Opname gap junction stroom van Xenopus Oocyten

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om gap junction-eiwitten in Xenopus-eicellen tot expressie te brengen en junctionele stroom tussen twee geapofesteerde eicellen te registreren met behulp van een commerciële versterker die is ontworpen voor dubbele oöcytspanningsklemopnamen in een hoge zijstroommeetmodus.

Samenvatting

Heterologe expressie van connexinen en innexinen in Xenopus-eicellen is een krachtige benadering voor het bestuderen van de biofysische eigenschappen van gap junctions (GI's). Deze aanpak is echter technisch uitdagend omdat het een differentiële spanningsklem vereist van twee tegenover elkaar staande eicellen die een gemeenschappelijke basis delen. Hoewel een klein aantal laboratoria erin is geslaagd deze techniek uit te voeren, hebben ze in wezen allemaal zelfgemaakte versterkers of commerciële versterkers gebruikt die zijn ontworpen voor opnames met één eicel. Het is vaak een uitdaging voor andere laboratoria om deze techniek te implementeren. Hoewel een hoge zijstroommeetmodus is opgenomen in een commerciële versterker voor dubbele oöcytspanningsklemopnamen, was er tot onze recente studie geen rapport voor de toepassing ervan. We hebben de benadering van het meten van hoge zijstromen praktischer en handiger gemaakt door verschillende technische wijzigingen te introduceren, waaronder de constructie van een magnetisch gebaseerd opnameplatform dat nauwkeurige plaatsing van eicellen en verschillende elektroden mogelijk maakt, gebruik van de badoplossing als geleider in spannings differentiële elektroden, goedkeuring van een commerciële KCl-elektrode met lage lekkage als referentie-elektrode, fabricage van stroom- en spanningselektroden uit dunwandige glazen haarvaten en positionering van alle elektroden met behulp van magnetisch gebaseerde apparaten. De hier beschreven methode maakt handige en robuuste opnames van junctionele stroom (I_j) tussen twee tegengestelde Xenopus-eicellen mogelijk.

Inleiding

GJs zijn intercellulaire kanalen die de stroomstroom en uitwisseling van kleine cytosolische moleculen tussen naburige cellen mogelijk maken. Ze bestaan in vele celtypen en vervullen verschillende fysiologische functies. Js bij gewervelde dieren worden gevormd door connexinen, terwijl die bij ongewervelde dieren worden gevormd door innexinen. Elke GJ bestaat uit twee naast elkaar geplaatste hemichannels met 6 of 8 subeenheden per hemikanaal, afhankelijk van of het connexinen of innexinen^{zijn 1,2,3}. Mensen hebben 21 connexinegenen⁴, terwijl de veelgebruikte ongewervelde modellen C. elegans en Drosophila melanogaster respectievelijk 25 en 8 innexinegenen hebben, respectievelijk ^5,6. Alternatieve splicing van gentranscripten kan de diversiteit van GJ-eiwitten verder verhogen, althans voor innexinen ^7,8.

GI's kunnen worden onderverdeeld in drie categorieën op basis van moleculaire samenstellingen: homotypisch, heterotypisch en heteromeer. Een homotypische GJ heeft al zijn subeenheden die identiek zijn. Een heterotypische GJ heeft twee homomere hemichannels, maar de twee hemichannels worden gevormd door twee verschillende GJ-eiwitten. Een heteromere GJ bevat ten minste één heteromeer hemikanaal. De moleculaire diversiteit van GI's kan verschillende biofysische eigenschappen verlenen die belangrijk zijn voor hun fysiologische functies. GJ biofysische eigenschappen worden ook gemoduleerd door regulerende eiwitten⁹. Om te begrijpen hoe GI's hun fysiologische functies uitvoeren, is het belangrijk om hun moleculaire samenstellingen, biofysische eigenschappen en de rol van regulerende eiwitten in hun functies te kennen.

Heterologe expressiesystemen worden vaak gebruikt om biofysische eigenschappen van ionkanalen, waaronder GI's, en de effecten van regulerende eiwitten daarop te bestuderen. Omdat heterologe expressiesystemen de expressie van specifieke eiwitten mogelijk maken, zijn ze over het algemeen beter vatbaar voor het ontleden van eiwitfuncties dan inheemse weefsels, waar eiwitten met redundante functies de analyse kunnen bemoeilijken en registratie van I_j onbereikbaar kan zijn. Helaas zijn de meest gebruikte cellijnen behalve de Neuro-2A-cel niet geschikt voor het bestuderen van GJ biofysische eigenschappen als gevolg van complicaties door endogene connexinen. Zelfs Neuro-2A-cellen zijn niet altijd geschikt voor dit soort analyses. We konden bijvoorbeeld geen I_j detecteren in Neuro-2A-cellen getransfecteerd met de innexinen UNC-7 en UNC-9 in afwezigheid of aanwezigheid van UNC-1 (ongepubliceerd), wat nodig is voor de functie van UNC-9 GI's in C. elegans ^9,10. Aan de andere kant zijn Xenopus-eicellen een nuttig alternatief systeem voor elektrofysiologische analyses van GI's. Hoewel ze een endogene GJ-eiwit tot expressie brengen, connexine 38 (Cx38)¹¹, kunnen mogelijke complicaties gemakkelijk worden vermeden door een specifiek antisense oligonucleotide¹² te injecteren. Analyses van JS met Xenopus-eicellen vereisen echter een differentiële spanningsklem van twee naast elkaar geplaatste cellen, wat technisch uitdagend is. De vroegste successen van dubbele spanningsklem van kikkerblastomeren werden ongeveer 40 jaar geleden gemeld ^13,14. Sindsdien hebben veel studies deze techniek gebruikt om I_j vast te leggen in gepaarde Xenopus-eicellen. In wezen zijn echter alle voorgaande studies uitgevoerd met zelfgemaakte versterkers 12,15,16 of commerciële versterkers ontworpen voor opnames op enkele eicellen (GeneClamp 500, AxoClamp 2A of AxoClamp 2B, Axon Instruments, Union City, CA)8,17,18,19,20 . Omdat zelfs de commerciële versterkers geen instructies geven voor dubbele eicelspanningsklem, is het vaak een uitdaging voor nieuwe of minder geavanceerde elektrofysiologische laboratoria om deze techniek te implementeren.

Er is slechts één commerciële versterker ontwikkeld voor dubbele eicelspanningsklem, de OC-725C van Warner Instruments (Table of Materials, Figuur 1A). Deze versterker kan worden gebruikt in een standaardmodus (voor enkele eicellen) of een hoge zijstroommeetmodus (voor enkele of dubbele eicellen), afhankelijk van of er twee stopcontacten in de spanningsonde zijn aangesloten (figuur 1B, C). Tot onze recente studie⁷ was er echter geen enkele publicatie geweest die het gebruik van deze versterker in zijn hoge zijstroommeetmodus beschreef. Hoewel de versterker door een ander laboratorium is gebruikt voor dubbele eicelopnamen, werd deze gebruikt in de standaard in plaats van de hoge zijmodus^21,22. Dit gebrek aan rapporten met behulp van de versterker in de hoge zijstroommeetmodus kan te wijten zijn aan technische problemen. We waren niet in staat om stabiele dubbele eicelopnamen te verkrijgen met behulp van de hoge zijmodus door de instructies van de fabrikant te volgen. In de loop der jaren hebben we drie verschillende benaderingen voor dubbele eicelopnamen geprobeerd, waaronder het gebruik van twee OC-725C-versterkers in de hoge zijstroommeetmodus, twee OC-725C-versterkers in de standaardmodus en twee versterkers van een andere fabrikant. Uiteindelijk is het ons gelukt om pas met de eerste aanpak na uitgebreid vallen en opstaan stabiele opnames te behalen. Deze publicatie beschrijft en demonstreert de procedures die we gebruiken om GJ-eiwitten in Xenopus-eicellen tot expressie te brengen, I_j te registreren met behulp van de hoge zijstroommeetmodus en de elektrofysiologische gegevens te analyseren met behulp van populaire commerciële software. Aanvullende informatie over de dubbele spanningsklemtechniek is te vinden in andere publicaties^19,23.

Protocol

De operaties worden uitgevoerd volgens een protocol dat is goedgekeurd door de institutionele dierverzorgingscommissie van de University of Connecticut School of Medicine.

1. Kikkerchirurgie en bereiding van gedefollicueerde eicellen

1. Verdoof een volwassen vrouwelijke Afrikaanse klauwkikker (Xenopus laevis) (Table of Materials) door onder te dompelen in een koele (met ijs) tricaïne-oplossing (~ 300 mg / L).
2. Wacht (~ 15 min) totdat de kikker weinig of geen reactie vertoont op het knijpen van zijn zwemvliezen. Leg de kikker op een operatietafel met zijn buik naar boven gericht.
3. Na een longitudinale incisie (8-10 mm lang) op de linker- of rechteronderbuik, trekt u voorzichtig een klein stukje eierstokweefsel uit met een tang en snijdt u het eierstokweefsel vrij met een kleine schaar.
4. Dompel het vrije eierstokweefsel onmiddellijk onder in een Ca²⁺-vrije ND96-oplossing (NaCl 99 mM, KCl 2 mM, MgCl₂ 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7,5) in een petrischaaltje van 60 mm.
5. Na het sluiten van de incisie door eenvoudige onderbroken hechtingen met behulp van een 5-0 zijden hechtdraad (Tabel van materialen), plaatst u de kikker terug in een ondiep waterreservoir voor herstel.
   OPMERKING: De incisie wordt in twee stappen gesloten: eerst de peritoneale en spierlagen en vervolgens de huidlaag. Elke kikker wordt onderworpen aan 5 operaties met een interval van ten minste 4 weken tussen twee opeenvolgende operaties.
6. Breng het geïsoleerde eierstokweefsel over in een centrifugebuis van 50 ml met 10 ml Ca²⁺-vrije ND96-oplossing met 20 mg collagenase (materiaaltabel) en 20 mg hyaluronidase (materiaaltabel).
7. Schud de buis op een orbitale shaker bij kamertemperatuur (RT) totdat alle eicellen geïsoleerd zijn (solitair).
8. Breng daarna 30-50 eicellen over naar een petrischaaltje met behulp van een glazen Pasteur-pipet en onderzoek de eicellen regelmatig onder een stereomicroscoop (≥25x hoogste vergrotingsvermogen) om te bepalen of ze zijn gedefolliculeerd.
   OPMERKING: De Pasteur pipet moet worden "gesneden" naar een bredere puntopening met behulp van een diamantscribent (Table of Materials) en worden gevlamd om de snijkant glad te strijken.
9. Zodra 70% -80% van de eicellen zijn gedefolliculeerd, decanteert u de enzymoplossing door de buis voorzichtig te kantelen. Was de eicellen 5 keer door de buis te vullen met ND96-oplossing (NaCl 96 mM, KCl 2 mM, CaCl₂ 1,8 mM, MgCl₂ 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7,5) en de oplossing te decanteren.
10. Breng na de laatste wasbeurt de eicellen over in een petrischaaltje van 60 mm met ND96-oplossing. Pluk en breng grote en gezond uitziende eicellen over naar een petrischaaltje van 60 mm met ND96-oplossing aangevuld met natriumpyruvaat (2 mM) en penicilline-streptomycine (100 U / ml) met behulp van een pasteurpipet van schoon glas.
    OPMERKING: "grote en gezond uitziende eicellen" zijn die van stadia V en VI die geen tekenen van oververtering door de enzymen vertonen.
11. Plaats de petrischaal met de geplukte eicellen in een milieukamer (15-18 °C).

2. GJ-eiwitexpressie

1. Synthetiseer complementair RNA (cRNA) van een specifiek connexine of innexine in vitro met behulp van een RNA-transcriptiekit (Table of Materials) volgens het protocol van de fabrikant.
2. Precimeer het cRNA met behulp van een lithiumchloridemethode die wordt beschreven in de gebruikershandleiding van de RNA-transcriptiekit.
3. Was de pellet met 70% ethanol, los deze op in 20 μL nucleasevrij H₂O en voeg 1 μL ribonucleaseremmer (40 E, Tabel van materialen) toe.
4. Meet de concentratie van het cRNA met behulp van een spectrofotometer (Table of Materials).
5. Meng het cRNA met een Cx38 antisense oligo zodat de uiteindelijke concentraties 200-1.000 ng/μL cRNA en 100 ng/μL oligo zijn.
   OPMERKING: De oligosequentie is 5′-GCTTTAGTAATTCCCATCCTGCCATGTTTC-3′, wat overeenkomt met de nucleotiden van -5 tot +25 in Xenopus laevis Cx38 mRNA (NCBI Accession: NM_001088018)¹¹. Het oligo wordt bewaard als een stamoplossing (2,0 mg/ml) voordat het wordt gemengd met het cRNA.
6. Elimineer deeltjes in het cRNA door gedurende 2 minuten in een microcentrifuge (~ 16.000 x g) te draaien en breng snel het hele supernatant over naar een nieuwe buis door pipetteren (vermijd verstoring van de bodem van de microcentrifugebuis).
7. Verdeel het cRNA in aliquots (2,5 μL/injectieflacon) en bewaar de aliquots in een vriezer van -80 °C.
8. Bereid een eicelinjectieschaal door een klein stukje (~ 1 cm x 1 cm) nylon gaas (Table of Materials) op de bodem van een petrischaaltje van 35 mm te lijmen met behulp van een snelhardende epoxylijm.
   OPMERKING: De eicelinjectieschaal is herbruikbaar. Was het na elk gebruik met 70% ethanol.
9. Vul de eicelinjectieschaal ongeveer halverwege met ND96-oplossing (aangevuld met pyruvaat en penicilline-streptomycine).
10. Plaats 25-30 eicellen in rijen in de petrischaal.
11. Bereid glazen micropipettes voor eicelinjecties door de instructies in de gebruikershandleiding van de geautomatiseerde nanoliterinjector (Materiaaltabel) te volgen.
    OPMERKING: Het gebruik van een micro-elektrode-afschuiner (Tabel van materialen) kan helpen bij het produceren van scherpe injectiemicropipettes die minimale schade aan eicellen veroorzaken.
12. Vul een injectie micropipette op met lichtgewicht minerale olie en plaats deze in de micropipettehouder van de injector.
13. Breng het cRNA van een van de opgeslagen aliquots over naar het binnenoppervlak van een petrischaaldeksel of bodem door te pipetteren.
14. Zuig de cRNA-druppel in de punt van de micropipette door op de FILL-knop in de injectorcontroller te drukken.
15. Injecteer het cRNA (~50 nL/eicel) door op de INJECT-knop te drukken.
    OPMERKING: Het injectievolume kan worden ingesteld door de dipschakelaars in de injectorregelaar.
16. Breng de geïnjecteerde eicellen over naar een nieuwe petrischaal met ND96-oplossing (aangevuld met pyruvaat en penicilline-streptomycine) en bewaar ze gedurende 1-3 dagen in de milieukamer (15-18 °C) (afhankelijk van de snelheid en het niveau van de GJ-eiwitexpressie). Vervang de oplossing dagelijks door de eicellen over te brengen naar een nieuwe petrischaal.

3. Eicelparen

1. Breng enkele van de geïnjecteerde eicellen over in een petrischaaltje van 35 mm met ND96-oplossing.
2. Gebruik twee fijne pincetten (Table of Materials) om het transparante vitelline-membraan dat de eicel omwikkelt voorzichtig af te pellen.
   OPMERKING: Het kan nodig zijn om de pincetpunten te slijpen voor het eerste gebruik en van tijd tot tijd, met behulp van een stuk fijn (600 Grit) schuurpapier.
3. Plaats 2 eicellen per putje in een eicelparenkamer (figuur 1D) met ND96-oplossing (aangevuld met pyruvaat en penicilline-streptomycine).
   OPMERKING: De eicelparenkamer wordt geconstrueerd door een klein stukje van een Microwell Minitray (Table of Materials) op de bodem van een petrischaaltje van 35 mm (Table of Materials) te lijmen met behulp van een snel uithardende epoxylijm. De Minitray wordt in kleine stukjes gesneden met behulp van een hete draadsnijder (Table of Materials). Het gebruik van de Minitray voor eicelparen werd oorspronkelijk beschreven door anderen²⁴. Hoewel een GJ-eiwit zich niet-uniform in het eicelmembraan kan verdelen, afhankelijk van de ladingseigenschappen van aminozuurresiduen in zijn cytosolische domeinen²⁵, lijkt willekeurige paring (zonder onderscheid te maken tussen de dierlijke en plantaardige polen van de eicel) in het algemeen voldoende te zijn.
4. Bewaar de petrischaal met gepaarde eicellen bij RT op de isolatietafel voor gebruik voor elektrofysiologische opnamen.
   OPMERKING: De koppelingsduur kan variëren van enkele uren tot één dag. Een handige oefening is om eicellen in de late namiddag te paren en de volgende dag van hen op te nemen.

4. Voorbereiding van het acquisitiesysteem

1. Configureer twee OC-725C eicelklemversterkers (Materiaaltabel) naar de hoge zijstroommeetmodus door een interne dipschakelaar aan te passen (figuur 1B).
2. Aard de versterkers door eerst de Ground Circuit-aansluitingen op de achterpanelen met elkaar te verbinden en vervolgens verbinding te maken met de kooi van Faraday en het vezellicht dat wordt gebruikt voor het verlichten van de opnamekamer.
3. Sluit de versterkers aan op een analoog-naar-digitaal signaalomvormer (Materiaaltabel) en configureer ze in de Clampex-module van de pClamp-software (Materiaaltabel) volgens instructies van de fabrikant van de versterker.
4. Test het acquisitiesysteem met de modelcel die bij de versterker is geleverd.
   1. Sluit de V_DIFF-sonde en stroomkabels (I) aan op de modelcel, sluit de rode en zwarte aansluitingen in de V_DIFF-sonde aan op de meegeleverde jumper, sluit beide poten van de jumper aan op een van beide pinnen in de modelcel en sluit de aardingsdraad in de modelcel aan op de kabel van de GROUNDS CIRCUIT-aansluiting van de versterker (figuur 1E).
   2. Nul de spanningselektrode (Vm) en badelektrode (Im) meters van de versterker door respectievelijk de Vm OFFSET- en Ve OFFSET-knoppen te draaien, schakel klem van UIT naar snel of LANGZAAM en draai de GAIN-wijzerplaat met de klok mee naar een niveau dat de juiste spanningsklem mogelijk maakt (figuur 1A). De D.C. GAIN-schakelaar kan zich in de OUT- of de IN-stand bevinden.
   3. Voer een eenvoudig acquisitieprotocol uit met een paar spanningsstappen om te bevestigen dat de spanning die wordt weergegeven in de Vm-meter verandert volgens het acquisitieprotocol en dat spannings- en stroomsporen correct worden weergegeven in Clampex.
      OPMERKING: Met deze aanpak kan slechts één versterker per keer worden getest.

5. Opname I_j tussen gepaarde eicellen

1. Maak acquisitieprotocollen voor het opnemen _{van I j} in de pClamp-software.
   OPMERKING: Maak twee acquisitieprotocollen. In een van hen wordt versterker # 1 gebruikt om een reeks membraanspanning (V_m) stappen te produceren (bijv. -150 tot +90 mV met intervallen van 10 mV), terwijl versterker # 2 wordt gebruikt om een constante V_m (bijv. -30 mV) te handhaven. In het andere protocol wordt versterker # 2 gebruikt om de V_m-stappen te produceren, terwijl versterker # 1 wordt gebruikt om de constante V_m te behouden. De positieve en negatieve V_m-stappen moeten als alternatief worden toegepast (bijv. -150, +90, -140, +80 ......), die in Clampex kunnen worden geprogrammeerd met behulp van de gebruikerslijstfunctie in het acquisitieprotocol.
2. Het opnamestadium instellen
   1. Laat een petrischaal met gepaarde eicellen in de petrischaal in het opnameplatform vallen (figuur 2A)
   2. Selecteer een paar eicellen en draai de petrischaal indien nodig zodat de twee eicellen zich in de linker- en rechterrichting bevinden en vergrendel het stadium in positie door de magnetische basis.
   3. Bevestig de magnetische standaards die de stroom- en spanningsondes op de juiste plaatsen op de isolatietafel houden.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de stroom- en spanningsondes van de ene versterker zich aan de linkerkant bevinden, terwijl die van de andere versterker zich aan de rechterkant bevinden en dat de spanningsonde zich aan elke kant voor de stroomsonde bevindt (figuur 2B, C).
3. De referentie-elektrode instellen
   1. Plaats een referentie-elektrode (Tabel met materialen) in de buurt van de rand van de petrischaal naar de gebruikerszijde (figuur 2B, C).
   2. Sluit de referentie-elektrode aan op de zwarte aansluiting (Circuit Ground) in slechts één van de twee V_DIFF-sondes .
4. De V_{DIFF-elektroden} instellen
   1. Trek aan een paar glazen micropipettes, breek een beetje van de punt af met de diamantscribent (Table of Materials) en maak de puntrand glad door vuur te polijsten.
      OPMERKING: De tipweerstand moet minder dan 150 kΩ zijn (gemeten met ND96 in de pipet). Meestal worden micropipettes met een tipweerstand van 20-150 kΩ gebruikt.
   2. Houd de micropipette boven de vlam van een alcoholbrander om deze in een gladde hoek (~ 130 °) te buigen op een positie van ~ 1 cm van de punt.
      OPMERKING: Gefabriceerde micropipettes zijn herbruikbaar. Spoel ze na elk gebruik af met water.
   3. Vul de glazen pipet volledig op met ND96-oplossing, plaats deze in een voorgevulde (met ND96) micro-elektrodehouder (Materiaaltabel, figuur 2D) en zorg ervoor dat er geen luchtbellen in het systeem aanwezig zijn.
   4. Steek de 2 mm-pen van de micro-elektrodehouder in de 2 mm-aansluiting van een V_{DIFF-elektrodeverbindingsdraad} (figuur 2D).
   5. Klem de 2 mm-aansluiting op een magnetisch gebaseerde klemklem (figuur 2D) en richt de punt van de V_{DIFF-elektrode} op een van de twee eicellen (figuur 2E).
      OPMERKING: Pas de positie en hoek van de klem aan zodat de punt van de elektrode zeer dicht bij de eicel ligt
   6. Steek de 1 mm-pin van de V_{DIFF-elektrode-aansluitdraad} in de rode aansluiting (V_DIFF-ingang ) in de V_DIFF-sonde aan dezelfde kant.
   7. Bereid een V_{DIFF-elektrode} voor de andere eicel en versterker voor en sluit deze aan volgens vergelijkbare procedures.
      OPMERKING: Een close-up van een paar eicellen en alle elektroden zijn weergegeven in figuur 2E.
5. De stroom- en spanningselektroden instellen
   1. Bereid spannings- en stroomelektroden voor uit glazen haarvaten, vul ze (ongeveer halverwege) op met een KCl-oplossing (KCl 3,0 M, EGTA 10 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4 met KOH) en plaats ze in de elektrodehouders die bij de versterkers zijn geleverd.
      OPMERKING: De elektroden moeten een weerstand van ~1 MΩ hebben. Geschikte elektroden kunnen worden verkregen uit een soort dunwandige glazen haarvaten (Tabel van materialen) met behulp van een specifieke set trekparameters (tabel 1). Dergelijke tips kunnen gemakkelijk het eicelmembraan binnendringen zonder dat u op de Vm- of ve BUZZ-knop op de versterker hoeft te drukken.
   2. Laat de elektroden in de badoplossing zakken, nul de Vm- en Im-meters door aan de Vm OFFSET - en Ve OFFSET-wijzerplaten te draaien en controleer de elektrodeweerstand door op Vm Electrode Test en Ve Electrode Test te drukken.
   3. Plaats de stroom- en spanningselektroden in de eicellen en observeer negatieve membraanpotentialen (meestal -20 tot -50 mV).
      OPMERKING: De Vm- en Im-meters van dezelfde versterker moeten twee identieke of zeer vergelijkbare waarden weergeven.
6. Data-acquisitie
   1. Controleer in het klemgedeelte van de versterker dat D.C. GAIN zich in de IN-positie bevindt, draai de GAIN-knop met de klok mee naar een niveau dat de juiste spanningsklem mogelijk maakt (meestal een derde tot de helft van het volledige bereik) en draai de klemschakelaar van UIT naar SNEL.
      OPMERKING: Bij het inschakelen van de klem geven de Vm- en Im-meters respectievelijk de houdspanning en de vasthoudstroom weer. Hoewel de houdstroom enigszins kan variëren, afhankelijk van de omstandigheden van de eicellen, is deze over het algemeen klein en stabiel op het bedrijf V_m (bijv. -30 mV).
   2. Voer een acquisitieprotocol uit.
      OPMERKING: Er worden vier sporen op het scherm weergegeven. De spannings- en stroomsporen van de ene versterker geven de Vm-stappen aan die worden toegepast op eicel #1 en de stroom die nodig is om de Vm-stappen te produceren, terwijl die van de andere versterker de constante Vm (-30 mV) van eicel #2 aangeven, en de stroom die wordt geïnjecteerd om deze constante Vm te behouden. De stroom geïnjecteerd in eicel #2 vertegenwoordigt de I_j.

6. Data-analyse

1. Analyse met Clampfit.
   1. Open een opgenomen abf-bestand in de Clampfit-module van pClamp.
   2. Gebruik cursor 1 en 2 om een segment van de basislijn in te sluiten vóór de I_{j-traceringen} .
   3. Klik op het pictogram Basislijn aanpassen om een basislijnvenster te openen. Selecteer Gemiddelde van cursors aftrekken 1..2 voor Methode en controleer of Alle zichtbare signalen en Alle zichtbare sporen zijn geselecteerd voor Traceerselectie.
   4. Wanneer u op OK klikt, wordt het venster Basislijn gesloten, de basislijnen van alle stroom- en spanningssporen komen samen op het nulniveau. Merk op dat de spanningsstappen veranderen naar nieuwe niveaus die gelijk zijn aan de oorspronkelijke spanning minus de houdspanning (bijv. -30 mV).
   5. Om de I_j - en V_j-relatie te plotten met behulp van steady-state I_j, omsluit een gewenst segment van de I_j-sporen die steady-state I_j vertegenwoordigen met cursors 1 en 2, plaats cursor 3 ergens binnen het tijdvenster van de spanningsstappen.
   6. Ga naar Analyseren / Snelle grafiek / I-V om een I-V-venster te openen.
   7. Selecteer onder X-as (spanning) cursor 3 van Signaal, geef het spanningstapsignaal (bijvoorbeeld Spanning 1) op in het vervolgkeuzemenu en vink het vakje Omkeren aan.
      OPMERKING: Het vakje Omkeren is aangevinkt om de V_m om te zetten in waarden die gelijk zijn aan V_j, die wordt gedefinieerd als V_m eicel #2-V_m eicel #1.
   8. Selecteer onder Y-as (stroom) de bron van het I_j-signaal (bijvoorbeeld Huid 0) in het vervolgkeuzemenu naast Signaal, definieer Regio als Cursors 1..2 in het vervolgkeuzemenu en selecteer Gemiddelde.
      OPMERKING: Om piek I_j - en V_j-relaties te plotten, moeten cursors 1 en 2 het segment van I_j-sporen omsluiten dat de piek I_j in stap 6.1.5 bevat en Piek (in plaats van Gemiddelde) selecteren in stap 6.1.8.
   9. Selecteer onder Bestemmingsoptie de optie Vervangen of Toevoegen.
   10. Wanneer u in het I-V-venster op OK klikt, wordt een I_j - V_j-relatie op het scherm weergegeven en kunnen de bijbehorende I_j- en V_j-waarden worden gevonden door op Venster / Resultaat te klikken.
2. Plot en pas de G_{j-V j-relatie} in OriginPro (Tabel met materialen)
   1. Kopieer de twee kolommen met V_j - en I_j-waarden uit het resultatenvenster van Clampfit (stap 6.1.10) naar een nieuwe werkmap in Origin. Zorg ervoor dat de waarden V_j en I_j zich onder respectievelijk de kolommen X en Y bevinden.
   2. Voeg vier nieuwe kolommen toe aan de werkmap door op Kolom/Nieuwe kolommen toevoegen te klikken.
   3. Geef de eerste nieuwe kolom een naam als G_j, vul deze in door de vergelijking "kolom I_j/kolom V_j * 1.000" in te voeren in het venster Kolomwaarden instellen en maak een spreidingsdiagram van de G_{j-V j-relatie}.
      OPMERKING: De vermenigvuldiging met 1.000 (optioneel) is om het ongemak van het omgaan met zeer kleine aantallen in volgende stappen te voorkomen.
   4. Plaats de G_{j-gegevenspunten} over het negatieve en positieve V_j-bereik onafhankelijk van de Boltzmann-functie. Bereken G_j bij V_j = 0 mV door de G_jmax-, G_jmin-, A- en V_0-waarden van de aanpassing in de Boltzmann-vergelijking in te voeren, wat in een spreadsheet kan worden gedaan. De aldus verkregen G_j zal in de volgende stap als G_jmax worden gebruikt.
      OPMERKING: De vergelijking die past bij de Boltzmann-functie is: G_j = (G_{jmax-G jmin})/{1 + exp[A(V_{j-V 0})]} + G_jmin, waarbij V₀ de V_j is waarbij de geleiding halfmaximaal is, G_jmax de maximale geleiding, G_jmin de V_j-ongevoelig restgeleiding²³. Om de fitting uit te voeren, voegt u eerst de Boltzmann-vergelijking als een nieuwe aanpasfunctie toe aan OriginPro en selecteert u vervolgens deze functie voor montage. Voer geschatte zaadwaarden in voor de G_jmax, G_jmin, V₀ en A voordat u de aanpassingsfunctie uitvoert. Zorg ervoor dat de G _{jmax-parameter} niet is vastgesteld voor deze fitting.
   5. Noem de tweede en derde nieuwe kolom nGj-L en nGj-R ("n" voor "genormaliseerd") en vul ze op door de kolom G_j te delen door de G_jmax-waarden die zijn afgeleid van respectievelijk de linker- en rechter G_j - V_j-curven (stap 6.2.4).
   6. Geef de vierde nieuwe kolom een naam als nGj-LR en vul deze in door waarden te kopiëren uit het negatieve en positieve V_j-bereik van respectievelijk de kolommen nGj-L en nGj-R.
   7. Maak een spreidingsdiagram voor nGj-LR over V_j en pas de gegevenspunten over het negatieve en positieve V_j-bereik onafhankelijk van elkaar aan op de Boltzmann-functie. Zorg ervoor dat de G _{jmax-parameter} is vastgesteld op 1,0 voor de fitting.
   8. Houd de montageresultaten bij (bijv. de aangebrachte grafiek en de G_jmin-, V₀- en A-waarden ).

Resultaten

UNC-7 en UNC-9 zijn innexinen van C. elegans. Terwijl UNC-9 slechts één isovorm heeft, heeft UNC-7 meerdere isovormen die voornamelijk verschillen in de lengte en aminozuurvolgorde van hun aminoterminals ^7,8. Deze innexinen kunnen zowel homotypische als heterotypische (van UNC-7 en UNC-9) GI's vormen wanneer ze worden uitgedrukt in Xenopus-eicellen ^7,8. Representatieve I_j-sporen...

Discussie

Systeemoptimalisatie lijkt noodzakelijk te zijn voor experimenten met dubbele oöcytspanningsklem. Zonder dit kunnen opnames zeer onstabiel zijn en moeten de versterkers mogelijk een overmatige hoeveelheid stroom injecteren om de doel-Vm te bereiken, wat resulteert in oöcytschade en opnamefouten. Verschillende factoren zijn van cruciaal belang voor het verkrijgen van stabiele dubbele eicelopnamen met de hoge zijstroommeetmethode. Ten eerste moeten de stroom- en spanningselektroden de juiste weerstand hebben (~ 1 ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Agar Bridge Magnetic Holder	ALA Scientific Instruments	MPSALT-H	Meer stabiel dan de Narishige buisklem vanwege de grotere magnetische basis, maar het vereist aanpassing om een 2-mm vrouwelijke aansluiting te kunnen gebruiken.
Auto Nanoliter Injector	Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA	Nanoject II	Geautomatiseerde nanoliter injector
Collagenase, Type II	Gibco-USA, Langley, OK, USA	17101-015
Diamond Scriber	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	62108-ST
Differentiële spanningssonde	Warner Instruments, Hamden, CT, USA	7255DI
Analog-naar-digitaal signaalomzetter	Molecular Devices, San Jose,CA, USA	Digidata 1440A
Dumont #5 pincet	World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA	500341
Glazen capillairen	Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA	3-000-203-G/X
Hot Wire Cutter	Amazon.com	Proxxon 37080	Een alternatief is Hercules 8500 DHWT, die een voetbedieningspedaal heeft.
Hyaluronidase, Type I-S	MilliporeSigma, Burlington, MA, USA	H3506
Magnetische houderbasis	Kanetec USA Corp., Bensenville, IL, USA	MB-L-45
Microelektrode schuinmaker	Sutter Instrument, Novato, CA, USA	BV-10
Microelektrode houder	World Precision Instruments,, Sarasota, FL, USA	MEH1S15
Micropipetpuller	Sutter Instrument,, Novato, CA, USA	P-97
mMESSAGE mMACHINETM T3	Invitrogen-FisherScientific	AM1348
Nunc MicroWell MiniTray	Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA	438733	Microwell Minitray
Nylon gaas	Component Supply Company, Sparta, TN, USA	U-CMN-1000
Oöcyteklemversterker	Warner Instruments,, Hamden, CT, USA	OC-725C
OriginPro	OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA	2020b
pClamp	Molecular Devices,, San Jose,CA, USA	Versie 10
Referentie-elektrode	World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA	DRIREF-2SH	Specificaties: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes
RNaseOUT (ribonuclease-remmer)	Invitrogen-FisherScientific	10777-019
Zijdedraad 5-0	Covidien, North Haven, CT, USA	VS890
Spectrofotometer NanoDrop Lite	Thermo Scientific	ND-LITE-PR
Dunwand glazen capillairen	World Precision Instruments,Sarasota, FL, USA	TW150F-4
Buisklem	Narishige International USA, Amityville, NY, USA	CAT-1	Klaar voor gebruik, maar de positie kan veranderen vanwege de kleine magnetische basis.
Xenopus laevis	Xenopus Express, Brooksville, FL, USA	IMP-XL-FM