andere factoren zoals veroudering of geslacht te bestuderen. Dit is een haalbare methode om te reageren op cruciale vragen over mitochondriaal bio-energetisch metabolisme en regulatie.
Inleiding
Mitochondriën zijn de primaire metabole organellen in de cel1. Deze gespecialiseerde membraan-ingesloten organellen gebruiken voedingsmoleculen om energie te produceren in de vorm van adenosinetrifosfaat (ATP) door OXPHOS. Dit proces is afhankelijk van de overdracht van elektronen van donormoleculen in een reeks redoxreacties in de ETC2. CoQ is het enige redox-actieve lipide dat endogeen wordt geproduceerd in alle celmembranen en circulerende lipoproteïnen die een antioxiderende functie vertoont3. Het is een essentieel onderdeel van de ETC, het overbrengen van elektronen van NADH-afhankelijk compl....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Muishuisvesting en weefselverzameling werden uitgevoerd met behulp van protocollen die zijn goedgekeurd door de ethische commissie van de Universidad Pablo de Olavide (Sevilla, Spanje; protocollen 24/04/2018/056 en 12/03/2021/033) in overeenstemming met het Spaanse koninklijk besluit 53/2013, de Europese richtlijn 2010/63/EU en andere relevante richtlijnen.
1. Voorbereiding van voorraden, buffers en reagentia voor de ademhalingstests
- Bereid de volgende stamoplossingen voor, die maandenlang bij de aangegeven temperatuur kunnen worden bewaard. Gebruik in alle gevallen ultrapuur H2O.
- Los fosfaat-ge....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het hier gepresenteerde protocol maakt de in vivo analyse van mitochondriale ademhaling mogelijk door de isolatie van mitochondriën van de skeletspieren van muizen. Een overzicht van de methode is weergegeven in figuur 1. Na het ontleden van skeletspieren uit de achterpoten (figuur 2), worden weefsels gehomogeniseerd en mitochondriën gezuiverd, onder isotone omstandigheden, door seriële centrifubaties. De zuiverheid van de verschillende fracties verkreg.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Alle methoden die worden gebruikt om mitochondriale ademhaling te bestuderen, hebben hun beperkingen; daarom is het cruciaal om de methode te kiezen die het beste past bij een specifieke experimentele vraag. Dit werk biedt een bijgewerkt en gedetailleerd protocol om mitochondriën te isoleren van de skeletspieren van muizen om verschillende ademhalingstests uit te voeren om de mitochondriale functie te onderzoeken. Inderdaad, de studie van mitochondriale bio-energetica in geïsoleerde mitochondriën met behulp van microplaa.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben om bekend te maken.
Dankbetuigingen
We willen Juan J. Tena bedanken voor het gebruik van de homogenisator en de CABD Proteomics en Veeteelt faciliteiten voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door het Spaanse ministerie van Onderwijs, Cultuur en Sport via fellowship FPU16/03264 aan J.D.H.C., de Association Française contre les Myopathies (AFM) via fellowship grant #22450 aan C.V.-G., een Institutional Grant MDM-2016-0687 (Maria de Maeztu Excellence Unit, Department of Gene Regulation and Morphogenesis bij CABD) en BFU2017-83150-P aan J.J.C. De Junta de Andalucía-subsidie P18-RT-4572, het FEDER-financieringsprogramma van de Europese Unie en het Spaanse ministerie van Wetenschap, Innovat....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
```
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| ADP | Sigma | A5285 | Voorraad bij -20 °C |
| AKT antibody | Cell Signaling Technology | C67E7 | Konijn (Gastheersoort) |
| anti-Goat HRP | Sigma | 401504 | Konijn (Gastheersoort) |
| anti-Mouse HRP | Cell Signaling | #7076 | Paard (Gastheersoort) |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | Voorraad bij -20 °C |
| anti-Rabbit HRP | Cell Signaling | #7074 | Geit (Gastheersoort) |
| Ascorbic acid | Sigma | A5960 | Voorraad bij RT |
| Bactin antibody | Sigma | MBS4-48085 | Geit (Gastheersoort) |
| Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | Het bevat 5x Bradford-reagens en BSA met bekende concentratie voor de standaardcurve |
| BSA, fraction V, Fatty Acid-Free | Calbiochem | 126575 | Voorraad bij 4 °C |
| C tube | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Paarse deksel |
| Calnexin antibody | ThermoFisher | MA3-027 | Muis (Gastheersoort) |
| D-mannitol | Sigma | M4125 | Voorraad bij RT |
| EDTA | BDH | 280254D | Voorraad bij 4 °C |
| EGTA | Sigma | E-4378 | Voorraad bij RT |
| FCCP | Sigma | C2920 | Voorraad bij -20 °C |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Homogenisator |
| HEPES | Sigma | H3375 | Voorraad bij RT |
| HSP70 antibody | Proteintech | 10995-1-AP | Konijn (Gastheersoort) |
| LDH-A antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC27230 | Geit (Gastheersoort) |
| Magnesium chloride | ChemCruz | sc-255260A | Voorraad bij RT |
| Malic acid | Sigma | P1645 | Voorraad bij RT |
| Microplate spectrophotometer | BMG LABTECH GmbH | POLARstar OMEGA S/N 415-0292 | Voorraad bij RT |
| Milli-Q water | Millipore system | F7HA17757A | Ultrapuur water |
| mtTFA antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC23588 | Geit (Gastheersoort) |
| Na+/K+-ATPase α1 antibody | Novus Biologicals | NB300-14755 | Muis (Gastheersoort) |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | Voorraad bij -20 °C |
| Palmitoyl-L-carnitine | Sigma | P1645 | Voorraad bij -20 °C |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | 1x voorraad bij RT |
| Potassium dihydrogen phosphate | ChemCruz | sc-203211 | Voorraad bij RT |
| Potassium hydroxide | Sigma | 60377 | Voorraad bij RT |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | Voorraad bij 4 °C |
| Rotenone | Sigma | R8875 | Voorraad bij -20 °C |
| Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer | Agilent Technologies | 420179 | XFe24 model |
| Seahorse XFe24 FluxPak mini | Agilent Technologies | 102342-100 | De kit bevat cartridges, microplates en kalibratieoplossing |
| Succinate | Sigma | S7626 | Voorraad bij RT |
| Sucrose | Sigma | S9378 | Voorraad bij RT |
| TIMM23 antibody | Abcam | ab230253 | Konijn (Gastheersoort) |
| TMPD | Sigma | T7394 | Voorraad bij -20 °C |
| TOMM20 antibody | Abcam | ab56783 | Muis (Gastheersoort) |
| VDAC antibody | Abcam | ab15895 | Konijn (Gastheersoort) |
Referenties
- Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
- Alberts, B., et al. The mitochondrion. Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , Garland Science. New York. (2002).
- Turunen, M.....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
