Het huidige protocol beschrijft stapsgewijze richtlijnen voor de RNAi-operatietechnieken in P. americana.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Toepassingen van RNA-interferentie in Amerikaanse kakkerlak
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Kakkerlakken, een sanitaire plaag, zijn essentiële soorten in insectenontwikkelings- en metamorfe studies vanwege hun gemakkelijke voeding en hemimetaboleuze kenmerken. Al met goed geannoteerde genoomsequenties hebben deze voordelen de Amerikaanse kakkerlak Periplaneta americana tot een belangrijk hemimetabolous insectenmodel gemaakt. Beperkt door het tekort aan knock-outstrategie, wordt effectieve RNA-interferentie (RNAi) -gebaseerde gen knockdown een onmisbare techniek in functioneel genonderzoek van P. americana. Het huidige protocol beschrijft de RNAi-operatietechnieken in P. americana. Het protocol omvat (1) selectie van de P. americana in de juiste ontwikkelingsstadia, (2) voorbereiding op de injectie-instelling, (3) dsRNA-injectie en (4) detectie van gen knockdown-efficiëntie. RNAi is een krachtig omgekeerd genetisch hulpmiddel in P. americana. De meerderheid van de P. americana weefsels zijn gevoelig voor extracellulair dsRNA. De eenvoud stelt onderzoekers in staat om snel disfunctionele fenotypes te verkrijgen onder een of meerdere gerichte dsRNA-injecties, waardoor onderzoekers de P. americana beter kunnen gebruiken voor ontwikkelings- en metamorfe studies.
Inleiding
RNA-interferentie (RNAi), een evolutionair geconserveerd mechanisme, wordt geleidelijk een essentieel omgekeerd genetisch hulpmiddel om genexpressie in veel organismen te remmen1, sinds Andrew Fire en Craig Mello2 de dubbelstrengs RNA (dsRNA) gemedieerde genstilte strategie ontwikkelden. dsRNA wordt door het enzym Dicer in cellen gesplitst in fragmenten van 21-23 nucleotiden, kleine interfererende RNA's (siRNA's), om de RNAi-route te activeren. Vervolgens worden siRNA's opgenomen in het RNA-geïnduceerde silencing complex (RISC), dat koppelt aan het doelmRNA, mRNA-splitsing veroorzaakt en uiteindelijk resulteert in het verlies van genfunctie 3,4,5. Onder de insectensoorten zijn tot nu toe veel systemische RNAi-experimenten gemeld in veel insectenorden, zoals Orthoptera, Isoptera, Hemiptera, Coleoptera, Neuroptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera en Blattodea 5,6,7,8.
Kakkerlakken (Blattaria) zijn een essentiële insectenfamilie in ontwikkelings- en metamorfe studies met hun snelle groeicycli, sterk aanpassingsvermogen aan de omgeving en hoge ontwikkelingsplasticiteit9. Voordat werd ontdekt dat RNAi compatibel was met kakkerlakken, richtte eerder onderzoek zich alleen op kakkerlakkenpreventie en -bestrijding vanwege een schaarste aan genetische manipulatietechnieken bij kakkerlakken. De unieke structuur van de kakkerlak ootheca maakte het een uitdaging om op embryo-injectie gebaseerde gen knock-out uit te voeren met het CRISPR-Cas9-systeem. Bovendien vertonen de meeste weefsels in kakkerlakken (zoals P. americana) een robuuste systemische RNAi-respons, waardoor de snelle generatie van disfunctionele fenotypen mogelijk is door een of meer gerichte dsRNA's 9,10,11 te injecteren. Deze eigenschappen maakten RNAi tot een onmisbare techniek in genfunctioneel onderzoek bij P. americana.
Hoewel het gebruik van RNAi in functioneel genonderzoek bij P. americana is gemeld, was er geen gedetailleerde of stapsgewijze beschrijving beschikbaar. Dit rapport biedt een stapsgewijze operationele richtlijn voor RNAi in P. americana, nuttig voor genfunctiestudie bij andere kakkerlakken. Bovendien is deze gids niet beperkt tot Blattodea en kan deze met kleine aanpassingen op veel andere insecten worden toegepast.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De lijn van P. americana werd aanvankelijk verzorgd door Dr. Huiling Hao. Deze soort wordt al 30 jaar inteelt gehouden9.
1. Uitkomen en voeren van P. americana
- Verzamel verse oothecae (onmiddellijk na het leggen van eieren) van P. americana en incubeer in de donkere incubator bij 25 °C en 60% vochtigheid gedurende ~ 25 dagen. Verhoog vervolgens de temperatuur en luchtvochtigheid tot 30 °C en 75% 3 dagen voor het uitkomen.
- Gebruik een zeef met 4 mm opening om de uitgekomen nimfen van oothecae te scheiden.
- Bewaar de nimfen in cilindrische containers (12 cm in diameter en 10 cm hoog) in het donker bij 28 °C, 70% vochtigheid. Bestrijk de binnenrand van de containers met vaseline om te voorkomen dat kakkerlakken ontsnappen. Zorg voor rattenvoer, water en onderdak (eierschalen). Besteed aandacht aan de activiteit van de nimfen en ruim regelmatig de uitwerpselen en puin op.
2. Selectie van de nimfen in de juiste instar
- Gebruik een glazen buis om de vers vervelde P. americana (wit van lichaamskleur) eruit te pikken. Bewaar ze in nieuwe containers en wacht op de juiste fase voor behandeling.
OPMERKING: Na ~ 19 dagen onder de bovenstaande voedingsomstandigheden, zullen de nimfen in de3e instars beschikbaar zijn voor injectie. De kleur van vers vervelde kakkerlakken is wit en de instars worden verduidelijkt door ruitijden.
3. Voorbereiding van het doelfragment met T7-promotors
- Met behulp van het cDNA van P. americana als sjabloon, ontwerpt u gepaarde primers om PCR uit te voeren om 300-800 bp DNA-fragment van het doelgen9 te verkrijgen. Kloon vervolgens het PCR-fragment in een pTOPO-vector (zie Tabel met materialen) voor sequencing.
- Gebruik het dna van het doelfragment als sjabloon, synthetiseer een nieuw paar primers met T7-promotorsequentie (5'-GGATCCTAATACGACTCACTATAGG-3') op de 5'-terminals en voer nog een ronde PCR uit om het doelfragment te verkrijgen met T7-promotors aan elke kant9.
4. Transcriptie en synthese van dsRNA in vitro
- Voeg 10 μL T7 2X Buffer, 2 μL van de Enzyme Mix, T7 Express (zie Tabel met materialen) en 2 μg PCR-product (verkregen in stap 3.2) toe aan het reactiesysteem en tel het totale volume op tot 20 μL met ddH2O. Meng voorzichtig ondersteboven handmatig en incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten en 70 °C gedurende 10 minuten, en vervolgens langzaam afkoelen tot kamertemperatuur.
- Verdun RNase A-oplossing (4 μg/μL) met ddH2O in een verhouding van 1:200. Voeg vervolgens 1 μL RQ1 RNase-Free DNase (1 U/μL) en 1 μL verdunde RNase A-oplossing toe aan het systeem (zie Materialentabel).
OPMERKING: Nu is het volume van een enkel systeem 22 μL. - Incubeer bij 37 °C gedurende 30 min. Voeg vervolgens 10% van het totale volume toe (bij gelijktijdige uitvoering van N-reacties is het totale volume N x 22 μL) natriumacetaat en drie volumes van het totale volume isopropanol.
- Voorzichtig ondersteboven handmatig mengen, gedurende 5 minuten op ijs leggen en centrifugeer bij 13.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
- Verwijder het supernatant met een pipet, was het residu met 75% ethanol (met 25% met 25% met diethylpyrocarbonaat (DEPC) behandeld water) en centrifugeer vervolgens gedurende 5 minuten bij 4 °C op 13.000 x g .
- Verwijder supernatant weer. Droog de pellet gedurende 15 minuten aan de lucht bij kamertemperatuur. Gebruik ~100 μL DEPC-water om dsRNA op te lossen en verdun het dsRNA vervolgens tot de laatste 2 μg/μL.
OPMERKING: Het dsRNA kan gedurende 6 maanden bij -80 °C worden bewaard.
5. DSRNA-oplossing in de spuit laden
- Stel het programma van tevoren in de micro-injectiepomp (zie Materialentabel) in om ervoor te zorgen dat het volume van elke injectie consistent is. Voordat u de spuit gebruikt, reinigt u de spuit door deze 8-10 keer te vullen met DEPC-water.
- Installeer de spuit van 10 μL op de micro-injectiepomp, start de pomp en vul de spuit met 10 μL dsRNA-oplossing (bereid in stap 4.6). Injecteer 1 μL van het dsRNA in een3e instar nimf (zie stap 2) en zorg ervoor dat deze niet naar het lichaam lekt.
6. DSRNA injecteren in P. americana
- Verdoof de kakkerlakken met een verhoogde concentratie CO2 in een container totdat de kakkerlakken niet meer bewegen en ga dan onmiddellijk verder met de injectie.
- Pak de kakkerlak voorzichtig op met een pincet en breng de kakkerlak met de hand naar de naald. Breng vervolgens de naald in via de opening tussen twee buikzolen horizontaal tegen de opperhuid. Over insteekdiepte, hoe ondieper, hoe beter.
- Injecteer vervolgens de dsRNA-oplossing in de kakkerlak. Trek ten slotte de naaldpunt eruit. Zorg ervoor dat de punt van de naald zich zo dicht mogelijk bij de opperhuid bevindt om beschadiging van inwendige organen te voorkomen.
OPMERKING: De injectie moet worden gemaakt onder een dissectiemicroscoop. - Doe de geïnjecteerde kakkerlakken in schone bioassay-containers. Wacht ongeveer 10-20 minuten om ze te laten herstellen van de CO2-effecten . Label de containers met de datum van injectie, type en dosis dsRNA en leeftijd van de P. americana.
- Plaats de geïnjecteerde kakkerlakken in een donkere omgeving bij 28 ° C, 70% vochtigheid, zorg voor water, voer en beschutting en observeer mogelijke veranderingen in het fenotype van de kakkerlakken regelmatig.
7. Knockdown bevestiging en fenotypische analyse
- Evalueer de efficiëntie van RNAi met behulp van alle beschikbare moleculair biologische technieken zoals kwantitatieve Real-Time PCR (qRT-PCR) en Western blotting. Voor gedetailleerde qRT-PCR en Western blotting procedures, zie referenties 1,12.
- Om RNAi-gerelateerde fenotypen te observeren en te analyseren, gebruikt u de microscoop die geschikt is voor levende dieren.
OPMERKING: RNAi kan de morfologie, het gedrag, de rui, de regeneratie van ledematen en andere fysiologische activiteiten van kakkerlakken beïnvloeden. De specifieke frequentie van fenotype wordt berekend op basis van specifieke omstandigheden.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 1 toont een geslaagde injectie. De micro-injectiespuit met naald met microdiameter moet horizontaal op de booster worden geplaatst (figuur 1A). De naald wordt via de opening tussen twee buikspierieten horizontaal tegen de opperhuid ingebracht (figuur 1B). Zorg ervoor dat de vloeistof in de P. americana buik gaat. De te steile hoek van de naald zal de inwendige organen beschadigen (figuur...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit rapport beschreef een methodologische stap-voor-stap RNAi-strategie in P. americana; van belang, het kan ook worden toegepast op andere kakkerlakken (Blattella germanica, bijvoorbeeld) en vele andere insecten met kleine veranderingen. De gen-uitschakelingsefficiëntie van RNAi is echter niet altijd hoog genoeg, met een duidelijk nadeel ten opzichte van de gen knock-out strategie13. Het volgende residuele effect van genniveau kan interfereren met de echte fenotypen. Om ervoor t...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 32070500, 31620103917, 31330072, and 31572325 to C.R., Sh.L.), by the Natural Science Foundation of Guangdong Province (Grant No. 2021B1515020044 and 2020A1515011267 to C.R.), by the Department of Science and Technology in Guangdong Province (Grant Nos. 2019B090905003 and 2019A0102006), by the Department of Science and Technology in Guangzhou (Grant No. 202102020110), door het Shenzhen Science and Technology Program (Grant No. KQTD20180411143628272 naar Sh.L.).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 701 N 10 µL Syr (26s/51/2) | Hamilton | PN:80300 | Injectie |
| Incubator | Ningbo Jiangnan Instrument Factory | RXZ-380A-LED | Voor het uitbroeden en voeren van kakkerlakken |
| Micro-injectiepomp | Alcott Biotechnology | ALC-IP600 | Injectie |
| pTOPO-Blunt Cloning Kit | Aidlab Biotechnology | CV16 | Voor genklonen |
| Kwantitatieve Real-Time PCR Systemen | Bio-Rad | CFX Connect | Voor qRT-PCR-analyse |
| T7 RiboMAX Express RNAi Systeem | Promega | P1700 | Voor dsRNA-synthese, dat Rnase A-oplossing bevat (4 μg/μL), Natriumacetaat, 3,0M (pH 5,2), Enzymmix, T7 Express, Nuclease-vrij water, Express T7 2x-buffer, RQ1 RNase-vrije DNase |
| Thermische cyclers | Bio-Rad | S1000 | Voor DNA-amplificatie |
Referenties
- Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum: Parameters affecting the efficiency of RNAi. PloS One. 7 (10), 47431(2012).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Ambesajir, A., Kaushik, A., Kaushik, J. J., Petros, S. T. RNA interference: A futuristic tool and its therapeutic applications. Saudi Journal of Biological Sciences. 19 (4), 395-403 (2012).
- Younis, A., Siddique, M. I., Kim, C. K., Lim, K. B. RNA interference (RNAi) induced gene silencing: A promising approach of hi-tech plant breeding. International Journal of Biological Sciences. 10 (10), 1150-1158 (2014).
- Bellés, X. Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).
- French, A. S., Meisner, S., Liu, H., Weckström, M., Torkkeli, P. H. Transcriptome analysis and RNA interference of cockroach phototransduction indicate three opsins and suggest a major role for TRPL channels. Frontiers in Physiology. 6, 207(2015).
- Hennenfent, A., Liu, H., Torkkeli, P. H., French, A. S. RNA interference supports a role for Nanchung-Inactive in mechanotransduction by the cockroach, Periplaneta americana, tactile spine. Invertebrate Neuroscience: IN. 20 (1), 1(2020).
- Immonen, E. V., et al. EAG channels expressed in microvillar photoreceptors are unsuited to diurnal vision. The Journal of Physiology. 595 (16), 5465-5479 (2017).
- Li, S., et al. The genomic and functional landscapes of developmental plasticity in the American cockroach. Nature Communications. 9 (1), 1008(2018).
- Zhao, Z., et al. Grainy head signaling regulates epithelium development and ecdysis in Blattella germanica. Insect Science. 28 (2), 485-494 (2021).
- Lozano, J., Belles, X. Conserved repressive function of Krüppel homolog 1 on insect metamorphosis in hemimetabolous and holometabolous species. Scientific Reports. 1, 163(2011).
- Philip, B. N., Tomoyasu, Y. Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection. Methods in Molecular Biology (Clifton, N. J). 772, 471-497 (2011).
- Zheng, Y., et al. CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivation in the brain. Nature Neuroscience. 21 (3), 447-454 (2018).
- Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).
- Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. Functional anatomy of a dsRNA trigger: differential requirement for the two trigger strands in RNA interference. Molecular Cell. 6 (5), 1077-1087 (2000).
- Lemonds, T. R., Liu, J., Popadić, A. The contribution of the melanin pathway to overall body pigmentation during ontogenesis of Periplaneta americana. Insect Science. 23 (4), 513-519 (2016).
- Jackson, A. L., Linsley, P. S. Noise amidst the silence: Off-target effects of siRNAs. Trends in Genetics: TIG. 20 (11), 521-524 (2004).
- Patel, M., Peter, M. E. Identification of DISE-inducing shRNAs by monitoring cellular responses. Cell Cycle (Georgetown, Tex). 17 (4), 506-514 (2018).
- Ventós-Alfonso, A., Ylla, G., Montañes, J. C., Belles, X. DNMT1 promotes genome methylation and early embryo development in cockroaches. iScience. 23 (12), 101778(2020).
- Wang, K., et al. Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 77, 1-9 (2016).
- Bi, F., Liu, N., Small Fan, D. interfering RNA: A new tool for gene therapy. Current Gene Therapy. 3 (5), 411-417 (2003).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
