Gelijktijdige visualisatie van de dynamica van crosslinked en enkele microtubuli in vitro door TIRF-microscopie

Summary

Hier wordt een op TIRF-microscopie gebaseerde in vitro reconstitutietest gepresenteerd om tegelijkertijd de dynamiek van twee microtubulipopulaties te kwantificeren en te vergelijken. Er wordt een methode beschreven om tegelijkertijd de collectieve activiteit van meerdere microtubule-geassocieerde eiwitten op verknoopte microtubulibundels en enkele microtubuli te bekijken.

Abstract

Microtubuli zijn polymeren van αβ-tubuline heterodimeren die zich organiseren in verschillende structuren in cellen. Op microtubule gebaseerde architecturen en netwerken bevatten vaak subsets van microtubule-arrays die verschillen in hun dynamische eigenschappen. In delende cellen bestaan bijvoorbeeld stabiele bundels van verknoopte microtubuli naast elkaar in de nabijheid van dynamische niet-gekruiste microtubuli. Tirf-microscopie-gebaseerde in vitro reconstitutiestudies maken de gelijktijdige visualisatie van de dynamiek van deze verschillende microtubule arrays mogelijk. In deze test wordt een beeldvormingskamer geassembleerd met aan het oppervlak geïmmobiliseerde microtubuli, die ofwel aanwezig zijn als afzonderlijke filamenten of georganiseerd in verknoopte bundels. Introductie van tubuline, nucleotiden en eiwitregulatoren maakt directe visualisatie van geassocieerde eiwitten en van dynamische eigenschappen van enkele en verknoopte microtubuli mogelijk. Bovendien kunnen veranderingen die optreden als dynamische enkele microtubuli zich in bundels organiseren, in realtime worden gevolgd. De hier beschreven methode maakt een systematische evaluatie van de activiteit en lokalisatie van individuele eiwitten mogelijk, evenals synergetische effecten van eiwitregulatoren op twee verschillende microtubbule-subsets onder identieke experimentele omstandigheden, waardoor mechanistische inzichten worden verkregen die ontoegankelijk zijn door andere methoden.

Introduction

Microtubuli zijn biopolymeren die structurele steigers vormen die essentieel zijn voor meerdere cellulaire processen, variërend van intracellulair transport en organelpositionering tot celdeling en elongatie. Om deze diverse functies uit te voeren, worden individuele microtubuli georganiseerd in arrays ter grootte van micron, zoals mitotische spindels, ciliaire axonemen, neuronale bundels, interfase-arrays en plantaardige corticale arrays. Een alomtegenwoordig architectonisch motief dat in deze structuren wordt aangetroffen, is een bundel microtubuli die over hun lengtes zijn ^verknoopt1. Een intrigerend kenmerk van verschillende op microtubuli gebaseerde structuren is het naast elkaar bestaan van gebundelde microtubuli en niet-verknoopte enkele microtubuli in de nabijheid van ruimte. Deze subpopulaties van microtubuli kunnen sterk verschillende polymerisatiedynamieken van elkaar vertonen, afhankelijk van wat nodig is voor hun juiste functie2,3,4,5. Binnen de mitotische spil zijn bijvoorbeeld stabiele verknoopte bundels en dynamische enkele microtubuli aanwezig in een micronschaalgebied in het ^celcentrum6. Het bestuderen van hoe de dynamische eigenschappen van naast elkaar bestaande microtubulipopulaties worden gespecificeerd, is daarom van cruciaal belang voor het begrijpen van de assemblage en functie van op microtubulen gebaseerde structuren.

Microtubuli zijn dynamische polymeren die fietsen tussen fasen van polymerisatie en depolymerisatie, waarbij wordt geschakeld tussen de twee fasen in gebeurtenissen die bekend staan als catastrofe en ^redding7. De dynamiek van cellulaire microtubuli wordt gereguleerd door talloze Microtubule Associated Proteins (MAPs) die de snelheden van microtubule polymerisatie en depolymerisatie en de frequenties van catastrofe- en reddingsgebeurtenissen moduleren. Het is een uitdaging om de activiteit van MAPs op ruimtelijk proximale arrays in cellen te onderzoeken, vanwege de beperkingen van de ruimtelijke resolutie in lichtmicroscopie, vooral in regio's met een hoge microtubuledichtheid. Bovendien belemmert de aanwezigheid van meerdere MAPs in hetzelfde cellulaire gebied de interpretaties van celbiologische studies. In vitro reconstitutietests, uitgevoerd in combinatie met Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopie, omzeilen de uitdagingen van het onderzoeken van mechanismen waarmee specifieke subsets van MAPs de dynamiek van proximale cellulaire microtubule-arrays reguleren. Hier wordt de dynamiek van in vitro geassembleerde microtubuli onderzocht in aanwezigheid van een of meer recombinante MAPs onder gecontroleerde omstandigheden8,9,10. Conventionele reconstitutietests worden echter meestal uitgevoerd op enkele microtubuli of op één type array, waardoor de visualisatie van naast elkaar bestaande populaties wordt uitgesloten.

Hier presenteren we in vitro reconstitutietests die de gelijktijdige visualisatie van twee microtubulipopulaties onder dezelfde oplossingsomstandigheden mogelijk ^maken11. We beschrijven een methode om tegelijkertijd de collectieve activiteit van meerdere MAPs op enkele microtubuli en op microtubulibundels te bekijken die zijn gekruist door het mitotische spindel-geassocieerde eiwit PRC1. Het eiwit PRC1 bindt bij voorkeur aan de overlap tussen anti-parallelle microtubuli, waardoor ze worden ^verknoopt9. In het kort bestaat dit protocol uit de volgende stappen: (i) voorbereiding van stamoplossingen en reagentia, (ii) reiniging en oppervlaktebehandeling van coverslips die worden gebruikt om de beeldvormingskamer voor microscopie-experimenten te creëren, (iii) voorbereiding van stabiele microtubuli "zaden" van waaruit polymerisatie wordt gestart tijdens het experiment, (iv) specificatie van TIRF-microscoopinstellingen om microtubulidynamica te visualiseren, (v) immobilisatie van microtubulizaden en generatie van verknoopte microtubulibundels in de beeldvormingskamer, en (vi) visualisatie van microtubuledynamica in de beeldvormingskamer door middel van TIRF-microscopie, na toevoeging van oplosbare tubuline, MAPs en nucleotiden. Deze assays maken de kwalitatieve evaluatie en kwantitatief onderzoek van MAP-lokalisatie en hun effect op de dynamiek van twee microtubulepopulaties mogelijk. Bovendien vergemakkelijken ze de evaluatie van synergetische effecten van meerdere MAPs op deze microtubule-populaties, in een breed scala van experimentele omstandigheden.

Protocol

1. Bereid reagentia voor

1. Bereid buffers en reagentia voor zoals beschreven in tabel 1 en tabel 2. Houd tijdens het experiment alle oplossingen op ijs, tenzij anders vermeld.

Oplossing	Onderdelen		Aanbevolen opslagduur	Notities
5x BRB80	400 mM K-PIPES, 5 mM MgCl2, 5 mM EGTA, pH 6,8 met KOH, filtersteriliseren		tot 2 jaar	Bewaren bij 4 °C
1x BRB80	80 mM K-PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6,8		tot 2 jaar	Bewaren bij 4 °C
BRB80-DTT	1x BRB80, 1 mM DTT		tot 2 dagen
Assay Buffer	80 mM K-PIPES, 3 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6,8, 5% sucrose (OR 1X BRB80, 5% sucrose, 2 mM MgCl2)		tot 1 jaar	Bewaren bij 4 °C
Hoofdbuffer (MB)	Assay Buffer, 5mM TCEP		1 week	Bereid je voor op de dag van het experiment; Gescheiden in twee buizen: MB-warm bij kamertemperatuur en MB-koud op ijs; 1 mM DTT bevatten bij gebruik van fluorescerende kleurstoffen
Master Buffer met MethylCellulose (MBMC)	1X BRB80, 0,8% methylcellulose, 5 mM TCEP, 5 mM MgCl2		1 week	Bereid je voor op de dag van het experiment; 1 mM DTT bevatten bij gebruik van fluorescerende kleurstoffen
Eiwitverdunningsbuffer (DB)	MB, 1 mg/ml runderserumalbumine (BSA), 1 μM ATP		1 dag, op ijs	Bereid je voor op de dag van het experiment; 1 mM DTT bevatten bij gebruik van fluorescerende kleurstoffen
Zuurstof opruiming Mix (OSM)	MB, 389 μg/ml catalase, 4,44 mg/ml glucoseoxidase, 15,9 mM 2-mercaptoethanol (BME)		1 dag, op ijs	Bereid je voor op de dag van het experiment
Oxygen Scavenging Final (OSF)	MB, 350 μg/ml catalase, 4 mg/ml glucoseoxidase, 14,3 mM BME, 15 mg/ml glucose		gebruik binnen 30 min	Bereid direct voor gebruik door 1 μl glucose toe te voegen aan 9 μL OSM

Tabel 1: Lijst van buffers die in dit protocol worden gebruikt en hun componenten. Zie de kolom 'Aanbevolen opslagduur' voor richtlijnen over hoe ver van tevoren elke buffer kan worden voorbereid.

Reagens

Opslag concentratie

Opslag oplosmiddel

Opslagtemperatuur

Werkconcentratie

Eindconcentratie

Aanbevolen opslagduur

Notities

Neutravidin (NA)

5mg/ml

1x BRB80

-80°C

0,2 mg/ml

0,2 mg/ml

tot 1 jaar

Gebruikt om microtubuli te immobiliseren via een biotine-neutravidine-biotine koppeling; bewaren in kleine aliquots

Kappa-caseïne (KC)

5mg/ml

1x BRB80

-80°C

0,5 mg/ml

0,5 mg/ml

tot 2 jaar

Gebruikt om het oppervlak van de beeldvormingskamer te blokkeren; Bewaren in kleine hoeveelheden; Zet op de dag van het experiment een klein volume apart bij kamertemperatuur

Runderserumalbumine (BSA)

50mg/ml

1x BRB80

-20°C

1 mg/ml (in DB)

N.V.T

tot 2 jaar

bewaren in kleine aliquots

Katalase

3,5 mg/ml

1x BRB80

-80°C

350 μg/ml (in OSF)

35 μg/ml

tot 2 jaar

component van zuurstofruimmengsel; bewaren in kleine aliquots

Glucoseoxidase

40mg/ml

1x BRB80

-80°C

4 mg/ml (in OSF)

0,4 mg/ml

tot 2 jaar

component van zuurstofruimmengsel; bewaren in kleine aliquots

Tubuline

Gelyofiliseerd

N.V.T

4°C

10mg/ml

2,12 mg/ml (in tubulinemix)

tot 1 jaar

Zodra tubuline in oplossing is, houdt u het koud om polymerisatie te voorkomen.

Adenosinetrifosfaat (ATP)

100m

ultrapuur water

-20°C

10 meter

1mm

6 maanden

Bereid de oplossing in filtergesteriliseerd water, stel de pH in op ~ 7,0 en vries in kleine hoeveelheden in.

Guanosinetrifosfaat (GTP)

100m

ultrapuur water

-20°C

10 meter

1,29 mM (in tubuline mix)

6 maanden

Bereid de oplossing in filtergesteriliseerd water, stel de pH in op ~ 7,0 en vries in kleine hoeveelheden in.

Guanosine-5'-[(α,β)-methyleeno] trifosfaat (GMPCPP)

10 meter

ultrapuur water

-20°C

10 μM

0,5 μM

6 maanden

Dithiothreitol (DTT)

1 miljoen

steriel water

-20°C

1mm

N.V.T

tot 2 jaar

Tris (2-carboxyethyl) fosfine (TCEP)

0,5 m

filter-gesteriliseerd water

Kamertemperatuur

5 meter

N.V.T

tot 2 jaar

Methylcellulose

1%

steriel water

Kamertemperatuur

0,8% (in MBMC)

0,21% (in tubuline mix)

tot 1 jaar

Los methylcellulose op door het langzaam toe te voegen aan bijna kokend water. Laat al roerend afkoelen.

Bèta-mercaptoethanol (BME)

143m

steriel water

Kamertemperatuur

14,3 mM (in OSF)

1,43 mM

tot 5 jaar

143 mM is een 1:100 verdunning van voorraad BME

Glucose

150mg/ml

1x BRB80

-80°C

15 mg/ml (in OSF)

1,5 mg/ml

tot 2 jaar

Direct voor gebruik toevoegen aan OSM

(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromaan-2-carbonzuur (Trolox)

10m

1x BRB80

-80°C

10 meter

1mm

tot 1 jaar

Lost niet volledig op. Voeg wat NaOH toe, roer ~4 uur en filter steriliseren voor gebruik

mPEG-Succinimidyl valeraat, MW 5.000

poeder

N.V.T

-20°C

333mg/ml (in 0,1 M natriumbicarbonaat)

324mg/ml (in 0,1 M natriumbicarbonaat)

6 maanden

Bereid ~ 34 mg aliquots en markeer elke buis met een exact gewicht poeder. Breng stikstofgas over de vaste stof, sluit buizen af met parafilm en bewaar bij -20°C in een container met droogmiddel.

Biotine-PEG-SVA, MW 5.000

poeder

N.V.T

-20°C

111mg/ml (in 0,1 M natriumbicarbonaat)

3,24 mg/ml (in 0,1 M natriumbicarbonaat)

6 maanden

Bereid ~ 3 mg aliquots, markeer elke buis met een exact gewicht van poeder. Breng stikstofgas over de vaste stof, sluit buizen af met parafilm en bewaar bij -20°C in een container met droogmiddel.

Tabel 2: Lijst van de in dit protocol gebruikte reagentia. Inbegrepen zijn de aanbevolen opslagcondities en -concentraties, werkconcentraties van stamoplossingen die tijdens het experiment zijn gebruikt en de uiteindelijke concentratie in de beeldvormingskamer. Aanvullende opmerkingen worden gegeven in de uiterst rechtse kolom.

2. Bereid Biotine-PEG-dia's voor

OPMERKING: Bereid beeldvormingskamers zo dicht mogelijk bij het begin van een experiment voor, en niet meer dan 2 weken van tevoren.

1. Schone coverslips
   1. Plaats een gelijk aantal coverslips van 24 x 60 mm en 18 x 18 mm #1.5 (figuur 1F) in respectievelijk schuifvlekkenpotten en schuifwasrekken (figuur 1A,B). Plaats de schuifwasrekken met 18 x 18 mm afdekplaten in een bekerglas van 100 ml.
   2. Spoel alle coverslips 5-6 keer in ultrapuur water (weerstand van 18,2 MΩ cm) en verwijder overtollige vloeistof na elke spoeling met een pipetpunt bevestigd aan een vacuümbuis (figuur 1C).
   3. Vul bekers en glijdende potten met de coverslips met ultrapuur water, sluit af met parafilm en soniceer gedurende 10 minuten.
   4. Vul twee bekers van 150 ml met 200-proof ethanol. Dompel met een pincet elke deksellip in het ene bekerglas gevuld met ethanol en vervolgens het andere.
   5. Breng met een pincet coverslips over op het schuifdroogrek (figuur 1D), droog ze onder stikstofgasstroom en incubeer bij 37 °C tot ze volledig droog zijn (~ 15 min).
   6. Plaats de gedroogde dekzeilen in een enkele laag in de plasmareiniger. Vorm vacuümafdichting en stel vervolgens het RF-niveau (Radio Frequency) van de plasmareiniger in op ~ 8 MHz.
   7. Zodra het plasma is gegenereerd, laat u coverslips gedurende 5 minuten in plasmareiniger. Schakel de plasmareiniger uit en laat de stofzuiger langzaam los.
   8. Zodra de vacuümafdichting is losgelaten, draait u de coverslips om en herhaalt u de plasmareiniging gedurende 5 minuten voor de andere kant van de coverslips.
   9. Alternatief voor plasmareiniging: In plaats van stap 2.1.2-2.1.3, sonicate coverslips in een warme oplossing van 2% wasmiddel (in ultrapuur water) gedurende 10 minuten. Was vervolgens de coverslips grondig met ultrapuur water en soniceer 2-3 keer (elk 10 minuten) in ultrapuur water. Was vervolgens ethanol en droog zoals in stap 2.1.4-2.1.5. Sla stap 2.1.6-2.1.8 over.
2. Biotine-PEG behandeling
   1. Los onmiddellijk voor gebruik 400 μL 3-aminopropyltriethoxysilaan op in 40 ml aceton. Verplaats met een pincet plasmagezuiverde afdekplaten in het schuifwasrek en de schuifvlekkenpotten. Dompel coverslips onder in 3-Aminopropyltriethoxysilaan oplossing en incubeer gedurende 5 ^min12,13.
   2. Was alle coverslips 5-6 keer met ultrapuur water.
   3. Breng coverslips over naar het schuifdroogrek, droog ze onder een stikstofgasstroom en incubeer bij 37 °C tot ze volledig droog zijn (~ 20 min).
   4. Leg de gedroogde coverslips op delicate taakdoekjes en label elke coverslip op één hoek, bijvoorbeeld 'p' op elke coverslip van 18 x 18 mm en 'b' op elke coverslip van 24 x 60 mm (zie figuur 2).
   5. Bereid op de dag van het experiment een verse 0,1 M natriumbicarbonaatoplossing door 0,84 mg NaHCO3 op te lossen in 10 ml ultrapuur water.
   6. Breng aliquots van mPEG-Succinimidyl Valeraat (PEG-SVA) en Biotine-PEG-SVA onmiddellijk voor gebruik op kamertemperatuur. Zie de opmerkingen over polyethyleenglycol (PEG) aliquotpreparaat in tabel 2.
      OPMERKING: Werk snel omdat de hydrolysehalfwaardetijd van het Succinimidyl Valerate (SVA) deel ~ 30 min is.
   7. Voeg 102 μL van 0,1 M NaHCO3 toe aan 34 mg PEG-SVA, draai in een benchtop microcentrifuge van 2.656 x g gedurende 20 s en meng vervolgens door op en neer te pipetteren. Los 3 mg Biotine-PEG-SVA op in 27 μL van 0,1 M NaHCO3 door op en neer te pipetteren. Pas de verdunningsvolumes aan volgens het exacte gewicht van peg dat op de buizen is vermeld (zie tabel 2).
   8. Bereid 100:1 m/w PEG:biotine-PEG-mengsel door 75 μL PEG-SVA-oplossing en 2,25 μL Biotine-PEG-SVA-oplossing voor 20 coverslips, 100 μL en 3 μL voor 30 coverslips, of 125 μL en 3,75 μL voor 40 coverslips te combineren.
   9. Bouw een hydratatiekamer door natte papieren handdoeken onder het tiprek in de bodem van een lege 10 μL tipbox te plaatsen (figuur 1E). Dit voorkomt verdamping van de PEG-oplossingen.
   10. Pipetteer 6 μL van 100:1 PEG-SVA:biotine-PEG mengsel op het midden van een 24 x 60 mm coverslip aan de gelabelde zijde. Plaats nog een coverslip van 24 x 60 mm bovenop de eerste coverslip, zodat het paar een X-vorm vormt, met de zijkanten met het label 'b' naar elkaar toe. Plaats het paar op een leeg tiprek in de hydratatiekamer en herhaal voor de resterende 24 x 60 mm coverslips.
   11. Pipetteer 6 μL PEG-SVA op het midden van een 18 x 18 mm coverslip aan de gelabelde zijde. Plaats nog een afdekplaat van 18 x 18 mm bovenop de eerste afdekplaat, met de zijkanten met het label 'p' naar elkaar toe. Plaats het paar op een leeg tiprek in de hydratatiekamer en herhaal voor de resterende 18 x 18 mm coverslips.
   12. Sluit de hydratatiekamer en incubeer gedurende 3 uur of een nacht.
   13. Scheid de paar coverslips en spoel af in ultrapuur water.
   14. Droog dekens met een stikstofstroom en plaats ze in een incubator van 37 °C om volledig te drogen.
   15. Om de beeldvormingskamer te construeren, plakt u drie stroken dubbelzijdige tape op een afdekplaat van 24 x 60 mm op de zijde met het label 'b'. Bevestig aan de andere kant van tapetrips een afdekplaat van 18 x 18 mm met het zijlabel 'p' tegenover de grotere afdekplaat. Dit vormt twee stroomkamers voor microscopie-experimenten, met behandelde oppervlakken tegenover elkaar (figuur 2 en figuur 1G).

Figuur 1: Apparatuur voor coverslipbehandeling en beeldvormingskamervoorbereiding. (A) schuifkleurpotten voor 24 x 60 mm coverslips, (B) slide-wasrekken voor 18 x 18 mm coverslips, (C) vacuümopstelling, (D) glijdroogrek, (E) hydratatiekamer, (F) coverslips, (G) imaging chamber, (H) slide holder. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Schema voor de voorbereiding van beeldvormingskamers met behulp van dubbelzijdige tape (grijs) en peg/biotine-peg behandelde coverslips. Gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Polymeriseer microtubuli

1. GMPCPP zaden bereiden
   OPMERKING: Bereid GMPCPP-zaden in een koude ruimte en bewaar alle reagentia, tips en tubes op 4 °C. GMPCPP-zaden kunnen van tevoren worden bereid en maximaal 1 jaar bij -80 °C worden bewaard. Plaats de ultracentrifugerotor met een vaste hoek, met 1 ml centrifugebuizen, in de ultracentrifuge en stel de temperatuur in op 4 °C.
   1. Resuspend gelyofiliseerde tubuline (tabel 2) tot ~10 mg/ml in 1X BRB80, onmiddellijk voor gebruik.
   2. Meng componenten van GMPCPP zaden zoals beschreven in tabel 3.
      OPMERKING: Houd alle tubulinecomponenten zoveel mogelijk op ijs om de polymerisatie van oplosbare tubuline te minimaliseren.
   3. Verduidelijk het mengsel in een ultracentrifugerotor met vaste hoek bij 352.700 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
   4. Scheid het supernatant in aliquots van 5 μL, vries ze in vloeibare stikstof in en bewaar ze bij -80 °C.
2. Polymeriseer zaden op de dag van het experiment
   1. Verwarm 1-2 ml BRB80-DTT (tabel 1) tot 37 °C.
   2. Breng 5 μL aliquot GMPCPP-zaden (-80 °C) uit stap 3.1.4 op ijs en los onmiddellijk op in 20 μL warme BRB80-DTT. Draai met 2.000 x g gedurende 5 s bij kamertemperatuur en tik om te mengen.
      OPMERKING: Het initiële verdunningsvolume kan variëren tussen 13 μL en 21 μL en wordt empirisch bepaald voor elke partij zaden. Als zaden niet polymeriseren, los dan problemen op door de initiële verdunningsbuffer (stap 3.2.2) aan te vullen met 0,5 μM GMPCPP.
   3. Bescherm tegen licht en incubeer bij 37 °C gedurende 30-45 min.
      OPMERKING: De lengte van de microtubuli is afhankelijk van de incubatieduur. Voor korte microtubuli kan de incubatietijd zo kort zijn als 15 minuten. Voor lange microtubuli kan de incubatietijd wel 2 uur zijn. Gebiotinyleerde microtubuli hebben de neiging om langere incubatietijden te vereisen dan niet-gebiotinyleerde microtubuli.
   4. Plaats de ultracentrifugerotor met vaste hoek, met centrifugebuizen van 500 μL, in de ultracentrifuge en voorverwarm tot 30 °C.
   5. Voeg na incubatie 50 μL warme BRB80-DTT (stap 3.2.1) toe aan de gepolymeriseerde GMPCPP-zaden en breng het mengsel over naar een centrifugebuis van 500 μL. Was de lege buis die de GMPCPP-zaden bevatte met nog eens 50 μL warme BRB80-DTT, pipetteer op en neer en voeg deze buffer toe aan de 500 μL centrifugebuis die het mengsel bevat.
   6. Markeer voordat u draait de rand van de centrifugebuis om aan te geven waar de pellet zich zal bevinden (de pellet zal te klein zijn om te zien). Draai gedurende 10 minuten bij 244.900 x g bij 30 °^C12.
   7. Pipetteer voorzichtig het bovennatuurlijke en gooi het weg. Resuspend de pellet in 100 μL warme BRB80-DTT. Tik om te mixen.
   8. Draai gedurende 10 minuten bij 244.900 x g bij 30 °C en lijn de markering uit met de rotor om op dezelfde plaats te pelleteren.
   9. Verwijder het supernatant en resuspend de pellet in 16 μL warme BRB80-DTT. Breng de microtubule-oplossing over in een schone microcentrifugebuis van 0,6 ml. Bescherm tegen licht en houd op of boven kamertemperatuur.
      OPMERKING: Houd microtubuli na polymerisatie op of boven kamertemperatuur. Als ze het koud krijgen, zullen ze depolymeriseren. Incubeer bij 28 °C voor extra stabiliteit.
3. Microtubuli controleren via TIRF-microscopie
   1. Pipetteer een mengsel van 4,5 μL BRB80-DTT en 1 μL microtubule-oplossing (stap 3.2.9) op een microscoopglaasje. Dek af met een afdekplaat van 18 x 18 mm en sluit de randen af met heldere nagellak of een 1:1:1 mengsel van vaseline, lanoline en paraffine (valapkit), dat bij kamertemperatuur vast is en vloeibaar bij 95 °C.
   2. Plaats het TIRF-objectief onder de coverslip (zie stap 4 voor aanbevolen microscoopinstellingen) en visualiseer de nieuw gepolymeriseerde microtubuli op golflengte die geschikt is voor de fluorescerend gelabelde tubuline in de Bright-mix (tabel 3), om te bepalen welke verdunning van microtubuli moet worden gebruikt in de komende experimenten.

Reagens	Heldere mix (μL)	Volgorde van toevoeging	Heldere mix + biotine (μL)	Volgorde van toevoeging
Fluorescerende tubuline, 10 mg/ml	2	6	2	7
Biotine-tubuline, 10 mg/ml	0	N.V.T	2	6
Ongelabelde tubuline, 10 mg/ml	20	5	18	5
GMPCPP, 10 mM	30	4	30	4
DTT, 0,2 m	0.7	3	0.7	3
5x BRB80	26.4	2	26.4	2
steriel water	52.9	1	52.9	1
Totaal volume (μl)	132		132

Tabel 3: GMPCPP zaadmix. Componenten van GMPCPP microtubule zaden, inclusief volume en volgorde van toevoeging. Bereid 5 μL aliquots en bewaar tot 1 jaar bij -80 °C.

4. Microscoop instellingen

1. Temperatuur: Stel de microscooptemperatuur in op 28 °C om dynamische microtubuli te bekijken.
2. Filters: Gebruik de beste combinatie van filterkubussen en emissiefilters, afhankelijk van de fluorescerende kanalen die moeten worden afgebeeld. Om 488 nm, 560 nm en 647 nm golflengten in hetzelfde experiment te visualiseren, gebruikt u een 405/488/560/647 nm Laser Quad Band Set, gekoppeld aan emissiefilters voor de aangewezen golflengten.
3. Lasers uitlijnen: Zorg ervoor dat de laserstralen die in het experiment worden gebruikt, zijn uitgelijnd. Bepaal de laserintensiteit voor het experiment empirisch, zodat alle fluorescerende eiwitten in beeld kunnen worden gebracht met de hoogst mogelijke signaal-ruisverhouding, maar geen significante fotobleaching ondergaan in de loop van het experiment.
4. Doel: Gebruik lenspapier om een objectief van 100x schoon te maken met 70% ethanol. Voeg voorafgaand aan de beeldvorming een druppel microscoop-onderdompelingsolie toe aan het objectief.
5. Een afbeeldingssequentie instellen
   1. Voor een experiment met 647 nm fluorofoor-gelabelde gebiotinyleerde microtubuli, 560 nm fluorofoor-gelabelde niet-gebiotinyleerde microtubuli en oplosbare tubuline, en GFP-gelabeld eiwit van belang, beeld gedurende 20 minuten. Stel de 560 nm en 488 nm kanalen om de 10 s, en het 647 nm kanaal elke 30 s.
   2. Om een referentiebeeld van bundels vast te leggen vóór de toevoeging van oplosbare tubuline en MAPs, stelt u een reeks in met elk één afbeelding in golflengten van 560 nm en 647 nm.

5. Genereer oppervlakte-geïmmobiliseerde microtubulibundels

OPMERKING: Voor de volgende stappen, laat alle oplossingen in een stroomkamer stromen door in één open zijde te pipetteren, terwijl u een filtreerpapier tegen de andere zijde plaatst. Bescherm de beeldvormingskamer tegen licht om fotobleaching van fluorescerend gelabelde eiwitten te verminderen. Plak de voorbereide beeldvormingskamer vast aan een diahouder (figuur 1G,H). Volg de stappen in tabel 4, die overeenkomen met protocol steps 5.2-6.4.

1. Bereid oplosbare tubulinemix volgens tabel 5 en bewaar het op ijs.
   OPMERKING: Oplosbare tubuline moet altijd op ijs worden geplaatst om polymerisatie te voorkomen. Bereid een vers oplosbaar tubulinemengsel ongeveer elke 2 uur, of wanneer microtubuli niet langer polymeriseren.
2. Om microtubuli te immobiliseren via een biotine-neutravidine-biotine koppeling, eerst stromen in Neutravidin (NA) oplossing totdat de kamer is gevuld (~ 7,5 μL) en incuberen gedurende 5 minuten.
3. Wassen met 10 μL MB-koud.
4. Stroom in 7,5 μL van het blokkerende eiwit κ-caseïne (KC) en incubeer gedurende 2 min.
5. Was met 10 μL MB-warm om de kamer voor te bereiden op de introductie van microtubuli.
6. Verdun de voorraad gebiotinyleerde microtubuli (volgens waarnemingen in stap 3.3.2) in 1X BRB80-DTT en voeg 1 μL van deze verdunning toe tot 9 μL MB-warm. Laat het mengsel in de kamer stromen en incubeer gedurende 10 minuten. Gebruik een hogere concentratie microtubuli voor meer bundels.
7. Spoel niet-geïmmobiliseerde microtubuli weg met 10 μL MB-warm.
8. Stroom 7,5 μL warme KC in de kamer en incubeer gedurende 2 minuten.
9. Bereid tijdens de incubatie een 2 nM-oplossing van het crosslinker-eiwit PRC1 in warm KC. Stroom 10 μL van deze oplossing in de stroomkamer en incubeer gedurende 5 minuten.
   OPMERKING: Recombinant PRC1 wordt tot expressie gebracht en gezuiverd uit bacteriële cellen zoals eerder ^beschreven13.
10. Om bundels te maken, stroomt u 10 μL niet-gebiotinyleerde microtubuli in de kamer en incubeert u gedurende 10 minuten. PRC1 zal de niet-gebiotinyleerde en geïmmobiliseerde gebiotinyleerde microtubuli ^kruisen15,16 (figuur 3).
    OPMERKING: Zie stap 6.1 voor het bereiden van het testmengsel tijdens de incubatietijd.
11. Was de kamer tweemaal met 10 μL MB-warm. De aangehechte microtubuli zijn vanaf dit punt ongeveer 20 minuten stabiel.

Stap	Reagens	Volume (μL)	Incubatietijd (minuten)
1	Neutravidin	7.5	5
2	MB-koud	10	-
3	κ-caseïne	7.5	2
4	MB-warm	10	-
5	Gebiotinyleerde microtubuli (verdund in MB-warm)	10	10
6	MB-warm	10	-
7	Warme κ-caseïne	7.5	2
8	2 nM PRC1 verdund in κ-caseïne	10	5
9	Niet-gebiotinyleerde microtubule	10	10
10	MB-warm x 2	10	-
11	Assay mix	10	-
Aangehechte zaden zijn op dit moment ongeveer 20 minuten stabiel

Tabel 4: Teststappen. Lijst van reagentia die aan de beeldvormingskamer zijn toegevoegd, met vermelding van wastijd (-) of incubatietijd.

Reagens	Volume (μL)
Gerecyclede tubuline, 10 mg/ml	10
MB-Koud	10.3
Mbmc	13.7
BRB80-DTT	3.4
Gtp, 10 mM	6.7
ATP, 10 mM (Bij gebruik van kinesines)	6.7
Fluorescerend gelabelde tubuline, 10mg/ml	1 (Resuspend gelyofiliseerd gelabelde tubuline in koude BRB80-DTT)

Tabel 5: Oplosbare tubuline mix componenten. Meng aan het begin van het experiment en blijf op ijs.

Figuur 3: Schematische toevoeging van assaycomponenten om fluorescerend gelabelde bundels en enkele microtubuli te maken en in beeld te brengen. Gebiotinyleerde zaden worden getoond in blauwe, niet-gebiotinyleerde zaden en oplosbare tubuline in rood, PRC1 in zwart en eiwit van belang in cyaan. Stapnummers in figuur komen overeen met die in tabel 4. Paneel dat overeenkomt met stap 9 toont een voorgevormde bundel (linksonder); stap 11 toont een nieuw gevormde bundel (linksboven). Gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Beeld microtubule dynamiek

1. Bereid tijdens de incubatietijd van 10 minuten in stap 5.10 10 μL testmengsel met interessante eiwitten, oplosbare tubuline, nucleotiden, ^{zuurstofvangers14} en antioxidanten volgens tabel 6. Bewaar de mix op ijs.
2. Laad de voorbereide beeldvormingskamer, vastgeplakt op de schuifhouder, op het 100x TIRF-objectief. Gebruik de kanalen van 560 nm en 647 nm om een gezichtsveld te vinden dat een optimaal aantal en dichtheid van enkele microtubuli en bundels bevat.
   OPMERKING: Als zowel gebiotinyleerde als niet-gebiotinyleerde microtubuli zijn gelabeld met dezelfde fluorofoor, kunnen lijnscananalyses van fluorescentie-intensiteiten onderscheid maken tussen enkele microtubuli en bundels.
3. Zodra een gezichtsveld is geïdentificeerd, maakt u een referentiebeeld.
4. Vloei voorzichtig in de testmix zonder de beeldvormingskamer te verstoren.
5. Sluit de open uiteinden van de kamer af met valap-kit.
6. Start de beeldreeks zoals beschreven in stap 4.5.1.

Reagens	Volume (μL)
Oplosbare tubuline mix	4
OSF	1
Trolox (bij gebruik van microtubuli gelabeld met een gemakkelijk fotobleachende fluorofoor)	1
ATP, 10 mM (Bij gebruik van kinesines)	1
PRC1 (of crosslinker naar keuze)	1
Interessante eiwitten	X
MB-koud	2-x

Tabel 6: Componenten van het assaymengsel. Meng, stroom in de beeldvormingskamer en beeld microtubulidynamica in, binnen 30 minuten.

Results

Het hierboven beschreven experiment werd uitgevoerd met behulp van 647 nm fluorofoor-gelabelde gebiotinyleerde microtubuli, 560 nm fluorofoor-gelabelde niet-gebiotinyleerde microtubuli en 560 nm fluorofoor-gelabelde oplosbare tubuline mix. Microtubuli werden gecrosslinkt door het crosslinker-eiwit PRC1 (GFP-gelabeld). Nadat oppervlakte-geïmmobiliseerde bundels en enkele microtubuli waren gegenereerd (stap 5.11), werd de beeldvormingskamer gemonteerd op een TIRF 100X 1.49 NA olieobjectief en bekeken in de 560 nm en 647 nm...

Discussion

Het hier beschreven experiment breidt de reikwijdte en complexiteit van conventionele microtubule reconstitutietests aanzienlijk uit, die traditioneel worden uitgevoerd op enkele microtubuli of op één type array. De huidige test biedt een methode om tegelijkertijd de regulerende MAP-activiteit op twee populaties te kwantificeren en te vergelijken, namelijk enkele microtubuli en gekruiste bundels. Verder maakt deze test het mogelijk om twee soorten bundels te onderzoeken: bundels die vooraf zijn gevormd uit stabiele zaden...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox)	Sigma Aldrich	238813
1,4-piperazinediethanesulfonic acid (PIPES)	Sigma Aldrich	P6757
18x18 mm #1.5 coverslips	Electron Microscopy Sciences	63787
2-Mercaptoethanol (BME)	Sigma Aldrich	M-6250
24x60 mm #1.5 coverslips	Electron Microscopy Sciences	63793
405/488/560/647 nm Laser Quad Band	Chroma	TRF89901-NK
Aceton	Sigma Aldrich	320110
Adenosine 5'-trifosfaat dinatriumzouthydraat (ATP)	Sigma Aldrich	A7699-5G
Avidin, NeutrAvidin® Biotine-bindend Eiwit (Molecular Probes®)	Thermo Fischer Scientific	A2666
Bath sonicator: Branson 2800 Cleaner	Branson	CPX2800H
Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 11 x 34 mm	Beckman-Coulter	343778
Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 8 x 34 mm	Beckman-Coulter	343776
Biotin-PEG-SVA, MW 5.000	Laysan Bio	#Biotin-PEG-SVA-5000
Rundier serumalbumine (BSA)	Sigma Aldrich	2905
Catalase	Sigma Aldrich	C40
Corning LSE Mini Microcentrifuge, AC100-240V	Corning	6670
Delicate Task Wipes	Kimtech	34120
Dithiothreitol (DTT)	GoldBio	DTT10
Emissiefilter	Chroma	ET610/75m
Ethanol (200-proof)	Decon Labs	2705
Ethyleenglycoltetra-azijnzuur (EGTA)	Sigma Aldrich	3777
Glucose Oxidase	Sigma Aldrich	G2133
GMPCPP	Jena Bioscience	NU-405
Guanosine 5'-trifosfaat natriumzouthydraat (GTP)	Sigma Aldrich	G8877
Hellmanex III detergent	Sigma Aldrich	Z805939
Immersieolie, Type A	Fisher Scientific	77010
Kappa-caseïne	Sigma Aldrich	C0406
Lanolin	Fisher Scientific	S25376
Lens Cleaning Tissue	ThorLabs	MC-5
Magnesiumchloride (MgCl2)	Sigma Aldrich	M9272
Methylcellulose	Sigma Aldrich	M0512
Microfuge 16 Benchtop Centrifuge	Beckman-Coulter	A46474
Microscoopglazen, diamant wit glas, 25 x 75 mm, 90° gemalen randen, WITT Frosted	Globe Scientific	1380-50W
mPEG-succinimide Valerate, MW 5.000	Laysan Bio	#NH2-PEG-VA-5K
Optima™ Max-XP Tabletop Ultracentrifuge	Beckman-Coulter	393315
Paraffine	Fisher Scientific	P31-500
PELCO Reverse (zelfsluitend), Fine Tweezers	Ted Pella	5377-NM
Petrolatum, Wit	Fisher Scientific	18-605-050
Plasma Cleaner, 115V	Harrick Plasma	PDC-001
Kaliumhydroxide (KOH)	Sigma Aldrich	221473
Natriumbicarbonaat	Sigma Aldrich	S6014
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903
Thermal-Lok 1-Positie Droogwarmtebad	USA Scientific	2510-1101
Thermal-Lok Blok voor 1,5 en 2,0 mL buizen	USA Scientific	2520-0000
Thermo Scientific™ Pierce™ Bond-Breaker™ TCEP-oplossing, Neutrale pH; 500 mM	Thermo Fischer Scientific	PI-77720
TIRF 100X NA 1,49 Olie Objectief	Nikon	CFI Apochromat TIRF 100XC Oil
TIRF microscoop	Nikon	Eclipse Ti
TLA 120.1 rotor	Beckman-Coulter	362224
TLA 120.2 rotor	Beckman-Coulter	357656
Tubuline-eiwit (>99% zuiver): varkensbrein	Cytoskeleton	T240
Tubuline-eiwit (Biotine): Varkensbrein	Cytoskeleton	T333P
Tubuline-eiwit (fluorescente HiLyte 647): varkensbrein	Cytoskeleton	TL670M
Tubuline-eiwit (X-rhodamine): runderbrein	Cytoskeleton	TL620M
VECTABOND® Reagent, Tissue Section Adhesion	Vector Biolabs	SP-1800-7
VWR® Personal-Sized Incubator, 120V, 50/60Hz, 0,6A	VWR	97025-630