Method Article

Een robuuste cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) verwerkingsworkflow met één deeltje met cryoSPARC, RELION en Scipion

DOI:

10.3791/63387

⸱

January 31st, 2022

 , 
1Institute for Quantitative Biomedicine, Rutgers University, 2Department of Biochemistry & Microbiology, Rutgers University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit artikel wordt beschreven hoe u effectief gebruik kunt maken van drie cryo-EM-verwerkingsplatforms, d.w.z. cryoSPARC v3, RELION-3 en Scipion 3, om een enkele en robuuste workflow te creëren die van toepassing is op een verscheidenheid aan datasets met één deeltje voor structuurbepaling met hoge resolutie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Recente ontwikkelingen in zowel instrumentatie- als beeldverwerkingssoftware hebben cryo-elektronenmicroscopie met één deeltje (cryo-EM) tot de voorkeursmethode gemaakt voor structuurbiologen om structuren met hoge resolutie van een breed scala aan macromoleculen te bepalen. Meerdere softwaresuites zijn beschikbaar voor nieuwe en deskundige gebruikers voor beeldverwerking en structuurberekening, die dezelfde basisworkflow stroomlijnen: films die door de microscoopdetectoren zijn verkregen, ondergaan correctie voor beam-induced motion and contrast transfer function (CTF) schatting. Vervolgens worden deeltjesafbeeldingen geselecteerd en geëxtraheerd uit gemiddelde filmframes voor iteratieve 2D- en 3D-classificatie, gevolgd door 3D-reconstructie, verfijning en validatie. Omdat verschillende softwarepakketten verschillende algoritmen gebruiken en verschillende niveaus van expertise vereisen om te werken, verschillen de 3D-kaarten die ze genereren vaak in kwaliteit en resolutie. Gebruikers dragen dus regelmatig gegevens over tussen verschillende programma's voor optimale resultaten. Dit artikel biedt een handleiding voor gebruikers om door een workflow te navigeren in de populaire softwarepakketten: cryoSPARC v3, RELION-3 en Scipion 3 om een bijna atomaire resolutiestructuur van het adeno-geassocieerde virus (AAV) te verkrijgen. We beschrijven eerst een beeldverwerkingspijplijn met cryoSPARC v3, omdat de efficiënte algoritmen en gebruiksvriendelijke GUI gebruikers in staat stellen om snel tot een 3D-kaart te komen. In de volgende stap gebruiken we PyEM en interne scripts om deeltjescoördinaten van de beste kwaliteit 3D-reconstructie verkregen in cryoSPARC v3 naar RELION-3 en Scipion 3 te converteren en over te dragen en 3D-kaarten opnieuw te berekenen. Ten slotte schetsen we stappen voor verdere verfijning en validatie van de resulterende structuren door algoritmen van RELION-3 en Scipion 3 te integreren. In dit artikel beschrijven we hoe u drie verwerkingsplatforms effectief kunt gebruiken om een enkele en robuuste workflow te creëren die van toepassing is op een verscheidenheid aan datasets voor het bepalen van de structuur met hoge resolutie.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) en single-particle analysis (SPA) maken structuurbepaling mogelijk van een breed scala aan biomoleculaire assemblages in hun gehydrateerde toestand, waardoor de rollen van deze macromoleculen in atomair detail worden verlicht. Verbeteringen in microscoopoptiek, computerhardware en beeldverwerkingssoftware hebben het mogelijk gemaakt om structuren van biomoleculen te bepalen met een resolutie die verder reikt dan 2 Å1,2,3. Meer dan 2.300 cryo-EM-structuren werden in 2020 in de Protein Data Bank (PDB) gedeponeerd, vergeleken met 192 structur....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Een nieuw cryoSPARC v3-project maken en gegevens importeren

OPMERKING: Gegevens werden verkregen aan de Oregon Health and Science University (OHSU) in Portland met behulp van een 300 kV Titan Krios elektronenmicroscoop uitgerust met een Falcon 3 directe elektronendetector. Beelden werden verzameld in een telmodus met een totale dosis van 28,38 e−/Å2 gefractioneerd over 129 frames en een onscherptebereik van -0,5 μm tot -2,5 μm, bij een pixelgrootte van 1,045 Å met behulp van EPU. De sample van AAV-DJ werd verzorgd door het personeel van OHSU.

  1. Open cryoSPARC v3 in een webbrowser en klik op ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben een uitgebreide SPA-pijplijn gepresenteerd om een structuur met hoge resolutie te verkrijgen met behulp van drie verschillende verwerkingsplatforms: cryoSPARC v3, RELION-3 en Scipion 3. Figuur 1 en figuur 4 geven een overzicht van de algemene verwerkingsworkflow en tabel 1 geeft details over verfijningsprotocollen. Deze protocollen werden gebruikt tijdens verfijningen van een 2,3 Å-structuur van AAV, waardoor een resolutie in de buurt .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit artikel presenteren we een robuuste SPA-workflow voor cryo-EM-gegevensverwerking op verschillende softwareplatforms om 3D-reconstructies met hoge resolutie te bereiken (figuur 1). Deze workflow is toepasbaar op een breed scala aan biologische macromoleculen. De volgende stappen van het protocol worden beschreven in figuur 4, inclusief filmvoorbewerking, deeltjesverzameling en -classificatie en meerdere methoden voor structuurverfijningen (tabel

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We bedanken Carlos Oscar Sorzano voor hulp bij de installatie van Scipion3 en Kilian Schnelle en Arne Moeller voor hulp bij gegevensoverdracht tussen verschillende verwerkingsplatforms. Een deel van dit onderzoek werd ondersteund door NIH-subsidie U24GM129547 en uitgevoerd bij de PNCC bij OHSU en toegankelijk via EMSL (grid.436923.9), een DOE Office of Science User Facility gesponsord door het Office of Biological and Environmental Research. Deze studie werd ondersteund door een start-up grant van Rutgers University aan Arek Kulczyk.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CryoSPARCStructura Biotechnology Inc.https://cryosparc.com/
CTFFIND 4Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical Schoolhttps://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4
MotionCorr2UCSF Macromolecular Structure Grouphttps://msg.ucsf.edu/software
PhenixComputational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC)http://www.phenix-online.org/
PyEMUniverisity of California, San Franciscohttps://github.com/asarnow/pyem
RELIONMRC Laboratory of Structural Biologyhttps://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page
ScipionInstruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLabhttp://scipion.i2pc.es/
UCSF ChimeraUCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informaticshttps://www.cgl.ucsf.edu/chimera/

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bartesaghi, A., et al. Atomic resolution Cryo-EM structure of beta-galactosidase. Structure. 26 (6), 848-856 (2018).
  2. Merk, A., et al. Breaking Cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery. Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).
  3. Wardell, M.,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Particle Cryo EMCryoSPARC WorkflowRELION ProcessingScipion Integration3D ReconstructionMotion CorrectionCTF EstimationParticle Picking2D ClassificationAdeno Associated Virus

Related Articles