Method Article

Efficiënte SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Speeksel diagnostische strategie met behulp van Open-Source Pipetteerrobots

DOI:

10.3791/63395

⸱

February 11th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Innovative Medical Devices and Sensors (REDDI Lab), Clemson University, 2Department of Bioengineering, Clemson University, 3Swann Medicine, 4Student Health Services, Clemson University, 5Department of Chemical & Biomolecular Engineering, Clemson University, 6Department of Chemical & Biomolecular Engineering, University of Delaware

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol beschrijft een SARS-CoV-2 diagnostische methode die open-source automatisering gebruikt om RT-qPCR moleculaire testen van speekselmonsters uit te voeren. Deze schaalbare aanpak kan worden toegepast op klinisch toezicht op de volksgezondheid en om de capaciteit van kleinere universitaire laboratoria te vergroten.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De opkomst van de recente SARS-CoV-2 wereldwijde gezondheidscrisis bracht belangrijke uitdagingen voor epidemiologisch onderzoek en klinische testen met zich mee. Gekenmerkt door een hoge overdrachtsgraad en lage mortaliteit, vereiste de COVID-19-pandemie nauwkeurige en efficiënte diagnostische tests, vooral in gesloten populaties zoals residentiële universiteiten. De initiële beschikbaarheid van nucleïnezuurtests, zoals nasofaryngeale swabs, was beperkt vanwege de druk in de toeleveringsketen die ook de rapportage van testresultaten vertraagde. Speeksel-gebaseerde reverse transcriptase kwantitatieve polymerase kettingreactie (RT-qPCR) testen is gebleken vergelijkbaar te zijn in gevoeligheid en specificiteit met andere testmethoden, en speekselverzameling is minder fysiek invasief voor deelnemers. Daarom ontwikkelden we een multiplex RT-qPCR diagnostische test voor populatiesurveillance van Clemson University en de omliggende gemeenschap. De test maakte gebruik van open-source vloeistofbehandelingsrobots en thermocyclers in plaats van complexe klinische automatiseringssystemen om de workflow en systeemflexibiliteit te optimaliseren. Automatisering van speekselgebaseerde RT-qPCR maakt snelle en nauwkeurige detectie van een breed scala aan virale RNA-concentraties mogelijk voor zowel grootschalige als kleinschalige testvereisten. De gemiddelde doorlooptijd voor het geautomatiseerde systeem was < 9 uur voor 95% van de monsters en < 24 uur voor 99% van de monsters. De kosten voor een enkele test waren $ 2,80 toen alle reagentia in bulkhoeveelheden werden gekocht.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ernstig acuut respiratoir syndroom-geassocieerd coronavirus-2 (SARS-CoV-2), een nieuw coronavirus, dook eind 2019 op en verspreidde zich snel over de wereldbevolking1. De SARS-CoV-2-infectie veroorzaakt coronavirusziekte 2019 (COVID-19), een zeer besmettelijke ziekte met mogelijk ernstige ademhalings- en ontstekingsverschijnselen. Hoge overdraagbaarheid in combinatie met een lage mortaliteit gaven aan dat het virus zich snel door populaties zou verspreiden en meer diagnostische tests zou vereisen2,3. Aanbevelingen op het gebied van de volksgezondheid moedigden grootschalige bevolkingsscreening aan om gevallen te isoleren en vervolgens de transmissiesnelheden te verlagen4,5,6. Bovendien toonden modellen van populatiesurveillance aan dat het verhogen van de testfrequentie en het verkorten van de rapportagetijd een groter effect hadden op het verminderen van de transmissie dan het verhogen van de testgevoeligheid7. Dit komt waarschijnlijk omdat geïnfecteerde personen eerder in quarantaine kunnen worden geplaatst, waardoor infectieketens worden verbroken.

De oorspronkelijke nucleïnezuurversterkingstest (NAAT) standaard was nasopharyngeale (NP) swabs verwerkt door RT-qPCR8. Complicaties doen zich echter voor bij deze vorm van testen voor zeer grote populaties, zoals verhoogde relatieve kosten en verhoogde druk in de toeleveringsketen9,10. Bovendien zijn zowel het verzamelen van monsters als de verwerking van veelgebruikte NAAT-methoden (waaronder NP-swabs, orofaryngeale swabs, mid-turbinate swabs en neusuitstrijkjes) afhankelijk van gespecialiseerde apparatuur, reagentia en medisch personeel9,10.

Een adequate vervanging voor NP swab RT-qPCR-testen is speeksel-gebaseerde testen, wat een nauwkeurig diagnostisch hulpmiddel is voor SARS-CoV-2 detectie11,12,13,14. Het direct uitvoeren van RT-qPCR op speekselmonsters levert een vergelijkbare gevoeligheid en specificiteit op als NP swabs15. Een groot voordeel van speekseltesten ten opzichte van NP-swabtesten is dat het zelfverzameling van monsters mogelijk maakt16. Dit minimaliseert de behoefte aan medisch personeel en maximaliseert het gemak van monsterverzameling voor patiënten door minder invasief te zijn dan NP-swabs. Bovendien, aangezien speekselmonsters geen buffers nodig hebben om het monster uit een wattenstaafje te verwijderen (zoals in het geval van NP-monsters), kunnen speekselgebaseerde tests direct gebruik maken van op warmte gebaseerde ribonucleïnezuur (RNA) -extractie, wat de testkosten verlaagt door de noodzaak van extra buffers, transportmedia en / of RNA-extractiereagentia te verwijderen14,17.

Het Clemson University Research and Education in Disease Diagnostics and Intervention (REDDI) Lab is opgericht om tegemoet te komen aan de behoeften van de universiteit aan COVID-19-testen en -surveillance. In gesloten populaties, waaronder universiteiten, leverden frequente surveillancetests in combinatie met sociale afstand de meest gunstige resultaten op in epidemiologische modellen van ziekteprevalentie18. De geconsolideerde CDC 2019-nCOV RT-qPCR19- en SalivaDirect14-protocollen werden aangepast en automatisering werd gebruikt in de klinische workflow om de kosten te verlagen en de doorlooptijd te verbeteren. Eerdere groepen hadden open-source vloeistofbehandelingsrobots gebruikt voor SARS-CoV-2 RNA-extractiestappen20,21, maar we hebben het gebruik van de robots gemaximaliseerd om testplaten voor te bereiden en monsters te laden22. Hier laten we zien dat het aangepaste protocol en het gebruik van open-source vloeistofbehandelingssystemen (figuur 1) snelle en nauwkeurige op speeksel gebaseerde RT-qPCR mogelijk maakt en een effectieve strategie is voor grootschalige bewaking van de volksgezondheid.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Al het onderzoek is uitgevoerd in overeenstemming met Clemson University en Prisma Health Institutional Review Boards (Prisma Health IRB # Pro00099491, 1 juli 2020).

1. Installatie van open-source vloeistofbehandelingsrobot

  1. Installeer hoogrenderende deeltjeslucht (HEPA) filtermodules (zie Tabel met materialen) aan de bovenkant van elke vloeistofbehandelingsrobot volgens de instructies van de fabrikant.
  2. Bevestig een 8-kanaals P20-pipet aan de linkerkant van de master mix plate voorbereidingsrobot(s) volgens de instructies van de fabrikant.
  3. Bevestig een P20-pipet aan de rechterbevestiging van de monsterbeladingsrobot(s) volgens de instructies van de fabrikant.
  4. Download de aangepaste Python-scripts (Supplemental File 1 en Supplemental File 2) op de juiste computers.
  5. Open TigerSaliva Full 384 Loading.py in de desktopapplicatie bij de monsterbeladingsrobotcomputers. Klik op Kalibreren en stel zowel de pipet als het programma in volgens de aanwijzingen van de software.
  6. Open 12 Full Plates.py in de desktopapplicatie op de master mix robotcomputer. Klik op Kalibreren en stel zowel de pipet als het programma in volgens de aanwijzingen van de software.
  7. Print aangepaste voorbeeldrekken met een gesmolten depositiemodellering driedimensionale (3D) printer met behulp van een CAD-bestand (computer-aided design) (https://www.myminifactory.com/object/3d-print-141363). Print 16 racks per monsterbeladingsrobot, voor twee sets van acht racks.

2. Bereiding van 20x multiplex N1+P1 sonde/primer mix

  1. Bereid een batch van 20x multiplex N1+P1 sonde/primer mix (totaal volume van 20 ml, tabel 1) in een conische buis van 50 ml in een steriele omgeving uit de buurt van synthetisch SARS-CoV-2 RNA of patiëntmonsters.
  2. Aliquot 1,6 ml van het mengsel met behulp van een serologische pipet in steriele centrifugebuizen van 2,0 ml en etiketteer op de juiste manier.
  3. Bewaar aliquots in een vriezer van -20 °C tot ze klaar zijn voor gebruik.

3. Bereiding van een positieve controlemix

OPMERKING: Positieve controlemix mag niet in dezelfde steriele omgeving worden gemaakt als sonde/primermengsel of andere mastermixcomponenten. Een aparte container met nucleasevrij water moet worden gebruikt.

  1. Verdun SARS-CoV-2 synthetisch RNA (N1) van 1.000.000 genkopieën/μL (cpμ) tot 10.000 cpμ door 10 μL stockoplossing toe te voegen aan 990 μL nucleasevrij water. Aliquot 25 μL van 10.000 cpμ in steriele 0,2 ml buizen en etiketteer op de juiste manier. Bewaar ongebruikte aliquots bij -80°C.
    OPMERKING: Synthetisch RNA moet worden opgeslagen bij -80 °C om afbraak te voorkomen.
  2. Verdun Hs_RPP30 synthetisch DNA (P1) van 200.000 cpμ tot 10.000 cpμ door 50 μL stamoplossing toe te voegen aan 950 μL nucleasevrij water. Aliquot 25 μL van 10.000 cpμ in steriele 0,2 ml buizen en etiketteer op de juiste manier. Bewaar ongebruikte aliquots bij -80°C.
  3. Verdun elk bestanddeel tot een eindconcentratie van 200 cpμ door 20 μL sars-cov-2 en Hs_RPP30 10.000 cpμ-voorraden toe te voegen aan 960 μl nucleasevrij water, voor een totaal van 1000 μl. Aliquot 20 μl gemengde 200 cpμ positieve controle in 0,2 ml buizen en label op de juiste manier. Bewaar aliquots bij -80°C tot ze klaar zijn voor gebruik.

4. Bereiding van master mixplaten

OPMERKING: Maak mastermix in een steriele omgeving uit de buurt van synthetisch SARS-CoV-2-RNA of patiëntmonsters. Alle componenten moeten volledig worden ontdooid voordat ze aan het mengsel worden toegevoegd; zonder goede ontdooiing kunnen de concentraties onjuist zijn. Onvoldoende ontdooien wordt aangegeven door de aanwezigheid van ijs of ongelijke kleur van reagentia. Bewaren op een diepvriesblok tijdens het bereiden van het mengsel.

  1. Bereid een partij multiplex master mix (totaal volume van 48 ml, tabel 2) in een conische buis van 50 ml.
  2. Homogeniseer het mengsel door de buis 3x om te draaien. Meng niet door op en neer te pipetteren of te vortexen, omdat dit het enzym zal beschadigen.
  3. Vul kolommen 1-4 van een steriel 96-well diep putreservoir door 1,48 ml mastermix in elke put over te brengen. Eén conisch van 50 ml vult vier kolommen, genoeg voor 12 platen.
  4. Bedek het diepe putreservoir met een folieafdichting en plaats het in de speciale master mix vloeistofbehandelingsrobot. Plaats het gevulde diepe putreservoir op dek 10, plaats zes lege 384-putplaten op dekken 1-6 en de P20-tipbox op dek 11. Leg de diepe putplaat en tipboxen bloot en sluit de robot.
  5. Initialiseer het aangepaste Python-besturingsprotocol door te klikken op Uitvoeren starten in de robotdesktoptoepassing.
  6. Na 40 minuten wordt de run gepauzeerd. Bedek de gevulde 384 putplaten met folieafdichtingen terwijl ze in de robot blijven en druk met de rol naar beneden om hechting te garanderen. Label de rand van elke plaat met een batch-id.
  7. Plaats zes nieuwe lege 384-putplaten op dekken 1-6 en hervat het bedieningsprotocol door op Hervatten uitvoeren te klikken. Nadat de run is voltooid, bedek je de laatste set van 384 putplaten met folieafdichtingen.
  8. Pipetteer 2 μL van het resterende mastermengsel in kolommen 1-3 en 22-24 van een lege 384-well plaat voor batchkwaliteitscontrole. Sluit af met een optisch heldere afdichting en voer uit op de thermocycler (sectie 10.1-10.2). Als putten N1-drempelwaarden (Ct) hebben of als meer dan 10 putten P1 Ct-waarden hebben, is de batch verontreinigd en kan deze niet worden gebruikt.
  9. Bewaar de bereide hoofdmengplaten bij 4 °C en gebruik ze binnen 7 dagen na bereiding.

5. Monsterverzameling, inname en warmtebehandeling

  1. Instrueer deelnemers om 30 minuten voorafgaand aan de speekselverzameling te voorkomen dat ze eten, drinken, roken of mondhygiëne uitvoeren. Instrueer deelnemers om ten minste 1 ml speeksel te verzamelen dat zich van nature in de mond verzamelt en het in een steriele conische buis van 50 ml zonder conserveermiddelen deponeert en vervolgens de buis afdekt (aanvullend bestand 3).
  2. Ontsmet de buitenkant van speekselopvangbuizen met 70% ethanol of desinfecterende doekjes en breng ze over naar het laboratorium om te testen.
  3. Registreer de aankomst van het monster door elke voorbeeldwebcode te scannen in de spreadsheet voor dagelijkse inname (aanvullend bestand 4).
  4. Verwarm de gescande monsters gedurende 30 minuten in een oven van 95 °C. Verwijder monsters terwijl u hittebestendige handschoenen draagt.
    OPMERKING: Onbehandelde monsters zijn stabiel bij kamertemperatuur (23 °C) gedurende maximaal 72 uur. Na een warmtebehandeling moeten de monsters bij 4 °C worden opgeslagen, indien zij niet onmiddellijk worden verwerkt.

6. Voorbeeldtoewijzing

  1. Open de spreadsheets voor het dagelijks laden van monsters voor elke robot voor het laden van monsters (aanvullend bestand 5) op de computer op het monstertoewijzingsstation.
  2. Wijs als volgt 188 monsters toe aan elke 384-putplaat: Monsters 1-48 worden beschouwd als kwartaal 1, monsters 49-96 worden beschouwd als kwartaal 2, monsters 97-144 worden beschouwd als kwartaal 3 en monsters 145-188 worden beschouwd als kwartaal 4. Monsters worden in tweevoud geanalyseerd.
  3. Etiketteer trays met plaatnaam, datum en kwartnummer. Scan de monsters in volgorde in de spreadsheet voor het laden van monsters.
    OPMERKING: Monsters van eerdere platen moeten mogelijk handmatig worden uitgevoerd, zoals gedefinieerd in figuur 3. Raadpleeg de rubrieken 8.1-8.3 voor handmatige monstertoewijzing en laadinstructies.

7. Het bedienen van monsterbeladingsrobots

  1. Zet bij het monsterlaadstation twee volledige sets van acht 3D-geprinte rekken op een rij die overeenkomen met de plaatsing van het dek in de robot.
  2. Ontdoe kwart 1 buizen en plaats in 3D geprinte rekken, te beginnen met positie A1 in rek 1. Vul elk rek van links naar rechts en van boven naar beneden. Ga verder met dit laadpatroon in rack 2 en ga vervolgens naar racks 4 en 5 (zie figuur 2C).
    OPMERKING: Racks worden niet achter elkaar genummerd vanwege de parameters van het robotprogramma.
  3. Plaats geladen kwart 1 monsterrekken op dekken 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11. Plaats P20 tips op decks 3 en 9. Om het installatieproces te vereenvoudigen, laadt u materialen van achter naar voren in de robot.
  4. Neem een kant-en-klare mastermixplaat van de 4 °C, label deze met de naam van de plaat en gebruik een scherp mes om een lijn in de folie rond de controleputten (N23/24, O23/24 en P23/24) te snijden.
  5. Plaats de master mengplaat op dek 6 en verwijder de folieafdekking, laat de kleine rechthoek achter die de controleputten bedekt. Maak de tipdozen bloot en sluit de robot.
  6. Initialiseer het aangepaste Python-besturingsprotocol door te klikken op Start Uitvoeren via de robotdesktoptoepassing. Elk kwartaal duurt 24,5 min om op de plaat te laden; stel een timer in als herinnering.
  7. Terwijl de robot draait, ontkurkt en laadt u kwart 2 monsterbuizen in de tweede set 3D-geprinte rekken zoals beschreven in paragraaf 7.2.
  8. Wanneer de robot pauzeert, verwijdert u kwart 1-rekken en vervangt u ze door kwart 2-rekken. Klik op Uitvoeren hervatten in de bureaubladtoepassing.
  9. Vat kwart 1 monsterbuizen samen en bewaar ze in een koelkast van 4 °C in afwachting van de resultaten.
    Herhaal dit laadproces voor kwart 3 en 4.
  10. Breng de geladen plaat over naar een bioveiligheidskast. Om verontreiniging tot een minimum te beperken, houdt u de plaat bedekt tijdens de overdracht.

8. Handmatig laden van monsters

OPMERKING: Voer één handmatige run uit op herhaalde monsters (N1 Rerun of Rerun, zie figuur 3) in geval van onvoldoende robotbelasting.

  1. Verzamel eventuele herhalingsmonsters en wijs ze toe als de laatste monsters in kwartaal 4 (zie rubriek 6.2). Nummer monsters, scan de streepjescodes en voer de oorspronkelijke monsterlocatie en het resultaat in de spreadsheet voor het laden van monsters in.
  2. Breng herhaalde monsters over naar de bioveiligheidskast. Laad geen herhaalde monsterbuizen in de robotlaadrekken.
  3. Pipetteer 2 μL van elk herhalingsmonster naar de juiste putten volgens het plaatlay-outdiagram (aanvullend bestand 6). Gebruik een speciale pipet voor het toevoegen van patiëntmonsters. Houd controleputten bedekt met folie terwijl u monsters toevoegt om verontreiniging te minimaliseren.

9. Toevoeging van controles aan testplaten

  1. Verwijder de folieafdekking over controleputten met een tang.
  2. Pipetteer 2 μL nucleasevrij water (geen sjablooncontrole) naar putten N23-N24 en 2 μL van 200 cpμ gemengde positieve controle (zie sectie 3) naar putten O23-O24. Pipetteer 2 μL van een bevestigde positieve patiëntmonstercontrole in putjes M23-M24 als extra controle. Laat putten P23-P24 leeg om de batchkwaliteit van de mastermix te bewaken.
  3. Bedek de plaat met een optisch heldere afdichting en gebruik de applicatorrol om alle putten afdichting te bevestigen. Vortex de plaat bij 2500 rpm gedurende 30 sec om grondig te mengen. Centrifugeer de plaat gedurende 1 min bij 500 x g .

10. RT-qPCR uitvoeren

  1. Maak een protocolprogramma in de thermocycler-software volgens de beschreven omstandigheden (tabel 3). Bewaar het protocol voor toekomstige platen. Plaats de verzegelde plaat in de thermocycler en voer het protocol uit.
  2. Exporteer Ct-waarden als een .xslx-bestand en kopieer de waarden naar de spreadsheet voor het laden van voorbeelden (aanvullend bestand 5).
    OPMERKING: Deze bladen zijn speciaal ontworpen voor Ct-uitvoerbestanden van software van de fabrikant en moeten mogelijk worden gewijzigd om andere indelingen te accepteren.

11. Bepaling van de geldigheid van de plaat

  1. Valideer zowel de positieve controle en/of bekende positieve monsters als de negatieve controle om de plaatresultaten als geldig te beschouwen. Beoordeel de controleputten aan de hand van de volgende criteria.
    1. Controleer voor positieve controle of ten minste één positieve controleput (O23/O24) Ct-waarden tussen 22-28 produceert voor zowel P1- als N1-sondes. Als alternatief produceren de bekende positieve monsterputten (M23 / M24) P1- en N1 Ct-waarden <33 op de P1- en N1-sondes.
    2. Controleer voor negatieve controle of er geen N1- of P1 Ct-waarden zijn in een van de twee negatieve controleputten (N23/N24). Controleer of ct-waarden geldige versterkingscurven hebben voordat u de plaat ongeldig maakt.

12. Interpretatie van voorbeeldresultaten

  1. Bepaal het patiëntresultaat volgens het diagram (figuur 3) en rapporteer opgeloste monsters.
    1. Beoordeel het P1-resultaat als GELDIG of ONGELDIG. Als P1 een resultaat van Ct <33 oplevert, beschouw dan de put ALS GELDIG en ga verder met het resultaat van N1. Als P1 een resultaat oplevert van Ct >=33 of geen Ct-waarde, beschouw dan de put ONGELDIG.
      1. Beoordeel het N1-resultaat als JA, NEE of NEE*. Als N1 een resultaat van Ct <33 oplevert, is de put JA. Als N1 geen Ct-waarde produceert, is de put NO. Als N1 een Ct produceert >=33, is de put NO*. Controleer of alle N1 Ct-waarden zijn gekoppeld aan een echte versterkingscurve. Als een Ct-waarde voor N1 geen versterkingscurve heeft, is de put NO.
      2. Identificeer herhaalde monsters (N1 Rerun of Rerun), label ze met een intern monsternummer en monstertype en breng ze terug naar de laadworkflow (sectie 8.1-8.3).

13. Laboratorium opruimen

  1. Vloeistofbehandelingsrobots
    1. Reinig alle kanten met een desinfectiemiddel op gemiddeld niveau. Gebruik geen ethanol omdat dit het plastic zal afbreken.
    2. Veeg het uiteinde van de pipetpunt en de afvalbak voorzichtig af met een alcoholdoekje (70% ethanol of 100% isopropanol). Veeg het toetsenbord en de muis schoon.
  2. Bioveiligheidskast
    1. Reinig alle oppervlakken met een desinfectiemiddel op gemiddeld niveau. Doe het UV-licht gedurende 15 minuten aan.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We bepaalden het detectiebereik voor RT-qPCR-sondes en primers voor synthetisch nucleïnezuurgehalte voor zowel SARS-CoV-2 (N1) als Hs_RPP30 (P1). Een 10-voudige seriële verdunning van bekende concentraties van gecombineerd synthetisch SARS-CoV-2 RNA en synthetisch Hs_RPP30 DNA in water werd gedaan. De volgende formule werd gebruikt om het molecuulgewicht om te zetten in genkopienummer

Genkopienummer = (ng * 6,0221 x 1023)/((lengte in basenparen*660 g/mol) *1 x 109 ng/g)

en RT-qPCR werd uitgevoerd. Na het uitvoeren van RT-qPCR vertoonden lineaire curven voor N1-detectie (figuur 4A) en P1-detectie (figuur 4B) goede correlatiecoëfficiënten over een breed scala aan genkopieconcentraties (respectievelijk R2 = 0,9975 en R2 = 0,9884). Dit resultaat geeft aan dat de combinatie van primer- en probesets niet remmend is en SARS-CoV-2-RNA nauwkeurig kan detecteren bij één genkopie/μL (Cq=33). Eén genkopie is ongeveer gelijk aan één virale kopie; we hebben echter geen kwantitatieve virale kopienummers in speeksel bepaald vanwege de semi-kwantitatieve aard van RT-qPCR. We probeerden positieve speekselmonsters te simuleren door synthetisch SARS-CoV-2-RNA van bekende concentraties in virusvrij speeksel (zowel warmtebehandeld als niet-warmtebehandeld) te spieken, maar waren niet in staat om N1-amplificatie te produceren bij lage concentraties RNA (gegevens niet getoond). Dit kan te wijten zijn aan RNase-degradatie of andere verstorende factoren.

De inter- en intra-assayvariabiliteit tussen geautomatiseerde en handmatige monsterbelastingsmethoden werd ook beoordeeld. Om de inter-assayvariabiliteit te evalueren, werden 20 unieke positieve monsters geladen met behulp van de handmatige (beschreven in paragraaf 8.1-8.3) en geautomatiseerde (beschreven in paragraaf 7.1-7.11) methoden. N1 Ct-waarden werden vergeleken om te bepalen of vloeistofbehandelingsrobots en handmatige monsterbelading gelijkwaardige resultaten opleverden (figuur 5A). De lineaire relatie tussen handmatige en geautomatiseerde methoden leverde een hoge correlatiecoëfficiënt op (R2= 0,9088), wat aangeeft dat beide methoden functioneel gelijkwaardig zijn. Naarmate de N1 Ct-waarden toenamen, nam ook de variabiliteit van Ct-waarden toe. Deze trend is waarschijnlijk te wijten aan de heterogene verdeling van virale deeltjes in het speeksel, die meer uitgesproken is wanneer er minder deeltjes aanwezig zijn. Om de intra-assayvariabiliteit te evalueren, werd een vergelijking gemaakt tussen de N1 Ct-waarden van replicatieputten van unieke speekselmonsters met behulp van beide methoden voor monsterbelasting (figuur 5B). De lineaire relatie tussen replicaties van geautomatiseerde monsterbelasting (R2 = 0,9622) produceerde een iets hogere correlatiecoëfficiënt dan die van handmatige belasting (R2 = 0,9589), wat wijst op een hoge reproduceerbaarheid van SARS-CoV-2-detectie voor beide belastingsmethoden.

Ten slotte werd een evaluatie van de verlaging van de speekselviscositeit ten opzichte van de warmtebehandelingsmethoden uitgevoerd (figuur 6). Speeksel werd verkregen uit een enkele bron om monstervariabiliteit te elimineren. Grotere variabiliteit in P1 Ct-waarden binnen één warmtebehandelingsmethode kan wijzen op een hogere viscositeit van het monster, aangezien viskeus speeksel niet nauwkeurig kan worden aangezogen en afgegeven. Zowel 30 min als 60 min warmtebehandelingsmethoden produceerden significant verminderde monstervariabiliteit in vergelijking met geen behandelingscontrole (respectievelijk p = 0,0006 en p = 0,0429). Er was geen significant verschil tussen behandelingen van 30 min en 60 min (p = 0,2245); daarom werd de 30 minuten durende warmtebehandelingsmethode geïmplementeerd om de verwerkingstijd te verkorten.

figure-results-1
Figuur 1: Laboratoriumworkflow met behulp van het op speeksel gebaseerde RT-qPCR-diagnosesysteem. (A) Monsters worden verzameld en warmtebehandeld bij 95 °C gedurende 30 minuten. Behandelde monsters worden gesorteerd en bijgehouden met patiëntinformatie via een intern spreadsheetsysteem. Een vloeistofbehandelingsrobot laadt monsters in dubbele putten van voorbereide mastermixplaten. Een technicus laadt de bedieningselementen handmatig, verzegelt de plaat en plaatst de plaat in een thermocycler voor verwerking. Resultaten worden geanalyseerd via een geautomatiseerd computersysteem en geverifieerd door een technicus. (B) Een technicus bereidt reagentia voor het hoofdmengsel voor die worden toegevoegd aan een diep putreservoir in een steriele bioveiligheidskast. Gevulde diepe putreservoirs worden in een speciale vloeistofbehandelingsrobot geladen. Voltooide platen worden verzegeld met folie, gelabeld en bewaard bij 4 °C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Lay-outs die worden gebruikt voor de vloeistofbehandelingsrobot. (A) Deklay-out voor de robot(s) voor de voorbereiding van de hoofdmixplaat. Met een achtkanaalspipet is de robot geprogrammeerd om pipetpunten op te pakken, mastermix uit een 96-well diep putreservoir te zuigen, mastermix in lege 384-well-platen te doseren en de pipetpunten in een afvalbak te werpen. Dit wordt herhaald voor zes platen per run. (B) Dekopstelling voor monsterbeladingsrobot(s). Met een eenkanaalspipet is de robot geprogrammeerd om een pipetpunt op te pakken, een speekselmonster op te zuigen, een speekselmonster in dubbele putten van een 384-well master mengplaat te doseren en de pipetpunt in een afvalbak te werpen. Dit wordt herhaald voor 48 monsters per run. (C) Bestelling voor het laden van stalen buizen voor 3D-geprinte rekken. Rode pijlen geven de laadvolgorde binnen een rek aan en de witte doosnummers geven de laadvolgorde van de hele set racks aan. De hele opstelling laadt 188 monsters in tweevoud in een plaat met 384 putten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Voorbeeld resulterend stroomdiagram. Monsters met geldigE P1 en positieve N1 werden vastgesteld als menselijke speekselmonsters die positief waren voor SARS-CoV-2. Geldige en positieve/negatieve steekproefresultaten werden als overtuigend beschouwd. Monsters die geen sluitende resultaten opleverden in de eerste run werden gecategoriseerd als Rerun (aangeduid met RR) of N1 Rerun (aangeduid met N1 RR). Rerun-monsters hadden geen geldige P1-versterking en N1 Rerun-monsters hadden positieve N1-amplificatie in een enkele replicaat. Als er geen geldige P1-versterking kon worden geproduceerd door een volgende handmatige run, of als beide replicaties N1 Ct-waarden boven de positieve drempel hadden (Ct >33), werden de monsterresultaten als niet overtuigend beschouwd. Voor klinische doeleinden werden patiëntmonsters die niet in het laboratorium aankwamen, onvoldoende speeksel hadden om te pipetten of beschadigd waren, als ongeldig beschouwd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: RT-qPCR detectie van N1 (SARS-CoV-2) synthetisch RNA en P1 (Hs_RPP 30) synthetisch DNA. Standaardcurven werden uitgezet met standaardafwijkingen om het bereik van nauwkeurige detectie te bepalen met behulp van deze sonde/ primer-combinatie. (A) De gemiddelde Ct-waarden (n =4) verkregen in de respectieve verdunningen werden uitgezet tegen de geschatte hoeveelheid synthetisch RNA (1x100 tot 1x104 RNA-kopieën in 10 μL RT-qPCR-reactie). (B) De gemiddelde Ct-waarden (n =3) verkregen in respectievelijke verdunningen werden uitgezet tegen de geschatte hoeveelheid synthetisch DNA (1 x 100 tot 1 x 104 genkopieën in 10 μL RT-qPCR-reactie). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Vergelijking tussen handmatige en geautomatiseerde speekseloverdracht SARS-CoV-2 (N1) Ct waarden. De bekende SARS-CoV-2 positieve speekselmonsters (n = 20) werden in tweevoud in een RT-qPCR-mastermixplaat geladen door een vloeistofbehandelingsrobot. De monsters hebben een Ct-waarde variërend van 18-32 voor N1. Dezelfde monsters werden vervolgens handmatig in dubbele putten op een andere plaatlocatie geladen. (A) N1 Ct-waarden verkregen uit unieke monsters met behulp van zowel de robot als handmatige monsterbelasting werden getransponeerd om de inter-assayvariabiliteit tussen handmatige en robotbelading te bepalen. (B) De intra-assayvariabiliteit werd ook bepaald met behulp van getransponeerde replicatie van N1 Ct-waarden verkregen uit zowel robot- als handmatige monsterbelasting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Evaluatie van warmtebehandelingsmethoden voor viscositeitsreductie in speeksel. SARS-CoV-2 negatief speeksel werd verzameld uit een enkele bron en aliquots werden warmtebehandeld gedurende 0 min, 30 min of 60 min bij 95 °C. P1 Ct-waarden van technische replicaties (n = 12) van elke aandoening werden uitgezet om de variabiliteit tussen behandelingsmethoden te bepalen. Paarsgewijze vergelijkingen tussen groepen werden geëvalueerd met een ongepaarde t-test (*** geeft p <0,001 aan, * geeft p aan <0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Vergelijking van N1 Ct in speekselmonsters met een lage P1 Ct. De positieve monsters met lage P1 Ct werden geselecteerd en vergeleken met de N1 Ct (n =106). De N1 Ct-waarden varieerden van 14-33, wat aangeeft dat de test een dynamisch bereik in speekselmonsters heeft dat vergelijkbaar is met de standaardcurve. Klik hier om dit bestand te downloaden.

BestanddeelSequentie (5'→3')Voorraad concentratieVolume
2019-nCoV-N1 Sonde/5FAM/ACCCCGCAT/ZEN/TACGTTTGGTGGACC/3IABkFQ50 μM500 μL
2019-nCoV-N1-VoorGACCCCAAAATCAGCGAAAT100 μM2000 μl
2019-nCoV-N1-RevTCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG100 μM2000 μl
Hs RPP30 Cy5 Sonde/5Cy5/TTCTGACCT/ZEN/GAAGGCTCTGCGCG/3IABkFQ50 μM500 μL
Hs-RPP30-VoorAGATTTGGACCTGCGAGCG100 μM2000 μl
Hs-RPP30-RevGAGCGGCTGTCTCCACAAGT100 μM2000 μl
Water--11000 μL

Tabel 1: Componenten van N1+P1 sonde/primer mix.

BestanddeelVoorraad concentratieVolume per reactieEindconcentratieBatch Volume
Luna WarmStart RT Enzym mix20x0,5 μL1x3 ml
Luna Buffer Reactie Mix2x5,0 μL1x30 ml
N1+P1 Primer/Probe MixnCoV N1 F: 10 μM0,5 μL500 nM3 ml
nCoV N1 R: 10 μM500 nM
Sonde nCoV N1: 2,5 μM125 nM
RPP_30 P1 F: 10 μM500 nM
RPP_30 P1 R: 10 μM500 nM
Sonde RPP_30 P1: 2,5 μM125 nM
Nuclease Vrij Water---2 μl---12 ml
Subtotaal---8 μL---48 ml
Sjabloon2 μl

Tabel 2: Componenten van multiplex SARS-CoV-2 mastermix.

PodiumTemperatuur (°C)DuurAantal cycli
Omgekeerde transcriptie5510 min.1
Initiële denaturatie951 min.1
Touchdown9510 sec3
7230 seconden
9510 sec3
6930 seconden
9510 sec3
6630 seconden
Hoofdversterking9510 sec40
6530 seconden

Tabel 3: Touchdown RT-qPCR protocol. Thermocyclische omstandigheden voor eenstaps RT-qPCR SARS-CoV-2 diagnostische test.

Touchdown stapGeen touchdown-stap
Gemiddelde N1 CtGemiddelde P1 CtGemiddelde N1 CtGemiddelde P1 Ct
Voorbeeld 119.6522.727.828.3
Voorbeeld 222.2424.928.7730.5
Voorbeeld 318.8519.224.6525.9
Voorbeeld 425.5622.831.9329.2
Voorbeeld 522.3424.838.4840.0 (Detectie mislukt)

Tabel 4: Vergelijking van touchdown Ct-waarden voor vijf positieve monsters met geen touchdown Ct-waarden.

MonsterTijgersalivaIn de handel verkrijgbare SARS-CoV-2-test op basis van speeksel
N1 CtP1 CtCovid-19 WaardeRNaseP-waarde
D1116.418.120.8623.4
E1118.919.125.621.2
F1119.518.422.822.2
G1122.219.123.722.9
H1126.421.332.226.7
A1214.816.529.1519
B122419.631.0521.35
C1214.917.520.8418.9

Tabel 5: Vergelijking van TigerSaliva Ct-resultaten en commercieel beschikbare op speeksel gebaseerde SARS-CoV-2-testresultaten. Beide testen werden uitgevoerd op dezelfde speekselmonsters (n =8).

Aanvullend bestand 1: Aangepast script voor het maken van robotmastermixplaten. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: Aangepast script voor speekselverwerking op monsterbeladingsrobots. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 3: Instructies voor het zelf verzamelen van hoogwaardige speekselmonsters van deelnemers. Verdere details zijn te vinden in de korte videobeschrijving van het testproces die beschikbaar is op https://www.clemson.edu/centers-institutes/reddilab/index.html. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 4: Voorbeeld intake spreadsheet. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 5: Voorbeeld van het laden van spreadsheets. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 6: Voorbeeld van een 384-putplaatlay-outdiagram. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De in het protocol beschreven test werd beoordeeld door een onafhankelijke validatiestudie. Het bleek dat de test 98,9% specificiteit (1,1% vals positief) en 90,0% sensitiviteit (10,0% vals negatief) had wanneer geëvalueerd tegen gepaarde nasofaryngeale swabs die tegelijkertijd werden genomen (n = 837; 817 negatieven, 20 positief). Belangrijk is dat drie deelnemers die positief testten met TigerSaliva en negatief met een nasofaryngeale swab 48 h later opnieuw werden getest met swabs en positieve resultaten terugkregen, wat aangeeft dat TigerSaliva mogelijk SARS-CoV-2-infecties eerder in de loop van de ziekte kan detecteren.

We simuleerden positieve speekselmonsters door virusvrij speeksel (zowel warmtebehandeld als niet-warmtebehandeld) te spieken met bekende concentraties SARS-CoV-2 synthetisch RNA en voerden een 10-voudige verdunning uit om de Ct-limiet in speeksel te bepalen. Het N1-gen was niet detecteerbaar onder de 10.000 genkopieën (ongeveer Ct = 28) in gesimuleerde positieve monsters. We vermoeden dat dit te wijten is aan RNase-degradatie of andere verstorende factoren. De interactie van speeksel-RNasen met naakt synthetisch RNA verschilt echter waarschijnlijk van de interactie met virale deeltjes, zelfs nadat ze door hitte zijn gedenatureerd. Positieve speekselmonsters zijn geïdentificeerd met Ct >30 en externe laboratoria hebben SARS-CoV-2 genetische sequentiegegevens van deze monsters verkregen. We speculeren dat de virale eiwitten bescherming bieden tegen RNA-afbraak in speekselmonsters van patiënten.

De meest kritieke stap in het protocol is de implementatie van automatisering voor de bereiding van hoofdmengsels en de verwerking van speekselmonsters (respectievelijk secties 4 en 7). Dit zorgt voor overlappende taakprocessen, wat de doorlooptijd drastisch verkort. Een andere cruciale stap is de interpretatie van klinische resultaten (rubrieken 11 en 12). Het vaststellen van tussenliggende resultaatcategorieën (Rerun en N1 Rerun) minimaliseerde ook het optreden van niet-overtuigende testresultaten.

We toonden aan dat de variatie tussen handmatige en geautomatiseerde methoden voor het laden van speekselmonsters verwaarloosbaar is (figuur 5A) en dat automatisering de reproduceerbaarheid van SARS-CoV-2-detectie kan verbeteren (figuur 5B). Automatisering moet de voorkeur krijgen om testen te vergemakkelijken bij het ontwerpen en uitbreiden van klinische laboratoria25. De laboratoriumworkflow wordt verbeterd door de implementatie van robot-geautomatiseerde taken26. Open-source mogelijkheden van de vloeistofbehandelingsrobots maken de implementatie van aangepaste scripts voor protocolontwerp mogelijk. Dit maakt vloeistofbehandelingsrobots een goedkoop en zeer aanpasbaar systeem in vergelijking met traditionele klinische automatiseringsmethoden. Het is ook een ideale strategie voor het uitvoeren van zeer repetitieve laboratoriumtaken. De hoge mate van aanpasbaarheid van het systeem vertaalt zich in de vrijheid om labware (bijv. Verzamelbuizen, pipetpunten of 384-well platen) te wijzigen in geval van tekorten. Daarom is automatisering met behulp van vloeistofbehandelingsrobots haalbaar voor zowel grootschalige als kleinschalige bewaking en onderzoek.

Een groot voordeel van deze teststrategie is een veel kortere doorlooptijd ten opzichte van andere klinische laboratoria. Het gebruik van geautomatiseerde vloeistofbehandelingsrobots speelt een sleutelrol bij het verkorten van de doorlooptijd, maar gelijktijdig gebruik van robots en thermocyclers is ook van groot belang bij het maximaliseren van de testefficiëntie. Eén robot en thermocycler moeten als een paar worden gebruikt, waarbij beide machines tegelijkertijd worden gebruikt voor ononderbroken monsterbelasting en monsterresultaatanalyse. Zodra een gestage stroom van toegewezen monsters is vastgesteld, kunnen alle machineparen tegelijkertijd worden bediend. Constant gelijktijdig gebruik van robots en thermocyclers verhoogt de testcapaciteit en efficiëntie drastisch, wat cruciaal is om het hoge testvolume op te vangen.

In tegenstelling tot andere gevestigde SARS-CoV-2 RT-qPCR-protocollen, hebben we een touchdown-stap opgenomen in het thermocycler-protocol om het gloeien van de sonde en primersets naar de doelgenen27 te verbeteren, waardoor het risico op mislukte amplificatie wordt verminderd. De resultaten toonden aan dat de touchdown de detectie van positieve monsters verbeterde zonder het verlies van specifieke primerbinding te riskeren (tabel 4). We hebben vastgesteld dat een breed scala aan zowel SARS-CoV-2 RNA-kopieën (figuur 4A) als Hs_RPP30 DNA-kopieën (figuur 4B) tegelijkertijd kan worden gedetecteerd door de RT-qPCR-test.

Een beperking van vloeistofbehandelingsrobots is de mogelijkheid van kruisbesmetting door positieve monsters tijdens speekseloverdracht. Speeksel is een visco-elastische vloeistof28 en kan over aangrenzende putten rijgen nadat het uit de pipetpunt is afgegeven. Bovendien kan de heterogeniteit van speeksel29 leiden tot een ongelijke verdeling van virale deeltjes over het monster. Dit verhoogt de kans op zowel valse positieven als negatieven, waardoor de aanduiding van N1 Rerun- en Rerun-monsters noodzakelijk is. 14,1% van de monsters die aanvankelijk waren aangewezen als N1 Rerun, verdween echter als positief voor SARS-CoV-2 en had meer dan 30 keer meer kans dan Rerun-monsters om na hertest als positief te verdwijnen. Bijgevolg zorgde het onderscheiden van Rerun van N1 Rerun (figuur 3) voor een nauwkeurigere scheiding van potentieel positieve monsters, waardoor de gevoeligheid en specificiteit van onze diagnostische test werden verhoogd. Andere resulterende parameters voor diagnostisch speekselonderzoek maakten dit onderscheid niet12,14,24,30,31.

Speekselmonsters kunnen moeilijk te pipetteren zijn vanwege heterogeniteit en viscositeit32. Warmtebehandeling denatureert eiwitten in de speekselbiomatrix adequaat, waardoor de viscositeit wordt verminderd en de behoefte aan RNA-extractiereagentia9, die schaars waren tijdens de vroege stadia van de pandemie10, wordt geëlimineerd. Uitgebreide warmtebehandeling inactiveert ook aanwezige virussen33, wat laboratoriumverwerking bij lagere bioveiligheidsniveaus mogelijk maakt. Bijgevolg werd een op warmte gebaseerde RNA-extractie (beschreven in paragraaf 5.4) geïmplementeerd om de viscositeit te verlagen door eiwitdenaturatie (figuur 6). Op basis van de resultaten stellen we dat warmtebehandeling naast het denatureren van de eiwitbiomatrix ook speekselmonsters kan homogeniseren. Andere groepen combineerden warmtebehandeling en proteïnase K-behandeling om de homogeniteit te vergroten9,14,34. We hebben ervoor gekozen om deze stap niet te implementeren, omdat het virion-eiwitten kan denatureren met een snelheid die viraal RNA blootstelt aan warmtedegradatie35. Bovendien kan monsterverdunning met proteïnase K positieve monsters maskeren die minder virale deeltjes bevatten, waardoor de gevoeligheid afneemt. Bovendien werden de testresultaten vergeleken met een in de handel verkrijgbare speekselgebaseerde SARS-CoV-2-test (Logix Smart COVID-19) die magnetische kralen-RNA-extractie gebruikt (tabel 5). Het bleek dat de huidige test beter geschikt was voor het detecteren van zwakke positieve monsters in vergelijking met de in de handel verkrijgbare test.

Het is moeilijk om het aantal viruskopieën in speeksel te kwantificeren met alleen RT-qPCR, omdat qPCR semi-kwantitatief is. Er is inherente variatie tussen Ct-waarden die voortkomt uit technische beperkingen. Het aantal genkopieën kan worden bepaald aan de hand van Ct-waarden (figuur 4) en is ongeveer gelijk aan het aantal virale kopieën. Een mogelijke oplossing om het virale kopienummer in speekselmonsters te bepalen is ddPCR, dat zorgt voor een harde kwantificering van genkopieën in de reactie. Wij zijn echter van mening dat het voldoende is om kwalitatieve resultaten te leveren aan clinici en dat de relatieve virale inhoud kan worden vergeleken tussen monsters die met onze methoden worden verwerkt.

Ondanks enkele beperkingen die zich voordoen bij het gebruik van speeksel, blijkt de SARS-CoV-2-test door op speeksel gebaseerde RT-qPCR een effectieve methode te zijn voor snelle en betrouwbare virale RNA-detectie op elke testschaal. Dit geldt vooral in combinatie met het gebruik van open-source vloeistofbehandelingssystemen. Deze testbenadering kan worden aangepast om andere nucleïnezuursequenties te detecteren die relevant zijn voor diagnostiek, zoals ziekteverwekkers, ziektemarkers of andere virussen. Dit maakt de test toepasbaar voor zowel klinische als onderzoeksdiagnostische inspanningen.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen. De test die in het protocol wordt beschreven, valt onder de SalivaDirect EUA die is ingediend door Yale School of Public Health.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken Clemson's administratie, medisch personeel en klinische laboratoriummedewerkers in het REDDI Lab die hebben geholpen bij het implementeren en beheren van SARS-CoV-2-tests. We bedanken Dr. Phillip Buckhaults en Dr. Carolyn Bannister van de Universiteit van South Carolina voor het eerste projectadvies en de contacten met de industrie voor de aanschaf van apparatuur. We bedanken veel studenten, professoren en medewerkers voor hun hulp bij het verzamelen van monsters. Bedankt aan Creative Inquiry-studenten voor het verzamelen van standaardcurvegegevens. Financiering voor deze studie werd ontvangen van de National Institutes of Health-subsidie P20GM121342 (toegekend aan DD en LGP), Clemson Athletic Department, Clemson University's Vice President for Research en de South Carolina Governor & Joint Bond Review Committee.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100% EtOHFisher scientific22-032-601
20 uL Filtered Pipette TipsOpentrons20uL tips
2mL Microcentrifuge TubesFisher Scientific14-666-313Alternate product may be used
Armadillo PCR Plate, 384-well, clear, white wellsThermo ScientificAB3384Alternate product may be used
Celltreat 2mL 96 Deep Well PlatesFisher Scientific50-828-743For mastermix preparation
Clear PCR Sealing SheetsThermo ScientificAB0558Alternate product may be used
DPEC Treated WaterAmbion (Thermo Scientific)AM9916
Flip Cap 50 mL Conical TubesVWR75845-210For sample collection
Foil PCR Sealing SheetsThermo ScientificAB0626For storage of mastermix plates, Alternate product may be used
HS_RPP30 Synthetic DNAIntegrated DNA Technologies299788131P1 positive control
Luna Buffer Probe One-Step ReactionNew England BiolabsM3006B
Luna WarmStart RT Enzyme MixNew England BiolabsM3002B
nCOV_N1 Forward Primer, 100 nmolIntegrated DNA Technologies10006830
nCOV_N1 Probe Aliquot, 50 nmolIntegrated DNA Technologies10006832Probe can be synthesized by other vendors with SYBR or FAM fluophores
nCOV_N1 Reverse Primer, 100 nmolIntegrated DNA Technologies10006831
Opentron HEPA Filter ModuleOpentronsN/ANot required, but useful to reduce contamination
Opentron Multichannel Attachment, P20Opentrons999-00005For mastermix preparation
Opentron OT-2 Liquid Handling RobotOpentronsOT-2
Opentron Pipette Attachment, P20Opentrons999-0000215For sample loading
OvenMemmertUF450 PLUS 208V-3PH
PCR Tubes (rnase, dnase free)Fisher Scientific14-230-225For aliquots of positive and neg controls
PolarSafe Aluminum Cooling Block, 15-Well (1.5/2.0 mL Tubes)VWR10808-952
PolarSaf Aluminum Cooling Block, 24-Well (0.5mL tubes)VWR10808-956
RNAse P (ATTO 647) Probe, 50 nmolIntegrated DNA Technologies10007062Probe can be synthesized by other vendors with Cy5 fluorophore
RNAse P Forward Primer, 100nmolIntegrated DNA Technologies10006836
RNAse P Reverse Primer, 100 nmolIntegrated DNA Technologies10006837
Sars-CoV-2 Synthetic RNA Control 2Twist Biosciences102024 / 103907 / 103909N1 Positive Control
ScannersCodeCR1500Only required when scaling up
Small HEPA Filtered HoodErlabCaptair Bio 321For mastermix preparation
Thermocycler CFX384 TouchBioradCFX384 TouchAlternate models can be used, e.g. CFX384 Opus
X-acto Knife SetStaplesN/ATo cut foil for keeping control wells covered

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. A novel coronavirus from patients with pneumonia in China, 2019. New England Journal Medicine. 382 (8), 727-733 (2020).">Zhu, N., et al. A novel coronavirus from patients with pneumonia in China, 2019. New England Journal Medicine. 382 (8), 727-733 (2020).
  2. Pathogenicity and transmissibility of 2019-nCoV-A quick overview and comparison with other emerging viruses. Microbes and Infection. 22 (2), 69-71 (2020).">Chen, J. Pathogenicity and transmissibility of 2019-nCoV-A quick overview and comparison with other emerging viruses. Microbes and Infection. 22 (2), 69-71 (2020).
  3. Comparing SARS-CoV-2 with SARS-CoV and influenza pandemics. The Lancet. Infectious Diseases. 20 (9), 238-244 (2020).">Petersen, E., et al. Comparing SARS-CoV-2 with SARS-CoV and influenza pandemics. The Lancet. Infectious Diseases. 20 (9), 238-244 (2020).
  4. Summary of Guidance for Public Health Strategies to Address High Levels of Community Transmission of SARS-CoV-2 and Related Deaths, December 2020. MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (49), 1860-1867 (2020).">Honein, M. A., et al. Summary of Guidance for Public Health Strategies to Address High Levels of Community Transmission of SARS-CoV-2 and Related Deaths, December 2020. MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (49), 1860-1867 (2020).
  5. https://apps.who.int/iris/handle/10665/332051 (2020).">World Health Organization. Surveillance strategies for COVID-19 human infection: interim guidance. World Health Organization. , Available from: https://apps.who.int/iris/handle/10665/332051 (2020).
  6. https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/tsting-overview.html#PublicHealthSurveillance (2020).">Screening testing for early detection of SARS-CoV-2 infection. Division of viral diseases. Centers for Disease Control. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/tsting-overview.html#PublicHealthSurveillance (2020).
  7. Test sensitivity is secondary to frequency and turnaround time for COVID-19 screening. Science Advances. 7 (1), 5393(2021).">Larremore, D. B., et al. Test sensitivity is secondary to frequency and turnaround time for COVID-19 screening. Science Advances. 7 (1), 5393(2021).
  8. Interpreting Diagnostic Tests for SARS-CoV-2. JAMA. 323 (22), 2249-2251 (2020).">Sethuraman, N., Jeremiah, S. S., Ryo, A. Interpreting Diagnostic Tests for SARS-CoV-2. JAMA. 323 (22), 2249-2251 (2020).
  9. Evaluation of simple nucleic acid extraction methods for the detection of SARS-CoV-2 in nasopharyngeal and saliva specimens during global shortage of extraction kits. Journal of clinical virology: the official publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 129, 104519(2020).">Chu, A. W., et al. Evaluation of simple nucleic acid extraction methods for the detection of SARS-CoV-2 in nasopharyngeal and saliva specimens during global shortage of extraction kits. Journal of clinical virology: the official publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 129, 104519(2020).
  10. Global supply-chain effects of COVID-19 control measures. Nature Human Behaviour. 4 (6), 577-587 (2020).">Guan, D., et al. Global supply-chain effects of COVID-19 control measures. Nature Human Behaviour. 4 (6), 577-587 (2020).
  11. The Sensitivity and Costs of Testing for SARS-CoV-2 Infection With Saliva Versus Nasopharyngeal Swabs: A Systematic Review and Meta-analysis. Annals of Internal Medicine. 174 (4), 501-510 (2021).">Bastos, M. L., Perlman-Arrow, S., Menzies, D., Campbell, J. R. The Sensitivity and Costs of Testing for SARS-CoV-2 Infection With Saliva Versus Nasopharyngeal Swabs: A Systematic Review and Meta-analysis. Annals of Internal Medicine. 174 (4), 501-510 (2021).
  12. Saliva sample as a non-invasive specimen for the diagnosis of coronavirus disease 2019: a cross-sectional study. Clinical Microbiology and Infection: The Official Publication of The European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 27 (2), (2021).">Pasomsub, E., et al. Saliva sample as a non-invasive specimen for the diagnosis of coronavirus disease 2019: a cross-sectional study. Clinical Microbiology and Infection: The Official Publication of The European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 27 (2), (2021).
  13. Consistent Detection of 2019 Novel Coronavirus in Saliva. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of The Infectious Diseases Society of America. 71 (15), 841-843 (2020).">To, K. K., et al. Consistent Detection of 2019 Novel Coronavirus in Saliva. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of The Infectious Diseases Society of America. 71 (15), 841-843 (2020).
  14. Med (New York, N.Y.). 2 (3), 263-280 (2021).">Vogels, C. B., et al. SalivaDirect: A simplified and flexible platform to enhance SARS-CoV-2 testing capacity. Med (New York, N.Y.). 2 (3), 263-280 (2021).
  15. Evaluation of Specimen Types and Saliva Stabilization Solutions for SARS-CoV-2 Testing. Journal of Clinical Microbiology. 59 (5), 1418-1420 (2021).">Griesemer, S. B., et al. Evaluation of Specimen Types and Saliva Stabilization Solutions for SARS-CoV-2 Testing. Journal of Clinical Microbiology. 59 (5), 1418-1420 (2021).
  16. Self-collection: An appropriate alternative during the SARS-CoV-2 pandemic. Journal of Clinical Virology: The Official Publication of The Pan American Society for Clinical Virology. 128, 104417(2020).">Wehrhahn, M. C., et al. Self-collection: An appropriate alternative during the SARS-CoV-2 pandemic. Journal of Clinical Virology: The Official Publication of The Pan American Society for Clinical Virology. 128, 104417(2020).
  17. Use of a simplified sample processing step without RNA extraction for direct SARS-CoV-2 RT-PCR detection. Journal of Clinical Virology: The Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 132, 104587(2020).">Barza, R., Patel, P., Sabatini, L., Singh, K. Use of a simplified sample processing step without RNA extraction for direct SARS-CoV-2 RT-PCR detection. Journal of Clinical Virology: The Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 132, 104587(2020).
  18. Assessment of SARS-CoV-2 Screening Strategies to Permit the Safe Reopening of College Campuses in the United States. JAMA Network Open. 3 (7), 2016818(2020).">Paltiel, A. D., Zheng, A., Walensky, R. P. Assessment of SARS-CoV-2 Screening Strategies to Permit the Safe Reopening of College Campuses in the United States. JAMA Network Open. 3 (7), 2016818(2020).
  19. https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-panel-primer-probes.html (2020).">Centers for Disease Control. 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time RT-PCR Primers and Probes. U.S. Department of Health and Human Services. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-panel-primer-probes.html (2020).
  20. Can Robots Improve Testing Capacity for SARS-CoV-2. Journal of Medical Internet Research. 22 (8), 20169(2020).">Cresswell, K., Ramalingam, S., Sheikh, A. Can Robots Improve Testing Capacity for SARS-CoV-2. Journal of Medical Internet Research. 22 (8), 20169(2020).
  21. Implementation of an open-source robotic platform for SARS-CoV-2 testing by real-time RT-PCR. PLoS One. 16 (7), 0252509(2021).">Villanueva-Cañas, J. L., et al. Implementation of an open-source robotic platform for SARS-CoV-2 testing by real-time RT-PCR. PLoS One. 16 (7), 0252509(2021).
  22. https://sc.edu/study/colleges_schools/pharmacy/about/news/2020/robot-boosts-testing-effort.php (2020).">Robot Boosts COVID-19 Testing Efficiency. University of South Carolina College of Pharmacy. , Available from: https://sc.edu/study/colleges_schools/pharmacy/about/news/2020/robot-boosts-testing-effort.php (2020).
  23. Practical challenges to the clinical implementation of saliva for SARS-CoV-2 detection. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases: Official Publication of The European Society of Clinical Microbiology. 40 (2), 447-450 (2021).">Matic, N., et al. Practical challenges to the clinical implementation of saliva for SARS-CoV-2 detection. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases: Official Publication of The European Society of Clinical Microbiology. 40 (2), 447-450 (2021).
  24. SalivaSTAT: Direct-PCR and Pooling of Saliva Samples Collected in Healthcare and Community Setting for SARS-CoV-2 Mass Surveillance. Diagnostics. 11 (5), Basel, Switzerland. 904(2021).">Sahajpal, N. S., et al. SalivaSTAT: Direct-PCR and Pooling of Saliva Samples Collected in Healthcare and Community Setting for SARS-CoV-2 Mass Surveillance. Diagnostics. 11 (5), Basel, Switzerland. 904(2021).
  25. Challenges and Opportunities in Implementing Total Laboratory Automation. Clinical Chemistry. 64 (2), 259-264 (2018).">Genzen, J. R., et al. Challenges and Opportunities in Implementing Total Laboratory Automation. Clinical Chemistry. 64 (2), 259-264 (2018).
  26. Clinical Laboratory Automation: A Case Study. Journal of Public Health Research. 6 (1), 881(2017).">Archetti, C., Montanelli, A., Finazzi, D., Caimi, L., Garrafa, E. Clinical Laboratory Automation: A Case Study. Journal of Public Health Research. 6 (1), 881(2017).
  27. High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR. BioTechniques. 20 (3), 478-485 (1996).">Hecker, K. H., Roux, K. H. High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR. BioTechniques. 20 (3), 478-485 (1996).
  28. Formation of beads-on-a-string structures during break-up of viscoelastic filaments. Nature Physics. 6, 625-631 (2010).">Bhat, P. P., et al. Formation of beads-on-a-string structures during break-up of viscoelastic filaments. Nature Physics. 6, 625-631 (2010).
  29. Current developments in salivary diagnostics. Biomarkers in Medicine. 4 (1), 171-189 (2010).">Miller, C. S., et al. Current developments in salivary diagnostics. Biomarkers in Medicine. 4 (1), 171-189 (2010).
  30. Saliva Sampling and Its Direct Lysis, an Excellent Option To Increase the Number of SARS-CoV-2 Diagnostic Tests in Settings with Supply Shortages. Journal of Clinical Microbiology. 58 (10), 01659(2020).">Moreno-Contreras, J., et al. Saliva Sampling and Its Direct Lysis, an Excellent Option To Increase the Number of SARS-CoV-2 Diagnostic Tests in Settings with Supply Shortages. Journal of Clinical Microbiology. 58 (10), 01659(2020).
  31. Detection of SARS-CoV-2 in Different Types of Clinical Specimens. JAMA. 323 (18), 1843-1844 (2020).">Wang, W., et al. Detection of SARS-CoV-2 in Different Types of Clinical Specimens. JAMA. 323 (18), 1843-1844 (2020).
  32. Challenges in use of saliva for detection of SARS CoV-2 RNA in symptomatic outpatients. Journal of Clinical Virology: The Official Publication of The Pan American Society for Clinical Virology. 130, 104567(2020).">Landry, M. L., Criscuolo, J., Peaper, D. R. Challenges in use of saliva for detection of SARS CoV-2 RNA in symptomatic outpatients. Journal of Clinical Virology: The Official Publication of The Pan American Society for Clinical Virology. 130, 104567(2020).
  33. Resilient SARS-CoV-2 diagnostics workflows including viral heat inactivation. PLoS One. 16 (9), 0256813(2021).">Lista, M. J., et al. Resilient SARS-CoV-2 diagnostics workflows including viral heat inactivation. PLoS One. 16 (9), 0256813(2021).
  34. Validation and implementation of a direct RT-qPCR method for rapid screening of SARS-CoV-2 infection by using non-invasive saliva samples. International Journal of Infectious Diseases: IJID: Official Publication of The International Society for Infectious Diseases. 110, 363-370 (2021).">Brotons, P., et al. Validation and implementation of a direct RT-qPCR method for rapid screening of SARS-CoV-2 infection by using non-invasive saliva samples. International Journal of Infectious Diseases: IJID: Official Publication of The International Society for Infectious Diseases. 110, 363-370 (2021).
  35. Heat inactivation of the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2. Journal of Biosafety and Biosecurity. 3 (1), 1-3 (2021).">Batéjat, C., Grassin, Q., Manuguerra, J. C., Leclercr, I. Heat inactivation of the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2. Journal of Biosafety and Biosecurity. 3 (1), 1-3 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

SARS CoV 2 RT qPCRSaliva DiagnosticsOpen Source Pipetting RobotsLiquid Handling AutomationHeat Treatment SalivaMultiplex RT qPCRCommunity Surveillance TestingThermocycler WorkflowViral RNA DetectionSample Barcode Tracking

Related Articles