Hier worden niet-invasieve methoden beschreven voor de lokalisatie van fotoreceptormembraaneiwitten en de beoordeling van retinale degeneratie in het drosophila samengestelde oog met behulp van eGFP-fluorescentie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Onderzoek naar membraaneiwithandel in drosophila-fotoreceptorcellen met behulp van eGFP-gelabelde eiwitten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Membraaneiwithandel reguleert de opname en verwijdering van receptoren en ionkanalen in het plasmamembraan. Dit proces is van fundamenteel belang voor de celfunctie en celintegriteit van neuronen. Drosophila fotoreceptorcellen zijn een model geworden voor het bestuderen van membraaneiwithandel. Naast rhodopsine, dat bij verlichting wordt geïnternaliseerd uit het fotoreceptormembraan en wordt afgebroken, vertoont het transient receptor potential-like (TRPL) ionkanaal in Drosophila een lichtafhankelijke translocatie tussen het rhabdomerale fotoreceptormembraan (waar het zich in het donker bevindt) en het fotoreceptorcellichaam (waarnaar het wordt getransporteerd bij verlichting). Dit intracellulaire transport van TRPL kan op een eenvoudige en niet-invasieve manier worden bestudeerd door eGFP-gelabelde TRPL in fotoreceptorcellen tot expressie te brengen. De eGFP-fluorescentie kan dan worden waargenomen in de diepe pseudopupil of door waterdompelingsmicroscopie. Deze methoden maken detectie van fluorescentie in het intacte oog mogelijk en zijn daarom nuttig voor high-throughput assays en genetische screenings voor Drosophila-mutanten die defect zijn in TRPL-translocatie. Hier worden de voorbereiding van vliegen, de microscopische technieken en kwantificeringsmethoden die worden gebruikt om deze door licht veroorzaakte translocatie van TRPL te bestuderen, in detail uitgelegd. Deze methoden kunnen ook worden toegepast voor mensenhandelstudies op andere Drosophila-fotoreceptoreiwitten, bijvoorbeeld rhodopsine. Bovendien kunnen deze methoden, door gebruik te maken van eGFP-gelabelde rabdomerale eiwitten, worden gebruikt om de degeneratie van fotoreceptorcellen te beoordelen.
Inleiding
Door eiwitten van en naar het plasmamembraan te leveren en te verwijderen, regelt membraaneiwithandel in neuronen de plasmamembraanapparatuur met receptoren en ionkanalen en reguleert als gevolg daarvan de neuronale functie. Misregulatie of defecten in eiwithandel hebben meestal schadelijke effecten op cellen en resulteren in neuronale degeneratie. Bij mensen kan dit neurodegeneratieve ziekten veroorzaken, zoals de ziekte van Alzheimer en Parkinson of Retinitis pigmentosa1. Fotoreceptoren in het samengestelde oog van Drosophila melanogaster zijn een in vivo modelsysteem geworden voor het bestuderen van membraaneiwitha....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Algemene overwegingen
- Gebruik Drosophila-aandelen die een permanent rhabdomeraal gelegen fluorescentie-eiwit tot expressie brengen voor morfologische analyse (bijv. TRP::eGFP, eGFP::NINAC) en translocerende eiwitten voor analyses met betrekking tot eiwithandel (bijv. TRPL::eGFP, Arr2::eGFP).
- Bepaal vooraf de lichtblootstellingsomstandigheden van geselecteerde vliegen voor de experimentele aanpak.
- Voor donkere aanpassing, bewaar de vliegen in donkere dozen gedurende de gewenste periode bij 25 °C. Voor verlichting tot 16 uur in translocatie-experimenten (bijv. TRPL::eGFP die vliegen uitdrukt), houdt u vliegen ond....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Transgene Drosophila-vliegen die een TRPL::eGFP-fusie-eiwit tot expressie brengen onder controle van de rhodopsine 1-promotor zijn gegenereerd. In deze vliegen wordt TRPL::eGFP uitgedrukt in fotoreceptorcellen R1-6 van het samengestelde oog en geeft een verlichtingsafhankelijke lokalisatie weer. Wanneer vliegen in het donker worden gehouden, wordt TRPL::eGFP opgenomen in de buitenste rhabdomeres. Na enkele uren verlichting verplaatst TRPL zich naar het cellichaam waar het wordt opgeslagen in een ER-verrijkt comp.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De toepasbaarheid van fluorescentie-eiwitten en de eenvoud van screening door DPP-beeldvorming en retinale waterdompelingsmicroscopie is door veel groepen12 succesvol gebleken. Strategieën vergelijkbaar met de hier gepresenteerde zijn gebruikt in verschillende genetische schermen om defecten in rhodopsine-expressieniveaus, homeostase, retinale organisatie of cellulaire integriteit te detecteren met behulp van Rh1: : eGFP17, 18, .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We willen onze student-onderzoekers door de jaren heen bedanken. In het bijzonder Nina Meyer, Sibylle Mayer, Juliane Kaim en Laura Jaggy, wiens gegevens in dit protocol zijn gebruikt als representatieve resultaten. Het hier gepresenteerde onderzoek van onze groep werd gefinancierd door subsidies van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (Hu 839/2-4, Hu 839/7-1) aan Armin Huber.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
```
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 15 mL centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
| CO2 anesthesie vliegpad | Flystuff | 59-172 | |
| Koudlichtlamp (KL 1500 LCD) | Zeiss | ||
| Fiji/ImageJ | NIH | ||
| Fluorescentiemicroscoop met UV-lamp, camera, filterset en software (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blue edition) | Zeiss | ||
| Fluorescentiebuis (Lumilux T8, L 30W/840, 4000 K, G13) [1750 Lux, Ee470nm = 298 µW cm-2, Ee590nm = 215 µW cm-2] en [760 Lux, Ee470nm = 173 µW cm-2, Ee590nm = 147 µW cm-2] | Osram | 4050300518039 | |
| Laboratoriumpipet (20-200 µL) | Eppendorf | ||
| Objectglas | Roth | 0656.1 | |
| Petrischaal (94 mm) | Greiner Bio-One | 633102 | |
| Pipettips (200 µL) | Labsolute | 7695844 | |
| Plasticine (Blu-Tack) | Bostik | 30811745 | |
| Stereomicroscoop (SMZ445) | Nikon | ||
| Stereomicroscoop met UV-lamp, camera, filterset en software (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12) | Leica |
Referenties
- Wang, X., Huang, T., Bu, G., Xu, H. Dysregulation of protein trafficking in neurodegeneration. Molecular Neurodegeneration. 9. 9, 31(2014).
- Schopf, K., Huber, A. Membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells. European Journal of Cell B....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
