Methodenartikel

Kwantificeren van ijzertransport over de placenta van de muis in vivo met behulp van niet-radioactieve ijzerisotopen

DOI:

10.3791/63378

⸱

10 mei 2022

 , 
1Center for Iron Disorders, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel laat zien hoe transferrinegebonden niet-radioactief isotopisch ijzer kan worden bereid en toegediend voor studies van ijzertransport tijdens de zwangerschap van muizen. De benadering voor het kwantificeren van isotopisch ijzer in foetoplacentale compartimenten wordt ook beschreven.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IJzer is essentieel voor de gezondheid van moeders en foetussen tijdens de zwangerschap, met ongeveer 1 g ijzer dat nodig is bij mensen om een gezonde zwangerschap te ondersteunen. Foetale ijzergift is volledig afhankelijk van ijzeroverdracht over de placenta en verstoringen van deze overdracht kunnen leiden tot ongunstige zwangerschapsuitkomsten. Bij muizen was het meten van ijzerfluxen over de placenta traditioneel afhankelijk van radioactieve ijzerisotopen, een zeer gevoelige maar belastende benadering. Stabiele ijzerisotopen (57Fe en 58Fe) bieden een niet-radioactief alternatief voor gebruik in humane zwangerschapsstudies.

Onder fysiologische omstandigheden is transferrinegebonden ijzer de overheersende vorm van ijzer die door de placenta wordt opgenomen. Zo werd 58Fe-transferrine bereid en intraveneus geïnjecteerd in zwangere moederdieren om het placenta-ijzertransport direct te beoordelen en de maternale intestinale ijzerabsorptie als een verstorende variabele te omzeilen. Isotopisch ijzer werd gekwantificeerd in de placenta en embryonale weefsels van de muis door inductief gekoppelde plasmamassaspectrometrie (ICP-MS). Deze methoden kunnen ook worden gebruikt in andere diermodelsystemen van fysiologie of ziekte om in vivo ijzerdynamica te kwantificeren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IJzer is van cruciaal belang voor verschillende metabolische processen, waaronder groei en ontwikkeling, energieproductie en zuurstoftransport1. Onderhoud van ijzerhomeostase is een dynamisch, gecoördineerd proces. IJzer wordt geabsorbeerd uit voedsel in de twaalfvingerige darm en getransporteerd rond het lichaam in de circulatie gebonden aan het ijzertransporteiwittransferrine (Tf). Het wordt door elke cel gebruikt voor enzymatische processen, opgenomen in hemoglobine in ontluikende erytrocyten en gerecycled uit verouderde erytrocyten door macrofagen. IJzer wordt opgeslagen in de lever wanneer het in overmaat en verloren gaat uit het lichaam door bloeding of celschilfering. De hoeveelheid ijzer in omloop is het resultaat van de balans tussen de consumptie en de toevoer van ijzer, waarbij de laatste strak wordt gereguleerd door het leverhormoon hepcidine (HAMP), de centrale regulator van ijzerhomeostase1. Hepcidine functioneert om de biologische beschikbaarheid van ijzer in bloed te beperken door ubiquitinatie af te sluiten of te induceren en de ijzerexporteur ferroportine (FPN)2 af te breken. Vermindering van functionele FPN leidt tot verminderde ijzerabsorptie via de voeding, ijzervastlegging in de lever en verminderde ijzerrecycling van macrofagen1.

Hepcidine wordt gereguleerd door ijzerstatus, ontsteking, erytropoëtische drive en zwangerschap (beoordeeld in 3). Aangezien ijzerhomeostase zeer dynamisch is, is het belangrijk om de totale ijzerpool en ijzerdistributie en -omzet te begrijpen en te meten. Dierstudies vertrouwden traditioneel op radioactieve ijzerisotopen, een zeer gevoelige maar belastende benadering om ijzerdynamiek te meten. In meer recente studies, waaronder de hier gepresenteerde studie4, worden niet-radioactieve, stabiele ijzerisotopen (58Fe) echter gebruikt om ijzertransport tijdens de zwangerschap te meten 5,6,7,8,9. Stabiele isotopen zijn waardevolle hulpmiddelen voor het bestuderen van het metabolisme van voedingsstoffen (besproken in 10). Het gebruik van stabiele ijzerisotopen in menselijke studies toonde aan dat i) de ijzerabsorptie toeneemt tegen het einde van de zwangerschap 5,6, ii) de overdracht van ijzer in de voeding naar de foetus afhankelijk is van de maternale ijzerstatus7, iii) door de moeder ingenomen heemijzer gemakkelijker door de foetus wordt opgenomen dan niet-restijzer8, en iv) ijzeroverdracht naar de foetus negatief gecorreleerd is met maternale hepcidineniveaus8, 9. Deze experimenten maten ijzerisotopen in sera of hun opname in RBC's; de meting van ijzer dat alleen in RBC's is verwerkt, kan echter de werkelijke ijzerabsorptie onderschatten9. In de huidige studie worden zowel heem als nonheme ijzer gemeten in weefsels.

Tijdens de zwangerschap is ijzer nodig om de uitbreiding van het volume van de rode bloedcellen van de moeder te ondersteunen en voor overdracht over de placenta om de groei en ontwikkeling van de foetus te ondersteunen11. Foetale ijzergifte is volledig afhankelijk van ijzertransport over de placenta. Tijdens de zwangerschapvan mens 12 en knaagdier 4,13 nemen de hepcidinespiegels dramatisch af, waardoor de beschikbaarheid van plasmaijzer voor overdracht naar de foetus toeneemt.

De fundamenten van placenta-ijzertransport werden aanvankelijk gekarakteriseerd in de jaren 1950-70 met behulp van radioactieve tracers (59Fe en 55Fe). Deze studies stelden vast dat ijzertransport door de placenta unidirectioneel14,15 is en dat diferric transferrine een belangrijke bron van ijzer is voor de placenta en de foetus16,17. Het huidige begrip van placenta-ijzertransport is completer, hoewel enkele belangrijke ijzertransporters en regulerende mechanismen onbekend blijven. Muismodellen zijn essentieel geweest voor het begrijpen van ijzerregulatie en transport18 omdat de belangrijkste transporters en mechanismen opmerkelijk veel op elkaar lijken. Zowel de placenta van de mens als van de muis zijn hemochoriaal, dat wil zeggen dat het bloed van de moeder in direct contact staat met het foetale chorion19. Er zijn echter enkele opmerkelijke structurele verschillen.

De syncytiotrophoblast is de placentale cellaag die de maternale en foetale circulatie scheidt en actief ijzer en andere voedingsstoffen transporteert20. Bij mensen is de syncytiotrophoblast een enkele laag gefuseerde cellen. De placenta van de muis daarentegen bestaat uit twee syncytiotrophoblastlagen21, Syn-I en Syn-II. Gap junctions op het grensvlak van Syn-I en Syn-II maken echter de diffusie van voedingsstoffen tussen lagen22,23 mogelijk. Deze lagen functioneren dus als een enkele syncytiele laag vergelijkbaar met de menselijke syncytiotrophoblast. Aanvullende overeenkomsten en verschillen tussen menselijke en muis placenta's worden beoordeeld door Rossant en Cross21. Placentaal ijzertransport wordt geactiveerd door de binding van ijzer-Tf van maternale bloed naar de transferrinereceptor (TfR1) gelokaliseerd aan de apicale kant van de syncytiotrophoblast24. Deze interactie induceert ijzer-Tf/TfR1 internalisatie via clathrin-gemedieerde endocytose25. IJzer wordt vervolgens vrijgegeven uit Tf in het zure endosoom26, gereduceerd tot ijzer door een onbepaald ferrireductase en geëxporteerd van het endosoom naar het cytoplasma door een nog te bepalen transporter. Hoe ijzer wordt gecapitonneerd binnen de syncytiotrophoblast moet ook nog worden beschreven. IJzer wordt uiteindelijk naar de foetale zijde getransporteerd door de ijzerexporteur, FPN, gelokaliseerd op het basale of foetale oppervlak van de syncytiotrophoblast (beoordeeld in27).

Om te begrijpen hoe fysiologische en pathologische regulatie van TfR1, FPN en hepcidine het placentale ijzertransport beïnvloedt, werden stabiele ijzerisotopen gebruikt om ijzertransport van de maternale circulatie naar de placenta en het embryo in vivo te kwantificeren 4. Dit artikel presenteert de methoden voor het bereiden en toedienen van isotopisch ijzertransferrine aan zwangere muizen, het verwerken van weefsels voor ICP-MS en het berekenen van ijzerconcentraties in weefsels. Het gebruik van stabiele ijzerisotopen in vivo kan worden aangepast om ijzerregulatie en -distributie in verschillende diermodellen te onderzoeken om fysiologische en pathologische ijzerregulatie te onderzoeken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierprotocollen en experimentele procedures zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de University of California Los Angeles.

1. Bereiding van 58Fe-Tf

OPMERKING: Het protocol gebruikt 58Fe; voor 57Fe kan echter een identiek protocol worden gebruikt. Beide isotopen kunnen zonder extra voorzorgsmaatregelen worden gebruikt en weggegooid als een standaard ijzerchemicaliën.

  1. Los 58Fe op in 12 N HCl bij 50 μL HCl/mg van 58Fe.
    1. Voeg HCl toe aan het metaal in de glazen injectieflacon die door de verkoper is geleverd en vervang de dop losjes. Om het ijzer op te lossen, verwarmt u de 58Fe/HCl-oplossing gedurende 1 uur tot 60 °C. Als het nog steeds niet is opgelost, laat de oplossing dan een nacht op kamertemperatuur in de zuurkast om op te lossen.
      OPMERKING: Opgeloste 58Fe/HCl oplossing is geelachtig oranje van kleur.
      Fe3O4(s) + 8HCl(aq) → Fe(II)Cl2(aq) + 2Fe(III)Cl3(aq) + 4H2O
  2. Oxideer de resterende Fe(II)Cl2 om de Fe(III)Cl3-oplossing te genereren.
    1. Warm de 58Fe/HCl-oplossing op tot 60 °C met de dop eraf om oxidatie te vergemakkelijken.
    2. Voeg 1 μL 35% H2O2 per 50 μL 58Fe/HCl-oplossing toe om oxidatie verder te vergemakkelijken.
      Fe(II)Cl2(aq) + O2 + 4HCl → 4Fe(III)Cl3(aq) + 2H2O
  3. Bereid de ijzerchlorideoplossing (58Fe(III)Cl3).
    1. Laat de ijzerchlorideoplossing in de kap bij 60 °C met de dop eraf om het monster te verdampen.
      OPMERKING: Verdamping kan tussen één en meerdere dagen duren.
    2. Reconstitueer 58Fe(III)Cl3 tot 100 mM met ultrapuur H2O en bereken de benodigde hoeveelheid ultrapuur H2O op basis van het in stap 1.1 gebruikte initiële metaalgewicht (molecuulgewicht van 58Fe(III)Cl3 is 162,2).
  4. Bereid 58Fe(III)-nitrilotriacetaat (NTA) door 58Fe(III)Cl3 te incuberen met NTA bij een molaire verhouding van 1:5 in aanwezigheid van 20 mM NaHCO3.
    1. Bereid 500 mM NTA voor in 1 N NaOH.
    2. Bereid 5x transferrine-loading buffer (0,5 M HEPES, pH 7,5; 0,75 M NaCl).
    3. Bereid 1 M NaHCO3 in ultrapuur H2O.
    4. Voeg aan een conische buis van 15 ml 150 μL 100 mM 58Fe(III)Cl3-oplossing (uit stap 1.3.2), 150 μL 500 mM NTA bereid in 1 N NaOH, 480 μL ultrapuur H2O, 200 μL 5x transferrinelaadbuffer en 20 μL 1 M NaHCO3-oplossing toe.
    5. Incubeer het mengsel gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Laad apo-Tf met 58Fe(III)-NTA om 58Fe-Tf te vormen.
    OPMERKING: Dit protocol is aangepast van McCarthy en Kosman28.
    1. Los 500 mg apo-Tf op in 4 ml 1x Tf-laadbuffer.
    2. Voeg aan de conische buis van 15 ml in stap 1.4.4 die 1 ml van de 58Fe(III)-NTA-oplossing bevat, 4 ml apo-Tf-oplossing toe.
      OPMERKING: Dit is een 3:1 molaire verhouding van 58Fe-NTA met apo-Tf. Elke Tf bevat 2 Fe bindingsplaatsen; overmaat 58Fe-NTA werd toegevoegd om ervoor te zorgen dat Tf volledig geladen was.
    3. Om een maximale belasting van 58Fe-NTA op apo-Tf mogelijk te maken, controleert u of de oplossing een pH van 7,5 heeft en past u de pH indien nodig aan met NaHCO3 of HCl.
    4. Incubeer gedurende 2,5 uur bij kamertemperatuur.
  6. Verwijder overtollige ongebonden 58Fe(III)-NTA en vrijgegeven NTA.
    1. Breng de 58Fe-Tf-oplossing over in een afsnijkolom met molecuulgewicht (30 kDa cutoff) en centrifugeer bij 2.500 × g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Was de kolom met 10 ml 1x transferrinelaadbuffer en centrifugeer op 2.500 × g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal de was en centrifugatie, voer een zoutoplossing uit met 10 ml zoutoplossing en centrifugeer op 2.500 × g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  7. Bereken de concentratie van 58Fe-Tf.
    OPMERKING: Vanwege de toevoeging van overtollige 58Fe in stap 1.5.2, ga ervan uit dat alle transferrine diferrisch is. Aangezien 500 mg apo-Tf werd gebruikt, werd ~500 mg 58Fe-Tf geproduceerd in stap 1.5.4.
    1. Meet het volume dat is teruggewonnen na centrifugatie na de wassing met zoutoplossing in stap 1.6.2.
    2. Deel 500 mg door het teruggewonnen volume om de concentratie (in mg/ml) van de 58Fe-Tf-oplossing te bepalen.
  8. Steriliseer de 58Fe-Tf-oplossing met een spuitfilter van 0,22 μm; bewaren bij 4 °C totdat het klaar is voor gebruik.
    OPMERKING: 58Fe-Tf-oplossing werd gebruikt tussen 1 en 4 weken na de bereiding.

2. Getimede muizenzwangerschappen instellen

  1. Gebruik vrouwelijke muizen van 6 tot 8 weken oud. Plaats dieren op een ijzerarm dieet (4 ppm ijzer) of standaard chow (185 ppm ijzer) gedurende 2 weken voorafgaand aan de paring en onderhoud dieren op de respectieve diëten tijdens de zwangerschap.
  2. Optie 01: Bevestig de zwangerschap door gewichtstoename op E7.5.
    1. Stel meerdere kweekkooien in. Combineer voor elke kooi 's nachts 2 vrouwtjes met 1 mannetje; de volgende dag waarop de dieren worden gescheiden, wordt beschouwd als embryonale dag (E)0,5. Weeg vrouwtjes op E7,5 om te bepalen of ze zwanger zijn. Paren mannetjes opnieuw met vrouwtjes die niet zijn aangekomen.
      OPMERKING: In WT C57BL/6 is een gewichtstoename van 1 g bij E7.5 een goede indicator voor zwangerschap. Deze methode zorgt ervoor dat implantatie plaatsvond binnen een specifiek tijdsbestek van 16 uur, waardoor een synchrone behandeling mogelijk is van alle dieren die tijdens dezelfde paarperiode drachtig zijn geworden.
  3. Optie 02: Bevestig de zwangerschap door plugchecks.
    1. Combineer 2 vrouwtjes met 1 mannetje en voer dagelijkse plugcontroles uit om te bepalen of copulatie heeft plaatsgevonden.
      OPMERKING: Deze methode kan leiden tot gespreide zwangerschappen en de aanwezigheid van een plug garandeert geen zwangerschap.

3. Dien 58Fe-Tf intraveneus toe aan E17.5 zwangere muizen

  1. Bereid 58Fe-Tf uit stap 1.8 voor injectie voor.
    1. Bereid 58Fe-Tf oplossing op 35 mg / ml in zoutoplossing; injecteer 100 μL per muis.
    2. Vul een insulinespuit met 100 μL van de 58Fe-Tf oplossing.
      OPMERKING: Elke dosis bevat 3,5 mg humaan 58Fe-Tf (5 μg 58Fe).
  2. Verdoof een zwangere muis met isofluraan.
    1. Gebruik een isofluraanregelaar met een kamer.
    2. Gebruik de volgende instellingen: 5% isofluraan, 2 l/ml O2, 2 min.
    3. Bevestig dat de muis verdoofd is door te zoeken naar een gebrek aan reactie op een teenknijper.
    4. Breng oogsmeermiddel aan op het oppervlak van het oog en plaats de muis op een verwarmingskussen.
  3. Injecteer langzaam en voorzichtig de 58Fe-Tf-oplossing in de retro-orbitale sinus.
  4. Laat de muis herstellen van anesthesie; laat het dier niet onbeheerd achter totdat het weer voldoende bij bewustzijn is gekomen om de sternale lighouding te behouden.
  5. Zes uur na de injectie euthanaseer E17.5 zwangere vrouwen door een overdosis isofluraan.
    1. Voer een hartpunctie uit om de muis te exsanguineren als een vorm van secundaire euthanasie.
    2. Pin de voeten vast met naalden voor stabilisatie.
  6. Verzamel de placenta en embryolevers.
    1. Gebruik een steriele tang en dissectieschaar om de baarmoeder voorzichtig van de zwangere muis te verwijderen. Snijd een placentale foetale placenta-eenheid af, die bestaat uit een enkele foetus en placenta in de vruchtzak omringd door een deel van de baarmoeder.
    2. Snijd voorzichtig door de baarmoeder en vruchtzak zonder de foetus en placenta te verstoren.
    3. Pel de vruchtzak af en verwijder de foetus en placenta.
    4. Knip de navelstreng door.
    5. Dep de foetus en placenta op een schoon taakdoekje om het overtollige vruchtwater te verwijderen.
    6. Noteer de gewichten van de hele placenta.
    7. Snijd elke placenta doormidden met een scheermesje, plaats elke helft in een buisje van 2,0 ml en vries in vloeibare stikstof.
      OPMERKING: Omdat 58Fe geen speciale voorzorgsmaatregelen en verwijdering vereist, kan de ene helft van de placenta worden gebruikt voor 58Fe-metingen en de andere helft voor andere analyses, waaronder kwantificering van transferrinereceptor (TFR1) en ferroportine (FPN) expressie door western blotting en qPCR.
    8. Om embryolevers te verzamelen, offer je het embryo op: gebruik een scheermesje om het embryo snel te onthoofden.
      OPMERKING: Bij E17.5 moeten alle embryo's in de baarmoeder individueel worden geëuthanaseerd, zelfs als ze niet in het onderzoek worden gebruikt.
    9. Pin het embryo vast voor stabilisatie, waardoor de buik bloot komt te liggen.
    10. Maak met behulp van een dissectieschaar een kleine incisie waar de navelstreng was bevestigd, breng een uiteinde van de dissectieschaar in de incisie in en voer een mediaanvlak uit dat ongeveer 1/4 inch naar het coronale vlak is gesneden. Voer vervolgens dwarsvlaksneden uit om de foetale lever bloot te leggen.
    11. Gebruik een tang om de foetale lever te verwijderen.
    12. Noteer de gewichten van de hele embryolevers.
    13. Plaats de hele embryolevers in buisjes van 2 ml en vries ze in vloeibare stikstof.
      OPMERKING: Als alternatief kan slechts een deel van de embryolever worden gebruikt voor 58Fe-metingen als aanvullende analyses gewenst zijn. Het gebruik van buizen van 2,0 ml zorgt voor een betere weefselhomogenisatie dan buizen van 1,5 ml.
  7. Bewaar de weefsels voor onbepaalde tijd bij -80 °C.

4. Procesweefsels voor kwantitatieve ijzeranalyse door ICP-MS

  1. Verwerk de placenta en foetale levers voor de kwantificering van nonheme ijzer.
    1. Ontdooi placentahelften en hele foetale levers en weeg placentahelften (zie stap 3.6.12 voor het registreren van foetale levergewichten).
    2. Voeg 400 μL eiwitprecipitatie-oplossing (0,53 N HCl, 5,3% TCA) toe.
    3. Homogeniseer het weefsel met behulp van een elektrische homogenisator.
    4. Incubeer de monsters bij 100 °C gedurende 1 uur.
    5. Koel de monsters gedurende 2 min af in water op kamertemperatuur.
    6. Open de doppen om druk los te laten en sluit de buizen vervolgens weer.
    7. Centrifugeer bij 17.000 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur tot pelletweefselresten.
    8. Breng het supernatant voorzichtig over op een nieuw gelabelde buis.
    9. Stuur monsters af voor ICP-MS-analyse.
  2. Verwerk de placenta en foetale levers voor de kwantificering van heem-ijzer.
    OPMERKING: Na extractie van nonheme ijzer in stap 1 is het ijzer dat overblijft in de pellet voornamelijk heem.
    1. Noteer het gewicht van elke pellet uit stap 4.1.7.
    2. Verteer de pellets in 10 ml geconcentreerd 70% HNO3 aangevuld met 1 ml 30% H2O2
      OPMERKING: Overleg met de ICP-MS-kern of het centrum om het volume van HNO3 voor specifieke onderzoeken te optimaliseren; het volume zal deels afhankelijk zijn van het gewicht van de steekproef.
    3. Verwarm de monsters gedurende 15 minuten tot 200 °C.
    4. Stuur de monsters op voor ICP-MS-analyse.
      OPMERKING: Als het niet nodig is onderscheid te maken tussen heem- en niet-ijzerbronnen en alleen totaal ijzer wordt gemeten, kan het hele weefsel als eerste stap in HNO3 worden verteerd.

5. Data-analyse

OPMERKING: Gegevens van ICP-MS zijn verstrekt als 56Fe- en 58Fe-concentraties in ng/ml of mg, ppb (tabel 1). 56 Fe is de meest voorkomende ijzerisotoop in de natuur en de meting ervan weerspiegelt de ijzerophoping in de placenta / embryo gedurende de hele zwangerschap, terwijl 58Fe-meting ijzer weerspiegelt dat gedurende 6 uur na injectie werd overgedragen.

  1. Trek de natuurlijke abundantie van 58Fe (0,28% van de totale Fe) af van de gemeten 58Fe-waarden.
  2. Bereken totaal nonheme 58Fe.
    1. Bereken het totale niet-erfelijke ijzer (ng) van de embryolever door eerst de ijzerconcentratie (ng/ml) berekend in stap 5.1 te vermenigvuldigen met het volume (ml) tijdens de eerste verwerking in stap 4.1.2 om het totaal van 58fe te schatten.
    2. Bereken de hoeveelheid ijzer in de hele placenta door het totale gewicht van de placenta gemeten in stap 3.6.6 te nemen en deze te delen door het gewicht van de placenta die in stap 4.1.1 is verwerkt. Vermenigvuldig deze waarde met het totale niet-geheme ijzer (ng) berekend in stap 5.2.1 om het totale nonheme 58Fe-gehalte van de placenta te verkrijgen.
  3. Bereken totaal heem 58Fe.
    1. Bereken het totale heem 58Fe door eerst de in stap 5.1 berekende ijzerconcentratie (ng/mg) te vermenigvuldigen met het gewicht van de pellet (in mg), gemeten in stap 4.2.1.
    2. Deel vervolgens het totale gewicht van de placenta gemeten in stap 3.5.1 door het gewicht van de placentakorrel gemeten in stap 4.2.1. Vermenigvuldig deze waarde met het totale heemijzer (ng) berekend in stap 5.3.1 om het totale heem 58Fe-gehalte van de placenta te verkrijgen.
  4. Tel de berekende nonheme- en heem 58Fe-waarden op om het totale ijzergehalte voor elk weefsel te bepalen.

figure-protocol-1
Figuur 1: Visuele samenvatting van stappen in het protocol. (A) Voorbereiding van 58Fe-transferrine. (B) In vivo toediening van 58Fe-transferrine. C) Verzameling en opslag van weefsel. D) Verwerking van de placenta en de embryolever voor kwantificering van metaalsoorten door ICP-MS. Afkortingen: Fe = ijzer; NTA = nitrilotriacetinezuur; Tf = transferrine; PPS = eiwitprecipitatie-oplossing; Sup = supernatant; TCA = trichloorazijnzuur; ICP-MS = inductief gekoppelde plasmamassaspectrometrie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een eerdere studie met stabiele ijzerisotopen om ijzertransport te meten, toonde aan dat maternale ijzerdeficiëntie resulteerde in de downregulatie van de placenta-ijzerexporteur, FPN4. FPN is de enige bekende ijzerexporteur van zoogdieren en de afwezigheid van FPN tijdens de ontwikkeling resulteert in embryonale sterfte vóór E9.529. Om te bepalen of de waargenomen afname van de FPN-expressie zich functioneel vertaalde in een verminderd placenta-ijzertransport, werd 58...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IJzer is belangrijk voor veel biologische processen en de beweging en distributie ervan in het lichaam zijn zeer dynamisch en gereguleerd. Stabiele ijzerisotopen bieden een consistent en handig alternatief voor radioactieve isotopen voor de beoordeling van de dynamiek van ijzerhomeostase. Een cruciale stap in het protocol is het bijhouden van alle weefselgewichten en -volumes. IJzer is een element en kan daarom niet worden gesynthetiseerd of afgebroken. Dus als alle gewichten en volumes zorgvuldig worden geregistreerd, k...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EN is een wetenschappelijke mede-oprichter van Intrinsic LifeSciences en Silarus Pharma en een consultant voor Protagonist, Vifor, RallyBio, Ionis, Shield Therapeutics en Disc Medicine. VS verklaart geen conflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs erkennen het gebruik van de ICP-MS-faciliteit binnen het UC Center for Environmental Implications of Nanotechnology in CNSI bij UCLA voor hun hulp bij het optimaliseren van het protocol voor 58Fe-metingen. De studie werd ondersteund door het NIH National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) (K01DK127004, tot VS) en NIH National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) (R01HD096863, tot EN).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
58Fe-ijzermetaalTrace Sciences InternationalFe-58
Amicon ultra-15 centrifugale filter, 30 kDa cutoffMillipore SigmaUFC903024
Centrifuge tubes, 15 mLFisher Scientific14-959-49B
Centrifuge tubes, 50 mLMillipore SigmaCLS430829
Centrifuge, Sorvall Legend Micro 17 MicrocentrifugeFisher Scientific75002432
Centrifuge, Sorvall Legend RT
Delicate task wipersFisher Scientific06-666
Diet: ijzergebrek (4 ppm ijzer)Envigo TekladTD.80396
Diet: standaard voer (185 ppm ijzer)PicoLab5053
Dissectie schaar met 30 mm snijrandVWR25870-002
Forceps 4-1/2 inch lengteMcKesson157-469
HEPESFisher ScientificBP310-500
Homogenizer, Bio-Gen PRO200PROScientific01-01200
Human apo-transferrine (apo-Tf)Celliance4452-01niet langer beschikbaar, alternatief: Millipore 616419
Zoutzuur (HCl)Fisher ScientificA144S-500
Waterstofperoxide (H2O2), 35 wt.% oplossing in waterCole-ParmerEW-88216-36
Insulin spuiten, BD Lo-Dose U-100Fisher Scientific14-826-79
IsofluraanVETone502017
Isofluraan verdamperSummit Anesthesia Solutions
Metaal hitteblokFisher Scientific
Micro centrifuge tube met platte schroefdopVWR16466-064
Microcentrifuge tubes 1.5 mL laag-retentieFisher Scientific02-681-320
Microcentrifuge tubes 2.0 mL laag-retentieFisher Scientific02-681-321
Millex-GP spuit filter unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma-gesteriliseerdMillipore SigmaSLGP033RS
Nitrilotriacetic acid (NTA)Sigma72560-100G
Naald 25 G x 5/8 in. hypodermisch algemeen gebruikFisher Scientific14-826AA
pH Strips, plastic pH5.0-9.0Fisher Scientific13-640-519
Veiligheidsschaafjes 0.22 mmVWR55411-050
Schaal (g)Mettler ToledoPB1502-S
Schaal (mg)Mettler ToledoBalance XS204
Natriumbicarbonaat (NaHCO3)SigmaS5761-500G
Natriumchloride (NaCl)Fisher ScientificS671-3
Natriumhydroxide (NaOH)Fisher ScientificSS266-1
Steriele spuit, slip tip (1 mL)Fisher Scientific309659
Trichloroazijnzuur (TCA)Fisher ScientificA322-500
Software
ImageLabBio-Rad
SigmaPlotSystat

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ganz, T. Systemic iron homeostasis. Physiological Reviews. 93 (4), 1721-1741 (2013).
  2. Aschemeyer, S., et al. Structure-function analysis of ferroportin defines the binding site and an alternative mechanism of action of hepcidin. Blood. 131 (8), 899-910 (2018).
  3. Sangkhae, V., Nemeth, E. Regulation of the iron homeostatic hormone hepcidin. Advances in Nutrition. 8 (1), 126-136 (2017).
  4. Sangkhae, V., et al. Effects of maternal iron status on placental and fetal iron homeostasis. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 625-640 (2020).
  5. Whittaker, P. G., Lind, T., Williams, J. G. Iron absorption during normal human pregnancy: a study using stable isotopes. British Journal of Nutrition. 65 (3), 457-463 (1991).
  6. Whittaker, P. G., Barrett, J. F., Lind, T. The erythrocyte incorporation of absorbed non-haem iron in pregnant women. British Journal of Nutrition. 86 (3), 323-329 (2001).
  7. O'Brien, K. O., Zavaleta, N., Abrams, S. A., Caulfield, L. E. Maternal iron status influences iron transfer to the fetus during the third trimester of pregnancy. American Journal of Clinical Nutrition. 77 (4), 924-930 (2003).
  8. Young, M. F., et al. Maternal hepcidin is associated with placental transfer of iron derived from dietary heme and nonheme sources. Journal of Nutrition. 142 (1), 33-39 (2012).
  9. Delaney, K. M., et al. Iron absorption during pregnancy is underestimated when iron utilization by the placenta and fetus is ignored. American Journal of Clinical Nutrition. 112 (3), 576-585 (2020).
  10. Klatt, K. C., Smith, E. R., Barberio, M. D. Toward a more stable understanding of pregnancy micronutrient metabolism. American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 321 (2), 260-263 (2021).
  11. Fisher, A. L., Nemeth, E. Iron homeostasis during pregnancy. American Journal of Clinical Nutrition. 106, Suppl 6 1567-1574 (2017).
  12. van Santen, S., et al. The iron regulatory hormone hepcidin is decreased in pregnancy: a prospective longitudinal study. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 51 (7), 1395-1401 (2013).
  13. Millard, K. N., Frazer, D. M., Wilkins, S. J., Anderson, G. J. Changes in the expression of intestinal iron transport and hepatic regulatory molecules explain the enhanced iron absorption associated with pregnancy in the rat. Gut. 53 (5), 655-660 (2004).
  14. Bothwell, T. H., Pribilla, W. F., Mebust, W., Finch, C. A. Iron metabolism in the pregnant rabbit; iron transport across the placenta. American Journal of Physiology. 193 (3), 615-622 (1958).
  15. Dyer, N. C., Brill, A. B., Raye, J., Gutberlet, R., Stahlman, M. Maternal-fetal exchange of 59 Fe: radiation dosimetry and biokinetics in human and sheep studies. Radiation Research. 53 (3), 488-495 (1973).
  16. Contractor, S. F., Eaton, B. M. Role of transferrin in iron transport between maternal and fetal circulations of a perfused lobule of human placenta. Cell Biochemistry & Function. 4 (1), 69-74 (1986).
  17. Baker, E., Morgan, E. H. The role of transferrin in placental iron transfer in the rabbit. Quartly Jounrnal of Experimental Physiolology and Cognate Medical Sciences. 54 (2), 173-186 (1969).
  18. Fleming, R. E., Feng, Q., Britton, R. S. Knockout mouse models of iron homeostasis. Annual Review of Nutrition. 31, 117-137 (2011).
  19. Soares, M. J., Varberg, K. M., Iqbal, K. Hemochorial placentation: development, function, and adaptations. Biology of Reproduction. 99 (1), 196-211 (2018).
  20. Jones, H. N., Powell, T. L., Jansson, T. Regulation of placental nutrient transport--a review. Placenta. 28 (8-9), 763-774 (2007).
  21. Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
  22. Takata, K., Kasahara, T., Kasahara, M., Ezaki, O., Hirano, H. Immunolocalization of glucose transporter GLUT1 in the rat placental barrier: possible role of GLUT1 and the gap junction in the transport of glucose across the placental barrier. Cell and Tissue Research. 276 (3), 411-418 (1994).
  23. Shin, B. C., et al. Immunolocalization of GLUT1 and connexin 26 in the rat placenta. Cell and Tissue Research. 285 (1), 83-89 (1996).
  24. Bastin, J., Drakesmith, H., Rees, M., Sargent, I., Townsend, A. Localisation of proteins of iron metabolism in the human placenta and liver. British Journal of Haematology. 134 (5), 532-543 (2006).
  25. Klausner, R. D., Ashwell, G., van Renswoude, J., Harford, J. B., Bridges, K. R. Binding of apotransferrin to K562 cells: explanation of the transferrin cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80 (8), 2263-2266 (1983).
  26. Tsunoo, H., Sussman, H. H. Characterization of transferrin binding and specificity of the placental transferrin receptor. Archives of Biochemistry and Biophysics. 225 (1), 42-54 (1983).
  27. Sangkhae, V., Nemeth, E. Placental iron transport: The mechanism and regulatory circuits. Free Radical Biology and Medicine. 133, 254-261 (2019).
  28. McCarthy, R. C., Kosman, D. J. Mechanistic analysis of iron accumulation by endothelial cells of the BBB. Biometals. 25 (4), 665-675 (2012).
  29. Donovan, A., et al. The iron exporter ferroportin/Slc40a1 is essential for iron homeostasis. Cell Metabolism. 1 (3), 191-200 (2005).
  30. Stefanova, D., et al. Endogenous hepcidin and its agonist mediate resistance to selected infections by clearing non-transferrin-bound iron. Blood. 130 (3), 245-257 (2017).
  31. Ramos, E., et al. Evidence for distinct pathways of hepcidin regulation by acute and chronic iron loading in mice. Hepatology. 53 (4), 1333-1341 (2011).
  32. Kulandavelu, S., Qu, D., Adamson, S. L. Cardiovascular function in mice during normal pregnancy and in the absence of endothelial NO synthase. Hypertension. 47 (6), 1175-1182 (2006).
  33. Lu, C. C., Matsumoto, N., Iijima, S. Placental transfer and body distribution of nickel chloride in pregnant mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 59 (3), 409-413 (1981).
  34. Gunshin, H., et al. Slc11a2 is required for intestinal iron absorption and erythropoiesis but dispensable in placenta and liver. Journal of Clinical Investigation. 115 (5), 1258-1266 (2005).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Placentaire ijzeroverdrachtstabiele ijzerisotopentransferrine gebonden ijzerICP MS analysefoetaal leverijzerweefselhomogenisatieijzerkwantificatie

Gerelateerde artikelen