Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie van mitochondriën uit de skeletspieren van muizen voor respirometrische assays

5.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63336

⸱

10 februari 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centro Andaluz de Biología del Desarrollo, CSIC-UPO-JA, Universidad Pablo de Olavide, 2CIBERER, Instituto de Salud Carlos III

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor mitochondriale isolatie van de skeletspieren van muizen en de daaropvolgende analyse van ademhaling door oxygen consumption rate (OCR) met behulp van op microplaten gebaseerde respirometrische assays. Deze pijplijn kan worden toegepast om de effecten van meerdere omgevings- of genetische interventies op het mitochondriale metabolisme te bestuderen.

Samenvatting

Het grootste deel van de energie van de cel wordt verkregen door de afbraak van glucose, vetzuren en aminozuren door verschillende routes die samenkomen op het mitochondriale oxidatieve fosforyleringssysteem (OXPHOS), dat wordt gereguleerd als reactie op cellulaire eisen. Het lipidemolecuul Co-enzym Q (CoQ) is essentieel in dit proces door elektronen over te brengen naar complex III in de elektronentransportketen (ETC) door constante oxidatie/ reductiecycli. Mitochondriale status en, uiteindelijk, cellulaire gezondheid kunnen worden beoordeeld door etc zuurstofverbruik te meten met behulp van respirometrische assays. Deze studies worden meestal uitgevoerd in gevestigde of primaire cellijnen die gedurende meerdere dagen zijn gekweekt. In beide gevallen kunnen de verkregen ademhalingsparameters afwijken van de normale fysiologische omstandigheden in een bepaald orgaan of weefsel.

Bovendien belemmeren de intrinsieke kenmerken van gekweekte enkelvoudige vezels geïsoleerd uit skeletspieren dit type analyse. Dit artikel presenteert een bijgewerkt en gedetailleerd protocol voor de analyse van ademhaling in vers geïsoleerde mitochondriën van muizenskeletspieren. We bieden ook oplossingen voor mogelijke problemen die zich in elke stap van het proces kunnen voordoen. De hier gepresenteerde methode kan worden toegepast om zuurstofverbruikssnelheden in verschillende transgene muismodellen te vergelijken en de mitochondriale respons op medicamenteuze behandelingen of andere factoren zoals veroudering of geslacht te bestuderen. Dit is een haalbare methode om te reageren op cruciale vragen over mitochondriaal bio-energetisch metabolisme en regulatie.

Inleiding

Mitochondriën zijn de primaire metabole organellen in de cel1. Deze gespecialiseerde membraan-ingesloten organellen gebruiken voedingsmoleculen om energie te produceren in de vorm van adenosinetrifosfaat (ATP) door OXPHOS. Dit proces is afhankelijk van de overdracht van elektronen van donormoleculen in een reeks redoxreacties in de ETC2. CoQ is het enige redox-actieve lipide dat endogeen wordt geproduceerd in alle celmembranen en circulerende lipoproteïnen die een antioxiderende functie vertoont3. Het is een essentieel onderdeel van de ETC, het overbrengen van elektronen van NADH-afhankelijk complex I en FADH2-afhankelijk complex II naar complex III, hoewel veel andere reductasen de reductie van mitochondriale CoQ naar ubiquinol kunnen stimuleren als een verplichte stap in meerdere cellulaire metabole routes4,5.

Gedurende het hele proces wordt een elektrochemische protongradiënt gecreëerd over het mitochondriale binnenmembraan, dat wordt omgezet in biologisch actieve energie door het ATP-synthasecomplex V2. Bijgevolg leidt mitochondriale disfunctie tot een groot aantal pathologische aandoeningen die voornamelijk weefsels met hoge energiebehoeften beïnvloeden - de hersenen, het hart en de skeletspieren6,7. Daarom is het van fundamenteel belang om methoden te ontwikkelen om mitochondriale bio-energetica nauwkeurig te analyseren om de rol ervan in gezondheid en ziekte te onderzoeken, met name in hoogenergetische weefsels zoals skeletspieren.

De Clark-type zuurstofelektrode is klassiek gebruikt in de studie van mitochondriale ademhaling8. Dit systeem is echter geleidelijk verdrongen door technologieën met een hogere resolutie, waarbij op microplaten gebaseerde zuurstofverbruikstechnologieën zoals Agilent Seahorse XF-analyzers bijzonder populair zijn9. Op het gebied van skeletspieren worden deze studies meestal uitgevoerd in gekweekte cellen, voornamelijk in de C2C12 vereeuwigde muismyoblastcellijn of primaire culturen afgeleid van satellietcellen10,11. Deze studies vatten de situatie echter niet volledig in vivo samen, vooral bij het onderzoeken van mitochondriale biologie en functie op weefselniveau bij specifieke beledigingen, niet-genetische interventies of genetische manipulaties.

Bovendien zijn ademhalingstests in cellen complexer vanwege aanvullende factoren, waaronder extra mitochondriale vraag naar ATP en assaysubstraten of signaalgebeurtenissen, die de interpretatie van de resultaten kunnen misleiden. Als alternatief is het ook mogelijk om enkele of bundels vers geïsoleerde myofibers uit spieren te gebruiken. De isolatiemethode is echter technisch uitdagend en slechts voor enkele spiertypen haalbaar. In dit geval worden voornamelijk flexor digitorum brevis (FDB) en extensor digitorum longus (EDL) spieren gebruikt10,12,13, hoewel enkele rapporten ook het gebruik van andere spiertypen beschrijven14,15.

Bio-energetische profilering van skeletspiersecties is ook gemeld16. Het grote voordeel van deze methode is dat intacte spieren kunnen worden bestudeerd (de auteurs laten zien dat het snijden door vezels de resultaten niet verstoort in vergelijking met geïsoleerde myofiberen). De mitochondriale toegang tot substraten en assayremmers is echter beperkt en dus kunnen slechts enkele parameters worden gemeten16. Ten slotte kunnen geïsoleerde mitochondriën ook worden gebruikt9,17,18,19. In dit geval verliezen mitochondriën hun cytosolische omgeving, wat hun functie kan beïnvloeden. Deze methode garandeert daarentegen toegang tot substraten en remmers, maakt de analyse van een overvloed aan monstertypen mogelijk en vereist doorgaans minder materiaal.

Dit artikel beschrijft een methode om de bio-energetische profilering van geïsoleerde mitochondriën uit de skeletspieren van muizen uit te voeren met behulp van respirometrische assays op basis van microplaten (figuur 1). In het bijzonder zijn drie protocollen gedetailleerd: de koppelingstest, CA om de mate van koppeling tussen de ETC en de OXPHOS-machines te beoordelen; de Electron Flow Assay, EFA om de activiteit van de afzonderlijke ETC-complexen te meten; en de BOX-test om mitochondriale β-oxidatiecapaciteit te bepalen. Met name zijn slechts kleine hoeveelheden monsters vereist in vergelijking met conventionele respirometriemethoden. Het hier gebruikte isolatieprotocol is aangepast ten opzichte van de elders gepubliceerde methode18.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Muishuisvesting en weefselverzameling werden uitgevoerd met behulp van protocollen die zijn goedgekeurd door de ethische commissie van de Universidad Pablo de Olavide (Sevilla, Spanje; protocollen 24/04/2018/056 en 12/03/2021/033) in overeenstemming met het Spaanse koninklijk besluit 53/2013, de Europese richtlijn 2010/63/EU en andere relevante richtlijnen.

1. Voorbereiding van voorraden, buffers en reagentia voor de ademhalingstests

  1. Bereid de volgende stamoplossingen voor, die maandenlang bij de aangegeven temperatuur kunnen worden bewaard. Gebruik in alle gevallen ultrapuur H2O.
    1. Los fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) tabletten op in H2O (1 tablet per 200 ml H2O) om 1x PBS te bereiden. Autoclaaf de oplossing en bewaar deze bij kamertemperatuur (RT).
    2. Los 2 g NaOH-pellets op in 50 ml H2O om 1 M NaOH te bereiden.
    3. Bereid 0,1 M, 1 M, 5 M en 10 M KOH-voorraden voor op pH-kalibratie.
    4. Voeg 14,612 g EDTA toe aan 70 ml H2O. Voeg NaOH-pellets toe totdat de pH 8,0 bereikt, zodat EDTA volledig oplost. Voeg H2O quantum satis (QS) toe aan 100 ml. Autoclaaf de resulterende 0,5 M EDTA (pH 8) oplossing en bewaar deze bij RT.
    5. Voeg 19 g EGTA toe aan 70 ml H2O. Voeg NaOH-pellets toe totdat de pH 8,0 bereikt om de EGTA volledig te laten oplossen. Voeg H2O QS toe aan 100 ml. Autoclaaf de resulterende 0,5 M EGTA (pH 8) oplossing en bewaar deze bij RT.
    6. Voeg 2 ml 0,5 M EDTA toe aan 98 ml PBS. Bewaar de resulterende 10 mM EDTA/PBS-oplossing bij RT.
    7. Los 5,958 g HEPES op in 40 ml H2O. Stel de pH in op 7,2 met KOH en QS op 50 ml met H2O. Filtreer de resulterende HEPES-buffer van 0,5 M door een gaas van 0,45 μm en bewaar deze bij RT.
    8. Los 3,402 g KH2PO4 op in maximaal 50 ml H2O. Filtreer de resulterende KH2PO4-oplossing van 0,5 M door een gaas van 0,45 μm en bewaar deze bij RT.
    9. Los 9,521 g watervrij MgCl2 op in maximaal 100 ml H2O. Autoclaaf de resulterende 1 M MgCl2-oplossing en bewaar deze bij RT.
      OPMERKING: Aangezien dit een exotherme reactie is, ga voorzichtig te werk en los de MgCl2 op ijs op.
  2. Bereid substraat- en inhibitorstockoplossingen voor (zie tabel 1). Aliquot en bewaar ze bij -20 °C. Vermijd vries-dooicycli. Bereid bij wijze van uitzondering pyruvinezuur altijd direct voor gebruik.
    1. Bereid in ultrapuur H2O: 0,5 M succinaat, 0,5 M pyruvinezuur, 0,5 M appelzuur, 100 mM ADP, 1 M ascorbinezuur en 50 mM N,N,N′,N′-tetramethyl-para-fenyleen-diamine (TMPD) (beschermen tegen licht).
    2. Bereid in 100% dimethylsulfoxide (DMSO): 50 mM palmitoyl-L-carnitine, 4 mM rotenon, 20 mM carbonylcyanide-p-trifluoromethoxyfenylhydrazon (FCCP), 4 mM oligomycine en 5 mM Antimycine A.
      OPMERKING: Overschrijd de uiteindelijke DMSO-concentratie van 0,1% in de microplaatputten niet. Bereid daarom sterk geconcentreerde voorraadoplossingen voor om onder deze limiet te blijven.
  3. Bereid de buffers voor mitochondriale isolatie en eiwitkwantificering vers voor op de dag van het experiment. Gebruik in alle gevallen ultrapuur H2O en bewaar alle buffers op ijs tenzij anders vermeld.
    OPMERKING: Om tijd te besparen, kunnen alle reagentia worden gewogen en bewaard in de juiste containers (bijv. 15 ml buizen) op de juiste temperatuur op de vorige dag.
    1. Om 10% vrije vetzuren (FFA) BSA te bereiden, lost u 150 mg FFA BSA grondig op in 1,5 ml H2O door inversie/ draaiwiel. Draai geen vortex om schuimvorming te voorkomen.
    2. Om 1x Bradford-reagens te bereiden, verdunt u de 5x commerciële voorraadoplossing met H2O en bewaart u deze in het donker bij RT.
    3. Om 8x Mitochondria Buffer (MB) te bereiden, lost u 4,112 g sucrose en 763 mg HEPES op in 15 ml H2O. Pas de pH aan op 7,2, voeg 1,6 ml 10% FFA BSA en QS toe aan 20 ml met H2O.
    4. Om 20 ml isolatiebuffer 1 (IB1) (4 ml per monster) te bereiden, lost u 400 μl 0,5 M EDTA, 784 mg D-mannitol en 2,5 ml 8x MB op in 15 ml H2O. Pas de pH aan op 7,2 en QS met H2O.
    5. Om 5 ml isolatiebuffer 2 (IB2) (500 μL gebruikt per monster) te bereiden, lost u 30 μL 0,5 M EGTA, 196 mg D-mannitol en 625 μL van 8x MB op in 4 ml H2O. Pas de pH aan op 7,2 en QS met H2O.
    6. Om 5 ml Resuspension Buffer (RB) (200 μL gebruikt per monster) te bereiden, lost u 120 mg sucrose, 191,3 mg D-mannitol, 50 μL 0,5 M HEPES en 10 μL 0,5 M EGTA op in 4 ml H2O. Stel de pH in op 7,2 en QS met H2O.
    7. Om 2x Mitochondrial Assay Solution-1 (MAS-1) te bereiden, los je 1,199 g sucrose, 2,8 g mannitol, 1 ml 0,5 M KH2PO4, 250 μl 1 M MgCl2, 200 μL 0,5 M HEPES en 100 μL 0,5 M EGTA in 20 ml H2O. Pas de pH aan op 7,2 en QS op 25 ml met H2O. Blijf kort in ijs. Houd het gedurende langere perioden op 4 °C om neerslag te voorkomen.
    8. Om 1x Coupling Assay medium (CAM) voor te bereiden, bereidt u twee verschillende MAS-1-gebaseerde buffers voor: 1) CAM + BSA voor de CA-assay zelf en 2) CAM-BSA voor het bereiden van de assayremmers. Houd de verhouding pyruvaat:malaat altijd op 10:1.
      OPMERKING: Aangezien BSA de injectiepoorten kan verstoppen, verdunt u de remmers in BSA-vrije CAM.
      1. Om CAM +BSA te bereiden, verdun 300 μL 0,5 M pyruvic acid, 30 μL 0,5 M appelzuur en 7,5 ml 2x MAS-1 in 6 ml H2O. Pas de pH aan op 7,2. Voeg 300 μL van 10% FFA BSA en QS toe aan 15 ml met H2O.
      2. Om CAM-BSA te bereiden, verdun 120 μL 0,5 M pyruvinezuur, 12 μL 0,5 M appelzuur en 3 ml 2x MAS-1 in 2 ml H2O. Stel de pH in op 7,2 en QS op 6 ml met H2O.
    9. Om 1x Electron Flow Assay medium (EFAM) te bereiden, bereidt u zowel BSA-bevattende als BSA-vrije EFAM-buffers voor.
      1. Om EFAM+BSA te bereiden, verdunt u 300 μL 0,5 M pyruvinezuur, 60 μL 0,5 M appelzuur, 3 μL 20 mM FCCP en 7,5 ml 2x MAS-1 in 6 ml H2O. Stel de pH in op 7,2. Voeg 300 μL van 10% FFA BSA en QS toe aan 15 ml met H2O.
      2. Om EFAM-BSA te bereiden, verdun 120 μL 0,5 M pyruvic acid, 24 μL van 0,5 M appelzuur, 1,2 μL van 20 mM FCCP en 3 ml van 2x MAS-1 in 2 ml H2O. Pas de pH aan op 7,2 en QS op 6 ml met H2O.
    10. Om 1x β-oxidatiemedium (BOXM) te bereiden, bereidt u BSA-bevattende en BSA-vrije BOXM-oplossingen.
      1. Om BOXM+BSA te bereiden, verdunt u 12 μL 50 mM palmitoyl-L-carnitine, 30 μL 0,5 M appelzuur en 7,5 ml 2x MAS-1 in 7 ml H2O. Pas de pH aan op 7,2. Voeg 300 μL van 10% FFA BSA en QS toe aan 15 ml met H2O.
      2. Om BOXM-BSA te bereiden, verdun 4,8 μL van 50 mM palmitoyl-L-carnitine, 12 μL van 0,5 M appelzuur en 3 ml van 2x MAS-1 in 2 ml H2O. Pas de pH aan op 7,2 en QS op 6 ml met H2O.

2. Spierdissectie, homogenisatie en mitochondriale isolatie

  1. Leg alle materialen en buffers op ijs. Zorg ervoor dat alle materialen ijskoud zijn tijdens de hele procedure om mitochondriën te beschermen tegen schade.
  2. Plaats drie bekers van 50 ml per monster op ijs en voeg de volgende oplossingen toe: 10 ml PBS in bekerglas 1, 10 ml 10 mM EDTA/PBS in bekerglas 2 en 4 ml IB1 in bekerglas 3.
  3. Euthanaseer de muis door cervicale dislocatie. Vermijd CO2-euthanasie omdat skeletspieren hypoxisch kunnen worden en ademhalingsanalyses kunnen verstoren.
  4. Spuit de rechter achterpoot met 70% ethanol om te voorkomen dat de vacht afstoot en plak de ledemaat op de kurkstlesectieplaat. Plak ook de linker voorpoot af.
  5. Maak een incisie met een steriel wegwerp scalpel door de huid van knie tot teen.
  6. Pak de huid vast met een getande tang op enkelhoogte en knip deze met een fijne schaar om de enkel.
  7. Maak de huid weg van de onderliggende musculatuur met een pincet met fijne punt in de ene hand en trek het omhoog met een getande tang in de andere hand.
  8. Ontleed alle skeletspieren van enkel tot knie (figuur 2).
    1. Verwijder al het bindweefsel over de tibialis anterieure (TA) spier om spierextractie te vergemakkelijken met behulp van een fijn pincet en een schaar.
    2. Zoek de vier distale pezen van de EDL-spier en snijd ze dicht bij hun inserties in de tenen. Lokaliseer de TA-distale pees en snijd deze dicht bij het inbrengen, altijd onder de enkel.
    3. Trek voorzichtig de TA- en EDL-pezen boven de enkel om de losse eindjes vrij te maken.
    4. Pak de losse eindjes van de pezen vast en verlicht de spieren weg van de rest van de spieren en botten door ze omhoog te trekken. Gebruik een fijn pincet of schaar om het proces te vergemakkelijken. Ga voorzichtig te werk om myofiber-contractie te voorkomen.
    5. Snijd de proximale pees van de EDL en de TA-spier zo dicht mogelijk bij de knieschijf.
    6. Draai de muis ondersteboven om verder te gaan met gastrocnemius (GA) en soleus spierextractie.
    7. Pak de pocket gevormd tussen de biceps femoris en de GA vast met een getande tang. Gebruik een fijne schaar om deze spieren te scheiden en de proximale GA-pees te visualiseren.
    8. Pak de achillespees vast met een fijne tang en knip deze voorzichtig af met een fijne schaar. Laat de GA- en soleusspieren los van het onderliggende bot door ze via hun pezen omhoog te trekken. Snijd de proximale GA-pees door en bevrijd deze samen met de onderliggende soleus.
    9. Ontleed voorzichtig de resterende spieren van pees tot pees volgens dezelfde procedure totdat alleen botten overblijven.
    10. Pin de muis opnieuw vast in de beginpositie om de quadricepsspier te ontleden.
    11. Gooi het vetweefsel over de quadriceps aan de proximale zijde met behulp van een getande tang en een fijne schaar.
    12. Plaats een fijn pincet tussen de quadriceps en het dijbeen en beweeg ze in beide richtingen langs de dijbeenas om de spier van het bot te scheiden.
    13. Pak de distale quadriceps spierpezen vast met een getande tang en knip de pees met een fijne schaar zo dicht mogelijk bij de knieschijf.
    14. Trek de quadriceps omhoog en bevrijd deze bij het proximaal inbrengen met een fijne schaar.
  9. Herhaal stap 4-8 uit dit gedeelte met de linkerachterpoot.
  10. Spoel eerst alle spieren in Bekerglas 1 en daarna in Bekerglas 2.
  11. Breng alle spieren over naar Beaker 3 en hak alle spieren fijn met een scherpe schaar op ijs.
  12. Breng de suspensie over naar een C Tube (paars deksel) en houd deze altijd in ijs.
  13. Sluit de C Tube goed af en bevestig deze ondersteboven aan de sleeve van de homogenisator. Zorg ervoor dat het monstermateriaal zich in het gebied van de rotator/stator bevindt. Selecteer het programma van 1 minuut genaamd m_mito_tissue_01.
  14. Verdeel het homogenaat in twee voorgestreepte microcentrifugebuizen van 2 ml en centrifugeer bij 700 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C in een tafelcentrifuge.
  15. Breng de supernatanten over naar nieuwe 2 ml voorgechilleerde buizen, waarbij vet en niet-gehomogeniseerd weefsel zorgvuldig worden vermeden. Bewaar de pellets bij -80 °C voor de bepaling van de fragmentatiezuiverheid (fractie N) (figuur 3).
  16. Centrifugeer de supernatanten bij 10.500 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  17. Breng de supernatanten over naar nieuwe 2 ml voorgechilleerde buizen en label ze als Supernatant Number 1 (SN1). Bewaar ze bij -80 °C voor de bepaling van de fragmentatiezuiverheid (figuur 3).
  18. Resuspend en combineer beide pellets in een totaal volume van 500 μL IB2 in ijs.
  19. Centrifugeer bij 10.500 × g gedurende 10 min bij 4°C.
  20. Breng het supernatant over naar een nieuwe voorgechilleerde buis van 2 ml en label het als Supernatant Number 2 (SN2). Bewaar het bij -80 °C voor de bepaling van de fragmentatiezuiverheid (figuur 3).
  21. Resuspend de uiteindelijke mitochondriale pellet in 200 μL RB. Zet snel 10 μL opzij voor eiwitkwantificering en voeg onmiddellijk 10 μL 10% FFA BSA toe aan de resterende mitochondriale suspensie om schade te voorkomen.
  22. Bepaal de eiwitconcentratie met behulp van de Bradford-test.
    1. Bereid voor de standaardcurve 30 μL seriële verdunningen van de bekende concentratie van een eiwit in RB-buffer. Gebruik bijvoorbeeld 1 mg / ml, 0,5 mg / ml, 0, 25 mg / ml, 0, 125 mg / ml, 0, 0, 0625 mg / ml en 0 mg / ml BSA.
    2. Bereid 1:3 en 1:6 seriële verdunningen van de mitochondriale monsters in RB-buffer.
    3. In een 96-well platbodemplaat laad je eerst 2,5 μL monster/standaard per put. Voeg vervolgens 10 μL van 1 M NaOH toe aan elk monster en ten slotte 200 μL 1x Bradford-reagens. Meng goed en vermijd luchtbellen. Controleer visueel of de kleur van de monsters zich binnen de kalibratielijn bevindt. Voer de analyse altijd in drievoud uit.
    4. Incubeer de platen gedurende 5 minuten bij RT in het donker en lees de absorptie bij 595 nm in een microplaatspectrofotometer.
    5. Bereken de standaardcurve door de absorptiewaarden (y-as) uit te zetten ten opzichte van de overeenkomstige eiwitconcentratie van de verdunningen die zijn bereid in stap 22.1 in deze sectie (x-as).
    6. Bereken de totale hoeveelheid eiwit in de mitochondriale monsters door extrapolatie met de standaardcurve.

3. Bereiding van de respirometrische assays op basis van microplaten

  1. Hydrateer de respirometrische assaysensor ten minste 12 uur voor het experiment met 1 ml kalibratiebuffer per put. Incubeer bij 37 °C (geen CO2).
    OPMERKING: Gehydrateerde sensoren kunnen tot 72 uur worden gebruikt. De cartridge moet tijdens deze stap voorzichtig worden behandeld: als er iets de sensoren raakt, kan de meetgevoeligheid worden beïnvloed.
  2. Prechill de preparatieve centrifuge met de zwenkbak microplaatrotor en de bijbehorende microplaatadapters bij 4 °C.
  3. Schakel de computer in, open de analysesoftware en selecteer het gewenste protocol.
    OPMERKING: Er wordt een klik gehoord wanneer de software verbinding maakt met het zuurstofverbruiksmeetinstrument. De verwarmingssensor moet groen zijn en bij 37 °C voordat het experiment begint.
  4. Bereid de remmende oplossingen uit de in rubriek 1, stap 2, aangegeven voorraden volgens de uit te voeren test. Bereid voldoende volume voor elke oplossing. Zie tabel 1 en tabel 2 ter referentie.
  5. Voeg het juiste volume van elke inhibitor toe in elke poort, plaats de patroon in het meetinstrument voor zuurstofverbruik en start de kalibratie.
    OPMERKING: Het toevoegen van een remmer aan de cartridge en het plaatsen van de cartridge in het instrument duurt 15-20 minuten. Zorg ervoor dat de juiste cartridgeonderdelen zijn geïntroduceerd. Het deksel van de cartridge en de hydrobooster kunnen worden weggegooid terwijl de sensorcartridge en de plaats van het hulpprogramma nodig zijn.
  6. Centrifugeer de geconcentreerde mitochondriale suspensie van sectie 2, stap 21 bij 10.500 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  7. Resuspend de mitochondriale pellet in 100 μL van 1x CAM+BSA, 1x EFAM+BSA of 1x BOXM+BSA, afhankelijk van het uit te voeren protocol.
  8. Verdun het geconcentreerde mitochondriale monster verder tot een uiteindelijke concentratie van 0,2 μg/μl in het overeenkomstige testmedium.
  9. Zaad 50 μL van de suspensie (totaal 10 μg eiwit) per put in een vooraf geprechilleerde 24-well microplaat op ijs. Voeg geen mitochondriën toe in de achtergrondcorrectieputten; voeg alleen het bijbehorende testmedium toe. Bewaar de resterende mitochondriale suspensie bij -80 °C voor bepaling van de fragmentatiezuiverheid (figuur 3).
  10. Draai de microplaat in de voorgekookte preparatieve centrifuge op 2.000 × g gedurende 20 minuten bij 4 °C. Contragewicht om dienovereenkomstig te balanceren.
  11. Verwarm het resterende testmedium bij 37 °C tijdens het centrifugeren van microplaten.
  12. Laat na het centrifugeren de microplaat 5 minuten op de bank liggen om in evenwicht te brengen. Voeg 450 μL warm testmedium toe voor een eindvolume van 500 μL per put bij RT. Doe dit langzaam en voorzichtig en voeg het medium toe aan de wand van de putten om te voorkomen dat mitochondriën worden losgemaakt.
  13. Plaats de microplaat onmiddellijk in het zuurstofverbruiksmeetinstrument zonder deksel en start het protocol (tabel 3). Zorg ervoor dat de eerste stap een incubatie van 10 minuten is om de microplaat te laten opwarmen.
  14. Zodra het experiment is voltooid, verwijdert u de cartridge en microplaat, schakelt u het instrument uit en start u de analyse.

4. Analyse van de resultaten

  1. Voer in het geval van de CA- en BOX-assays de volgende analyses uit:
    1. Registreer niet-mitochondriale O2-consumptie , wat overeenkomt met het gemiddelde van de waarden verkregen na Antimycine A en rotenoninjectie.
      OPMERKING: Antimycine A en rotenon zijn respectievelijk complexe III- en I-remmers.
    2. Bereken de basale ademhaling door het niet-kathododrische O2-verbruik af te trekken van de basale waarden (meetpunten 1 en 2).
    3. Trek het niet-isochondriële O2-verbruik af van de waarden na de injectie van het complexe V-substraat ADP (injectie A) om mitochondriale toestand III te bepalen.
    4. Trek de niet-mitochondriale O2-consumptie af van de ademhalingswaarden na injectie van de complexe V-remmer oligomycine (injectie B) om mitochondriale toestand IVo te verkrijgen.
    5. Bereken mitochondriale toestand IIIu door het niet-mitochondriale O2-verbruik af te trekken van de ademhaling na FCCP-injectie (injectie C).
      OPMERKING: FCCP is een krachtige mitochondriale oxidatieve fosforyleringsontkoppeling. ATP-synthese wordt in zijn aanwezigheid omzeild en de ETC bereikt maximale activiteit.
    6. Trek basale ademhalingswaarden af van de mitochondriale toestand IIIu-waarden om mitochondriale reservecapaciteit te verkrijgen, wat de capaciteit is om extra ATP te genereren in geval van verhoogde energievraag.
    7. Deel mitochondriale toestand IIIu door toestand IVo-waarden om de respiratoire controleverhouding (RCR) te verkrijgen.
      OPMERKING: Negatieve of null RCR-waarden geven aan dat mitochondriale koppeling wordt beïnvloed.
  2. Voer met betrekking tot EFA de volgende berekeningen uit:
    1. Verkrijg restactiviteit door de gemiddelde waarde na rotenon en Antimycine A-injectie (injecties A en C) te berekenen.
    2. Bereken complexe I tot IV (CI-CIV) activiteit door restactiviteit af te trekken van de basale waarden (meetpunten 1 en 2).
    3. Trek restactiviteit af van de waarden na injectie van het CII-substraatsuccinaat (injectie B) om CII-CIII-CIV-activiteit te verkrijgen.
    4. Bereken de CIV-activiteit door de restactiviteit af te trekken van de waarden die worden verkregen na injectie van de cytochroom c-reducerende middelen, ascorbinezuur en TMPD (injectie D).
  3. Geef alle resultaten weer met behulp van staafdiagrammen, zoals in figuur 4, om de juiste conclusies te trekken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het hier gepresenteerde protocol maakt de in vivo analyse van mitochondriale ademhaling mogelijk door de isolatie van mitochondriën van de skeletspieren van muizen. Een overzicht van de methode is weergegeven in figuur 1. Na het ontleden van skeletspieren uit de achterpoten (figuur 2), worden weefsels gehomogeniseerd en mitochondriën gezuiverd, onder isotone omstandigheden, door seriële centrifubaties. De zuiverheid van de verschillende fracties verkreg...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Alle methoden die worden gebruikt om mitochondriale ademhaling te bestuderen, hebben hun beperkingen; daarom is het cruciaal om de methode te kiezen die het beste past bij een specifieke experimentele vraag. Dit werk biedt een bijgewerkt en gedetailleerd protocol om mitochondriën te isoleren van de skeletspieren van muizen om verschillende ademhalingstests uit te voeren om de mitochondriale functie te onderzoeken. Inderdaad, de studie van mitochondriale bio-energetica in geïsoleerde mitochondriën met behulp van microplaa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben om bekend te maken.

Dankbetuigingen

We willen Juan J. Tena bedanken voor het gebruik van de homogenisator en de CABD Proteomics en Veeteelt faciliteiten voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door het Spaanse ministerie van Onderwijs, Cultuur en Sport via fellowship FPU16/03264 aan J.D.H.C., de Association Française contre les Myopathies (AFM) via fellowship grant #22450 aan C.V.-G., een Institutional Grant MDM-2016-0687 (Maria de Maeztu Excellence Unit, Department of Gene Regulation and Morphogenesis bij CABD) en BFU2017-83150-P aan J.J.C. De Junta de Andalucía-subsidie P18-RT-4572, het FEDER-financieringsprogramma van de Europese Unie en het Spaanse ministerie van Wetenschap, Innovatie en Universiteiten verlenen RED2018-102576-T aan P.N.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
ADPSigmaA5285Voorraad bij -20 °C
AKT antibodyCell Signaling TechnologyC67E7Konijn (Gastheersoort)
anti-Goat HRPSigma401504Konijn (Gastheersoort)
anti-Mouse HRPCell Signaling#7076Paard (Gastheersoort)
Antimycin ASigmaA8674Voorraad bij -20 °C
anti-Rabbit HRPCell Signaling#7074Geit (Gastheersoort)
Ascorbic acidSigmaA5960Voorraad bij RT
Bactin antibodySigmaMBS4-48085Geit (Gastheersoort)
Bio-Rad Protein Assay Kit IIBio-Rad5000002Het bevat 5x Bradford-reagens en BSA met bekende concentratie voor de standaardcurve
BSA, fraction V, Fatty Acid-FreeCalbiochem126575Voorraad bij 4 °C
C tubeMiltenyi Biotec130-093-237Paarse deksel
Calnexin antibodyThermoFisherMA3-027Muis (Gastheersoort)
D-mannitolSigmaM4125Voorraad bij RT
EDTABDH280254DVoorraad bij 4 °C
EGTASigmaE-4378Voorraad bij RT
FCCPSigmaC2920Voorraad bij -20 °C
gentleMACS DissociatorMiltenyi Biotec130-093-235Homogenisator
HEPESSigmaH3375Voorraad bij RT
HSP70 antibodyProteintech10995-1-APKonijn (Gastheersoort)
LDH-A antibodySanta Cruz BiotechnologySC27230Geit (Gastheersoort)
Magnesium chlorideChemCruzsc-255260AVoorraad bij RT
Malic acidSigmaP1645Voorraad bij RT
Microplate spectrophotometerBMG LABTECH GmbHPOLARstar OMEGA S/N 415-0292Voorraad bij RT
Milli-Q waterMillipore systemF7HA17757AUltrapuur water
mtTFA antibodySanta Cruz BiotechnologySC23588Geit (Gastheersoort)
Na+/K+-ATPase α1 antibodyNovus BiologicalsNB300-14755Muis (Gastheersoort)
OligomycinSigmaO4876Voorraad bij -20 °C
Palmitoyl-L-carnitineSigmaP1645Voorraad bij -20 °C
PBS tabletsSigmaP4417-100TAB1x voorraad bij RT
Potassium dihydrogen phosphateChemCruzsc-203211Voorraad bij RT
Potassium hydroxideSigma60377Voorraad bij RT
Pyruvic acidSigma107360Voorraad bij 4 °C
RotenoneSigmaR8875Voorraad bij -20 °C
Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzerAgilent Technologies420179XFe24 model
Seahorse XFe24 FluxPak miniAgilent Technologies102342-100De kit bevat cartridges, microplates en kalibratieoplossing
SuccinateSigmaS7626Voorraad bij RT
SucroseSigmaS9378Voorraad bij RT
TIMM23 antibodyAbcamab230253Konijn (Gastheersoort)
TMPDSigmaT7394Voorraad bij -20 °C
TOMM20 antibodyAbcamab56783Muis (Gastheersoort)
VDAC antibodyAbcamab15895Konijn (Gastheersoort)
```

Referenties

  1. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  2. Alberts, B., et al. The mitochondrion. Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , Garland Science. New York. (2002).
  3. Turunen, M., Olsson, J., Dallner, G. Metabolism and function of coenzyme Q. Biochimica et Biophysica Acta. 1660 (1-2), 171-199 (2004).
  4. Alcázar-Fabra, M., Trevisson, E., Brea-Calvo, G. Clinical syndromes associated with coenzyme Q10 deficiency. Essays in Biochemistry. 62 (3), 377-398 (2018).
  5. Banerjee, R., Purhonen, J., Kallijärvi, J. The mitochondrial coenzyme Q junction and complex III: biochemistry and pathophysiology. The FEBS Journal. , (2021).
  6. Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews. Disease Primers. 2, 16080(2016).
  7. Villalba, J. M., Navas, P. Regulation of coenzyme Q biosynthesis pathway in eukaryotes. Free Radical Biology & Medicine. 165, 312-323 (2021).
  8. Li, Z., Graham, B. H. Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode. Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).
  9. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS One. 6 (7), 21746(2011).
  10. Pala, F., et al. Distinct metabolic states govern skeletal muscle stem cell fates during prenatal and postnatal myogenesis. Journal of Cell Science. 131 (14), 212977(2018).
  11. Shintaku, J., et al. MyoD regulates skeletal muscle oxidative metabolism cooperatively with alternative NF-ĸB. Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).
  12. Li, R., et al. Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles. The Journal of Physiology. 594 (24), 7197-7213 (2016).
  13. Schuh, R. A., Jackson, K. C., Khairallah, R. J., Ward, C. W., Spangenburg, E. E. Measuring mitochondrial respiration in intact single muscle fibers. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (6), 712-719 (2012).
  14. Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).
  15. Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells. Methods in Molecular Biology. 946, 431-468 (2013).
  16. Shintaku, J., Guttridge, D. C. Analysis of aerobic respiration in intact skeletal muscle tissue by microplate-based respirometry. Methods in Molecular Biology. 1460, 337-343 (2016).
  17. Bharadwaj, M. S., et al. Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52350(2015).
  18. Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452(2011).
  19. Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).
  20. Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
  21. Das, K. C., Muniyappa, H. Age-dependent mitochondrial energy dynamics in the mice heart: role of superoxide dismutase-2. Experimental Gerontology. 48 (9), 947-959 (2013).
  22. Aw, W. C., Bajracharya, R., Towarnicki, S. G., Ballard, J. W. O. Assessing bioenergetic functions from isolated mitochondria in Drosophila melanogaster. Journal of Biological Methods. 3 (2), 42(2016).
  23. Sakamuri, S. S. V. P., et al. Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 analyzer: applications for aging research. Gerontology. 40 (3), 347-356 (2018).
  24. Boutagy, N. E., Pyne, E., Rogers, G. W., Ali, M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217(2015).
  25. Sperling, J. A., et al. Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies. Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).
  26. Boutagy, N. E., Rogers, G. W., Pyne, E. S., Ali, M. M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53216(2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Isolatie van mitochondriazuurstofverbruikelektronentransportketenmitochondri le respiratieseri le centrifugatieeiwitkwantificatieblue native elektroforesemarkers voor het mitochondri le membraan
Isolatie van mitochondriën uit de skeletspieren van muizen voor respirometrische assays
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.