Methodenartikel

Low-input Nucleus Isolation and Multiplexing with Barcoded Antibodies of Mouse Sympathetic Ganglia for Single-nucleus RNA Sequencing

DOI:

10.3791/63397

⸱

23 maart 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy & Embryology, Leiden University Medical Center, 2Department of Cardiology, Leiden University Medical Center, 3Department of Medical Statistics and Bioinformatics, Leiden University Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de gedetailleerde, low-input monstervoorbereiding voor single-nucleus sequencing, inclusief de dissectie van muis superieure cervicale en stellate ganglia, celdissociatie, cryopreservatie, nucleus isolatie en hashtag barcoding.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het cardiale autonome zenuwstelsel is cruciaal bij het beheersen van de hartfunctie, zoals hartslag en cardiale contractiliteit, en is verdeeld in sympathische en parasympathische takken. Normaal gesproken is er een balans tussen deze twee takken om de homeostase te behouden. Hartaandoeningen zoals myocardinfarct, hartfalen en hypertensie kunnen echter de remodellering van cellen veroorzaken die betrokken zijn bij cardiale innervatie, wat gepaard gaat met een ongunstige klinische uitkomst.

Hoewel er enorme hoeveelheden gegevens zijn voor de histologische structuur en functie van het cardiale autonome zenuwstelsel, is de moleculair biologische architectuur in gezondheid en ziekte in veel opzichten nog steeds raadselachtig. Nieuwe technologieën zoals single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) zijn veelbelovend voor de genetische karakterisering van weefsels met eencellige resolutie. De relatief grote omvang van neuronen kan echter het gestandaardiseerde gebruik van deze technieken belemmeren. Hier maakt dit protocol gebruik van droplet-gebaseerde single-nucleus RNA-sequencing (snRNA-seq), een methode om de biologische architectuur van cardiale sympathische neuronen in gezondheid en ziekte te karakteriseren. Een stapsgewijze aanpak is aangetoond om snRNA-seq uit te voeren van de bilaterale superieure cervicale (SCG) en stellate ganglia (StG) ontleed van volwassen muizen.

Deze methode maakt langdurige monsterbewaring mogelijk, met behoud van een adequate RNA-kwaliteit wanneer monsters van meerdere individuen / experimenten niet allemaal tegelijk binnen een korte periode kunnen worden verzameld. Het coderen van de kernen met hashtag oligo's (HTO's) maakt demultiplexing en het traceren van verschillende ganglionische monsters na sequencing mogelijk. Latere analyses onthulden succesvolle kernopname van neuronale, satellietgliale en endotheelcellen van de sympathische ganglia, zoals gevalideerd door snRNA-seq. Samenvattend biedt dit protocol een stapsgewijze benadering voor snRNA-seq van sympathische extrinsieke cardiale ganglia, een methode die het potentieel heeft voor bredere toepassing in studies naar de innervatie van andere organen en weefsels.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het autonome zenuwstelsel (ANS) is een cruciaal onderdeel van het perifere zenuwstelsel dat de homeostase van het lichaam handhaaft, inclusief de aanpassing aan omgevingsomstandigheden en pathologie1. Het is betrokken bij de regulatie van meerdere orgaansystemen in het hele lichaam, zoals het cardiovasculaire, respiratoire, spijsverterings- en endocriene systeem. De ANS is verdeeld in sympathieke en parasympathische takken. Spinale takken van het sympathische zenuwstelsel synaps in ganglia van de sympathische keten, bilateraal gelegen in een paravertebrale positie. De bilaterale cervicale en thoracale ganglia, met name de StG, zijn belangrijke componenten die deelnemen aan cardiale sympathische innervatie. In ziektetoestanden, zoals cardiale ischemie, kan neuronale remodellering optreden, wat resulteert in een sympathische overdrive2. De neuronale remodellering is aangetoond in meerdere histologische studies bij mensen en verschillende andere diersoorten 3,4,5,6. Een gedetailleerde biologische karakterisering van cardiale ischemie-geïnduceerde neuronale remodellering in cardiale sympathische ganglia ontbreekt momenteel, en de fundamentele biologische kenmerken van gespecialiseerde neuronale celtypen of subtypen binnen het cardiale sympathische zenuwstelsel (SNS) zijn nog niet volledig bepaald in gezondheid en ziekte7.

Nieuwe technologieën, zoals scRNA-seq, hebben poorten geopend voor de genetische karakterisering van kleine weefsels op een eencellig niveau 8,9. De relatief grote omvang van neuronen kan echter het geoptimaliseerde gebruik van deze eencellige technieken bij mensen belemmeren10. Bovendien vereist single-cell sequencing een hoge doorvoer van cellen om een voldoende celnummer te herstellen als gevolg van een hoog verlies in het sequencingproces. Dit kan een uitdaging zijn bij het bestuderen van kleine weefsels die moeilijk in één sessie te vangen zijn en meerdere monsters vereisen om voldoende afzonderlijke cellen te introduceren voor sequencing. De recent ontwikkelde druppelgebaseerde snRNA-seq-technologie (d.w.z. het 10x Chromium-platform) maakt de studie van biologische verschillen tussen enkele kernen11,12 mogelijk. snRNA-seq heeft een voordeel ten opzichte van scRNA-seq voor grote cellen (>30 μm), die mogelijk niet worden gevangen in Gel Bead in Emulsions (GEMs), evenals verbeterde compatibiliteit met uitgebreide dissociatie en / of langdurige conservering 13,14,15.

Heterogeniteit, het aantal neuronale cellen en andere cellen verrijkt in de cardiale SNS zijn belangrijke aspecten voor de karakterisering van de ANS in gezondheids- en ziektetoestanden. Daarnaast draagt de orgaan- of regiospecifieke innervatie door elk sympathisch ganglion bij aan de complexiteit van het SNS. Bovendien is aangetoond dat cervicale, stellaire en thoracale ganglia van de sympathische keten verschillende regio's van het hart innerveren16. Daarom is het noodzakelijk om single-nucleus analyse van ganglionaire cellen afgeleid van individuele ganglia uit te voeren om hun biologische architectuur te bestuderen.

Druppelgebaseerde snRNA-seq maakt transcriptoombrede expressieprofilering mogelijk voor een pool van duizenden cellen uit meerdere monsters tegelijk met lagere kosten dan op platen gebaseerde sequencingplatforms. Deze aanpak maakt het mogelijk om op druppels gebaseerde snRNA-seq meer geschikt te maken voor cellulaire fenotypeclassificatie en nieuwe subpopulatie-identificatie van cellen binnen de SCG en de StG. Met name biedt dit protocol een beknopte stapsgewijze benadering voor de identificatie, isolatie en single-nucleus RNA-sequencing van sympathische extrinsieke cardiale ganglia, een methode die het potentieel heeft voor een brede toepassing in studies van de karakterisering van ganglia die andere gerelateerde organen en weefsels innerveren in gezondheid en ziekte.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft alle stappen die nodig zijn voor de snRNA-seq van murine cervicale en/of cervicothoracale (stellaat) ganglia. Vrouwelijke en mannelijke C57BL/6J muizen (15 weken oud, n = 2 voor elk geslacht) werden gebruikt. Een extra Wnt1-Cre;mT/mG muis werd gebruikt om de ganglia te visualiseren voor dissectie doeleinden 17,18. Deze extra muis werd gegenereerd door de kruising van een B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J muis en een B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J muis. Alle dierproeven zijn uitgevoerd volgens de Guide for Care and Use of Laboratory Animals gepubliceerd door NIH en goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van de Universiteit Leiden (Licentienummer AVD1160020185325, Leiden, Nederland). Zie de Tabel met materialen voor meer informatie over alle materialen, apparatuur, software en dieren die in het protocol worden gebruikt.

1. Voorbereidingen

OPMERKING: Alle stappen worden uitgevoerd in een celkweekstroomkast.

  1. Reinig de tang en schaar door de instrumenten gedurende 20 minuten onder te dompelen in 70% ethanol.
  2. Bereid het ganglionmedium bestaande uit Neurobasaal Medium aangevuld met B-27 plus (1x), L-glutamine (2 mM) en 1% Antibioticum-Antimycotisch. Verwarm het ganglionmedium voor op kamertemperatuur.
  3. Bereid de digestieoplossing voor: 0,25% Trypsine-EDTA (1:1) en 1.400 E/ml collagenase type 2 opgelost in het ganglionmedium.
  4. Bereid verse, koude (4 °C) celwasbuffer (0,4% runderserumalbumine [BSA]) en lysisbuffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 en 0,1% niet-ionisch reinigingsmiddel, 40 E/ml RNAse in nucleasevrij water) voor op de kernisolatie.
  5. Bereid nucleus wash buffer (1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing [PBS] met 2,0% BSA en 0,2U/μL RNase Inhibitor).
  6. Bereid ST-kleuringsbuffer (ST-SB) voor (10 mM Tris-HCl, 146 mM NaCl, 21 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 2% BSA, 0,02% Tween-20 in nucleasevrij water).

2. Dissectie van volwassen muis superieure cervicale ganglia (SCG)

  1. Euthanaseer de muizen en houd ze op ijs.
    OPMERKING: In de huidige studie werden in totaal 4 C57BL6 / J-muizen geëuthanaseerd door CO 2-verstikking. Als alternatief kan isofluraan worden gebruikt, gevolgd door exsanguinatie wanneer een grote hoeveelheid bloed moet worden verzameld voor andere onderzoeksdoeleinden.
  2. Bevestig de muis op een dissectiebord met pinnen en gebruik het met 70% ethanol om de verspreiding van de vacht te minimaliseren (scheren is niet nodig).
  3. Open onder een stereomicroscoop de huid van het nekgebied door een middellijnsnede te maken met een schaar, beweeg de submandibulaire klieren opzij en verwijder de sternomastoïde spier om de gemeenschappelijke halsslagader en de bifurcatie ervan bloot te leggen en te lokaliseren (figuur 1A, B, zie pijl).
  4. Ontleed de rechter en linker halsslagader bifurcatie en het weefsel dat eraan vastzit. Breng elk ontleed stukje weefsel over in een apart petrischaaltje van 3,5 cm met koude PBS.
  5. Zoek naar de SCG die aan de halsslagaderbiafurcatie is bevestigd. Reinig de SCG verder door de slagader en ander aangehecht weefsel in de petrischaal te verwijderen (figuur 1E).

3. Dissectie van volwassen muis stellaat ganglia (StG)

  1. Om de StG te ontleden, maak je een middellijnsnede in de buik, gevolgd door het openen van het diafragma en de ventrale thoracale wand.
  2. Verwijder het hart en de longen om de dorsale thorax bloot te leggen. Zoek naar de linker en rechter StG anterolaterale naar de musculus colli longus (MCL) ter hoogte van de eerste rib (Figuur 1C, D, aangegeven door stippellijnen).
  3. Ontleed zowel linker- als rechter StG met een tang en breng ze afzonderlijk over in petrischalen van 3,5 cm met koude PBS (figuur 1F).
    ​

4. Isolatie en cryopreservatie van ganglionaire cellen van muizen

Stap 4-6 zijn samengevat in figuur 2.

  1. Breng alle afzonderlijke SCG en StG voorzichtig over in afzonderlijke microcentrifugebuizen van 1,5 ml met een tang.
    OPMERKING: Gebruik geen pipetpunten om de ganglia over te brengen, omdat de ganglia gevoelig zijn om zich aan de wand van plastic pipetpunten te hechten.
  2. Voeg 500 μL 0,25% trypsine-EDTA-oplossing toe aan elke microcentrifugebuis en incubeer in een schudwaterbad bij 37 °C gedurende 40 minuten.
    OPMERKING: Deze stap is bedoeld om de spijsvertering en celafgifte hierna in de collagenase type 2-oplossing te vergemakkelijken.
  3. Bereid voor elk monster een buis van 15 ml met 5 ml ganglionmedium. Laat de ganglia zich op de bodem van de microcentrifugebuizen nestelen. Verzamel het supernatant, dat zeer weinig ganglionaire cellen bevat, breng het supernatant over naar de voorbereide buizen van 15 ml en label elke buis. Als alternatief, om wat tijd te besparen, aspirateer het trypsine-EDTA supernatant zonder verzameling, omdat er zeer weinig gedissocieerde cellen in kunnen worden gedetecteerd.
    OPMERKING: Een kleine hoeveelheid trypsine-EDTA-oplossing (~ 10-30 μL) kan in de microcentrifugebuis worden achtergelaten om verwijdering van de ganglia te voorkomen. Vermijd pipetteren bij deze stap omdat het de ganglia kan beschadigen en daarna kan leiden tot een lage output van ganglionaire cellen.
  4. Voeg 500 μL collagenase type 2-oplossing toe aan elke microcentrifugebuis en incubeer in een schudwaterbad bij 37 °C gedurende 35-40 minuten. Probeer het ganglion na 35 minuten opnieuw op te suspenderen; als het ganglion nog intact is en niet dissociëert, verlengt u de incubatietijd of verhoogt u de concentratie collagenase type 2-oplossing indien nodig.
    OPMERKING: De incubatietijd kan variëren afhankelijk van de grootte van het ganglion.
  5. Resuspend de ganglia in collagenase-oplossing door ~10 keer op en neer te pipetteren of totdat weefselklonten niet langer worden gedetecteerd.
  6. Breng de celsuspensie over naar de eerder gebruikte buis van 15 ml die het gangliacultuurmedium en de trypsine-EDTA-suspensie uit hetzelfde ganglion bevat. Draai de celsuspensie met een zwenkbakrotorcentrifuge gedurende 10 minuten, 300 × g bij kamertemperatuur. Gooi het celsupernatant voorzichtig weg.
    OPMERKING: Omdat de ganglionaire cellen zijn gedissocieerd van een enkel ganglion, kan de celkorrel te klein zijn om met het oog te detecteren; een kleine hoeveelheid supernatant kan in de buis worden achtergelaten om te voorkomen dat de celkorrel per ongeluk wordt verwijderd.
  7. Resuspend de ganglionaire cellen in 270 μL foetaal runderserum (FBS, laag endotoxine) en breng elke cel-FBS-suspensie over in een cryoviaal van 1 ml.
  8. Om de cellen te tellen, meng 5 μL van de ganglionaire celsuspensie met 5 μL van 0,4% trypan blauwe kleurstof en laad het mengsel in een hemocytometer. Tel het totale aantal en levende cellen onder een microscoop.
    OPMERKING: De levensvatbaarheid van de cel (levend celgetal/totaal aantal cellen = levensvatbaarheid %) is meestal meer dan 90% met dit dissociatieprotocol. Het aantal levende cellen van een enkel ganglion (SCG of StG) valt meestal binnen het bereik van 9.000-60.000 cellen wanneer het ganglion wordt geïsoleerd uit een muis van 12 tot 16 weken.
  9. Voeg 30 μL dimethylsulfoxide (DMSO) toe aan elke cel-FBS-suspensie in de cryovialen, meng goed en breng de cryovialen over in een celbevriezingscontainer, die op kamertemperatuur wordt bewaard. Bewaar de cryoviaal geladen container 's nachts bij -80 °C en breng de cryovialen de volgende dag over in vloeibare stikstof voor langdurige conservering voordat deze wordt gesequenceerd.

5. Nucleus isolatie

OPMERKING: Links en rechts SCG geïsoleerd uit vier muizen (in totaal 8 monsters) werden gebruikt als voorbeeld in de volgende nucleus isolatie en sequencing voorbereiding. Houd alles op ijs tijdens de hele procedure. Vanwege de onzichtbaarheid van kleine kernpellets wordt een centrifuge met zwaaiende emmers ten zeerste aanbevolen om de verwijdering van supernatanten gedurende de hele procedure te vergemakkelijken.

  1. Bereid 15 ml buizen met een zeef (30 μm) erop en prerins de zeef met 1 ml van het ganglionmedium.
  2. Haal de cryovialen uit vloeibare stikstof en ontdooi ze onmiddellijk in een waterbad bij 37 °C. Wanneer er een kleine pellet ijs in het cryoviaal achterblijft, haal je de cryovialen uit het waterbad.
  3. Herstel de ganglionaire cellen door 1 ml van het ganglionmedium in elk cryoviaal te laten vallen terwijl je voorzichtig met de hand schudt. Optioneel: Om het celherstel te evalueren, mengt u de celsuspensie na herstel en neemt u 5 μL celsuspensie uit voor het tellen van levende cellen, zoals beschreven in stap 4.8.
  4. Laad elke ganglionaire celsuspensie op een aparte zeef (bereid in stap 5.1) en spoel elke zeef af met 4-5 ml ganglionmedium.
  5. Centrifugeer de gespannen celsuspensie gedurende 5 minuten bij 300 × g, verwijder het supernatant voorzichtig en resuspend de cellen in 50 μL celwasbuffer.
  6. Breng de celsuspensie over naar een laagbindende DNA/RNA 0,5 ml microcentrifugebuis.
  7. Centrifugeer de celsuspensie bij 500 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  8. Verwijder 45 μL van het supernatant zonder de bodem van de buis aan te raken om te voorkomen dat de celkorrel losraakt.
  9. Voeg 45 μL gekoelde Lysis Buffer toe en pipetteer voorzichtig op en neer met een pipetpunt van 200 μL.
  10. Incubeer de cellen gedurende 8 minuten op ijs.
  11. Voeg 50 μL koude nucleus wasbuffer toe aan elke buis. Niet mengen.
  12. Centrifugeer de kernsuspensie bij 600 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  13. Verwijder 95 μL van het supernatant zonder de kernkorrel te verstoren.
  14. Voeg 45 μL gekoelde nucleus wasbuffer toe aan de pellet. Optioneel: Neem 5 μL kernsuspensie, meng met 5 μL van 0,4% trypan blauw om te tellen en controleer de kwaliteit van kernen onder een microscoop met een hemocytometer.
  15. Centrifugeer de kernsuspensie bij 600 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  16. Verwijder het supernatant zonder de bodem van de buis aan te raken om te voorkomen dat de kernkorrel losraakt.

6. Nucleus barcoding met hashtag oligo's (HTO's) en multiplexing

OPMERKING: HTO-kleuringsstappen werden aangepast en geoptimaliseerd voor nucleaire etikettering van zeer lage hoeveelheden (ganglionische) kernen volgens de vorige toepassing in corticale weefsel door Gaublomme et al.15.

  1. Voeg 50 μL ST-SB-buffer toe aan de kernkorrel, pipetteer voorzichtig 8-10 keer totdat de kernen volledig zijn geresuspendeerd.
  2. Voeg 5 μL Fc Blocking-reagens toe per 50 μL van het ST-SB/kernmengsel en incubeer gedurende 10 minuten op ijs.
  3. Voeg 1 μL (0,5 μg) single-nucleus hashtag antilichaam toe per buis van het ST-SB/kernenmengsel en incubeer gedurende 30 minuten op ijs.
    OPMERKING: Kortere incubatietijd leidt tot een lagere efficiëntie van hashtag-etikettering, zoals aangetoond in de representatieve resultaten.
  4. Voeg 100 μL ST-SB toe aan elke buis. Niet mengen.
  5. Centrifugeer de kernsuspensie gedurende 5 min, 600 × g bij 4 °C.
  6. Verwijder 145 μL van het supernatant zonder de kernkorrel te verstoren.
  7. Herhaal stap 6.4 en 6.5. Verwijder het supernatant zoveel mogelijk zonder de bodem van de buis aan te raken om te voorkomen dat de kernkorrel losraakt.
  8. Resuspend de kernkorrel in 50 μL ST-SB en meng de kernen voorzichtig.
  9. Neem 5 μL van de nucleus suspensie en meng deze met 5 μL van 0,4% trypan blauw om de kernen onder een microscoop te tellen. Zie figuur 3A voor een representatief beeld van kernen gemengd met trypanblauw en geladen in een hemocytometer.
  10. Centrifugeer de kernsuspensie gedurende 5 minuten bij 600 × g bij 4 °C.
  11. Resuspend de kernen in ST-SB om een doelkernconcentratie van 1.000-3.000 kernen/μL voor elk monster te bereiken volgens het overeenkomstige aantal kernen.
  12. Bundel de monsters om het gewenste aantal cellen te bereiken.
    OPMERKING: In dit experiment werden bijvoorbeeld 8 monsters gelijkelijk samengevoegd om een totaal van 25.000 kernen te bereiken om daarna onmiddellijk over te gaan tot 10x Genomics Chromium en snRNA-seq. Het aantal kernen valt meestal binnen het bereik van 6.000-40.000 cellen wanneer het ganglion wordt geïsoleerd uit een muis van 12 tot 16 weken. Slechts ongeveer de helft van de totale geladen kernen kan worden opgevangen door op druppels gebaseerde snRNA-seq. Zo werd een mengsel van 25.000 kernen bereid om 10.000 kernen af te vangen, wat nodig is voor verdere bibliotheekvoorbereiding en sequencing.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kwaliteitscontroleanalyse van de single-nucleus cDNA bibliotheekvoorbereiding en snRNA-seq
Representatieve resultaten beschrijven sequencingresultaten van 10.000 gevangen kernen in een enkele pool met een 25.000 reads / nucleus genexpressiebibliotheek en een 5.000 reads / nucleus hashtag bibliotheek. Figuur 3B illustreert de kwaliteitscontroleresultaten van de1e streng cDNA, genexpressie (GEX) bibliotheek en HTO bibliotheek, die werden gecontroleerd met Bioanal...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wordt een gedetailleerd protocol beschreven dat zich richt op i) de dissectie van superieure cervicale en stellaat sympathische ganglia bij volwassen muizen, ii) de isolatie en cryopreservatie van de ganglionaire cellen, iii) kernisolatie en iv) nucleus-barcoding met HTO-labeling voor multiplexingdoeleinden en snRNA-seq.

Met dit protocol kunnen sympathische ganglionaire cellen gemakkelijk worden verkregen door individuele ganglia te dissociëren met behulp van veelgebruikte trypsine en col...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Susan L. Kloet (Afdeling Humane Genetica, LUMC, Leiden) voor haar hulp bij experimenteel ontwerp en nuttige discussies. Wij danken Emile J. de Meijer (Afdeling Humane Genetica, LUMC, Leiden) voor de hulp bij single-nucleus RNA isolatie en bibliotheekvoorbereiding voor sequencing. Dit werk wordt ondersteund door de Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO) [016.196.346 naar M.R.M.J.].

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Chemicals and reagents
0.25% Trypsin-EDTAThermo Fisher Scientific25200056
0.4% trypan blue dyeBio-Rad1450021
Antibiotic-AntimycoticGibco15240096
B-27GibcoA3582801
Collagenase type 2WorthingtonLS004176use 1,400 U/mL
Dimethyl sulfoxideSigma Aldrich67685
Ethanol absolute ≥99.5%VWRVWRC83813.360
Fetal bovine serum (low endotoxin)BiowestS1810-500
L-glutamineThermo Fisher Scientific25030024
Neurobasal MediumGibco21103049
Bovine Serum Albumin 10%Sigma-AldrichA1595-50MLCell wash buffer
DPBS (Ca2+, Mg2+free)Gibco14190-169Cell wash buffer
Magnesium Chloride Solution, 1 MSigma-AldrichM1028Nucleus Lysis buffer
Nonidet P40 Substitute (nonionic detergent)Sigma-Aldrich74385Nucleus Lysis buffer
Nuclease free water (not DEPC-treated)InvitrogenAM9937Nucleus Lysis buffer
Protector RNase Inhibitor, 40 U/µLSigma-Aldrich3335399001Nucleus Lysis buffer
Sodium Chloride Solution, 5 MSigma-Aldrich59222CNucleus Lysis buffer
Trizma Hydrochloride Solution, 1 M, pH 7.4Sigma-AldrichT2194Nucleus Lysis buffer
Bovine Serum Albumin 10%Sigma-AldrichA1595-50MLNucleus wash
DPBS (Ca2+, Mg2+free)Gibco14190-169Nucleus wash
Protector RNase Inhibitor,40 U/µLSigma-Aldrich3335399001Nucleus wash
Bovine Serum Albumin 10%Sigma-AldrichA1595-50MLST staining buffer (ST-SB)
Calcium chloride solution, 1 MSigma-Aldrich21115-100MLST staining buffer (ST-SB)
Magnesium Chloride Solution, 1 MSigma-AldrichM1028ST staining buffer (ST-SB)
Nuclease free water (not DEPC treated)InvitrogenAM9937ST staining buffer (ST-SB)
Sodium Chloride Solution, 5MSigma-Aldrich59222CST staining buffer (ST-SB)
Trizma Hydrochloride Solution, 1M, pH 7.4Sigma-AldrichT2194ST staining buffer (ST-SB)
Tween-20Merck Millipore822184ST staining buffer (ST-SB)
TotalSeq-A0451 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 1 AntibodyBiolegend682205Hashtag antibody
TotalSeq-A0452 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 2 AntibodyBiolegend682207Hashtag antibody
TotalSeq-A0453 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 3 AntibodyBiolegend682209Hashtag antibody
TotalSeq-A0461 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 11 AntibodyBiolegend682225Hashtag antibody
TotalSeq-A0462 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 12 AntibodyBiolegend682227Hashtag antibody
TotalSeq-A0463 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 13 AntibodyBiolegend682229Hashtag antibody
TotalSeq-A0464 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 14 AntibodyBiolegend682231Hashtag antibody
TotalSeq-A0465 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 15 AntibodyBiolegend682233Hashtag antibody
TruStain FcX (human)Biolegend422302FC receptor blocking solution
Equipment and consumables
Bright-Line HemacytometerMerckZ359629-1EA
Centrifuge 5702/R A-4-38Eppendorf EP022629905
CoolCell LX Cell Freezing ContainerCorningCLS432003-1EA
CryovialThermo Scientific479-6840
DNA LoBind 0.5 mL Eppendorf tubeEppendorfEP0030108035-250EA
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mLEppendorf30121872
Falcon 35 mm Not TC-treated Petri dishCorning351008
Falcon 15 mL Conical Centrifuge TubesFisher scientific10773501
Forceps Dumont #5Fine science tools11252-40
Hardened Fine ScissorsFine science tools14091-09
 Ice Pan, rectangular 4 L OrangeCorningCLS432106-1EA
Leica MS5LeicaMicroscope
Moria MC50 ScissorsFine science tools15370-50
Noyes Spring ScissorsFine science tools15012-12
Olympus CK2 ULWCDOlympusMicroscope
P10GilsonF144802
P1000GilsonF123602
P200GilsonF123601
Preseparation Filters (30 µm)Miltenyi biotecMiltenyi biotec130-041-407
Shaking water bathGFL1083
Silicon plateRubberBV3530Dissection board
Software and packages

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McCorry, L. K. Physiology of the autonomic nervous system. American Journal of Pharmaceutical Education. 71 (4), 78(2007).
  2. Li, C. -Y., Li, Y. -G. Cardiac sympathetic nerve sprouting and susceptibility to ventricular arrhythmias after myocardial infarction. Cardiology Research and Practice. 2015, 698368(2015).
  3. Ajijola, O. A., et al. Extracardiac neural remodeling in humans with cardiomyopathy. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 5 (5), 1010(2012).
  4. Nguyen, B. L., et al. Acute myocardial infarction induces bilateral stellate ganglia neural remodeling in rabbits. Cardiovascular Pathology. 21 (3), 143-148 (2012).
  5. Ajijola, O. A., et al. Remodeling of stellate ganglion neurons after spatially targeted myocardial infarction: Neuropeptide and morphologic changes. Heart Rhythm. 12 (5), 1027-1035 (2015).
  6. Han, S., et al. Electroanatomic remodeling of the left stellate ganglion after myocardial infarction. Journals of the American College of Cardiology. 59 (10), 954-961 (2012).
  7. Zeisel, A., et al. Molecular architecture of the mouse nervous system. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
  8. Svensson, V., Vento-Tormo, R., Teichmann, S. A. Exponential scaling of single-cell RNA-seq in the past decade. Nature Protocols. 13 (4), 599-604 (2018).
  9. Li, C. L., et al. Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity. Cell Research. 26 (8), 967(2016).
  10. Kokubun, S., et al. Distribution of TRPV1 and TRPV2 in the human stellate ganglion and spinal cord. Neuroscience Letters. 590, 6-11 (2015).
  11. Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communication. 10 (1), 2832(2019).
  12. Petrany, M. J., et al. Single-nucleus RNA-seq identifies transcriptional heterogeneity in multinucleated skeletal myofibers. Nature Communication. 11 (1), 6374(2020).
  13. Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. Journal of the American Society of Nephrology. 30 (1), 23-32 (2019).
  14. Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), 0209648(2018).
  15. Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10 (1), 2907(2019).
  16. Zandstra, T. E., et al. Asymmetry and heterogeneity: part and parcel in cardiac autonomic innervation and function. Frontiers in Physiology. 12, 665298(2021).
  17. Lewis, A. E., Vasudevan, H. N., O'Neill, A. K., Soriano, P., Bush, J. O. The widely used Wnt1-Cre transgene causes developmental phenotypes by ectopic activation of Wnt signaling. Developmental Biology. 379 (2), 229-234 (2013).
  18. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  19. Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single cell data. bioRxiv. , (2018).
  20. Avraham, O., et al. Satellite glial cells promote regenerative growth in sensory neurons. Nature Communications. 11 (1), 4891(2020).
  21. Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224(2018).
  22. Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7 (1), 11022(2016).
  23. Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7 (1), 6031(2017).
  24. Grindberg, R. V., et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (49), 19802-19807 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Cardiac Autonomic Nervous SystemHashtag OligosMultiplexed SequencingGanglia DissectionNeuronal Cell ClustersSample Preservation

Gerelateerde artikelen