Method Article

Experimentele en data-analyse workflow voor soft matter nano-indentatie

DOI:

10.3791/63401

⸱

January 18th, 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for the Cellular Microenvironment, James Watt School of Engineering, University of Glasgow, 2Optics 11 life, 3Laboratory of Biosensors and Bioelectronics, ETH Zürich

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol presenteert een complete workflow voor nano-indentatie-experimenten met zacht materiaal, inclusief hydrogels en cellen. Ten eerste zijn de experimentele stappen om krachtspectroscopiegegevens te verkrijgen gedetailleerd; vervolgens wordt de analyse van dergelijke gegevens gedetailleerd beschreven via een nieuw ontwikkelde open-source Python-software, die gratis te downloaden is van GitHub.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanoindentatie verwijst naar een klasse van experimentele technieken waarbij een micrometrische krachtsonde wordt gebruikt om de lokale mechanische eigenschappen van zachte biomaterialen en cellen te kwantificeren. Deze aanpak heeft een centrale rol gekregen op het gebied van mechanobiologie, biomaterialenontwerp en weefselmanipulatie, om een goede mechanische karakterisering van zachte materialen te verkrijgen met een resolutie die vergelijkbaar is met de grootte van enkele cellen (μm). De meest populaire strategie om dergelijke experimentele gegevens te verkrijgen, is het gebruik van een atoomkrachtmicroscoop (AFM); hoewel dit instrument een ongekende resolutie biedt in kracht (tot pN) en ruimte (sub-nm), wordt de bruikbaarheid ervan vaak beperkt door de complexiteit die routinematige metingen van integrale indicatoren van mechanische eigenschappen, zoals Young's Modulus (E), voorkomt. Een nieuwe generatie nano-indenters, zoals die op basis van optische vezeldetectietechnologie, is onlangs populair geworden vanwege het gemak van integratie, terwijl het mogelijk is om sub-nN-krachten toe te passen met een ruimtelijke resolutie van μm, waardoor het geschikt is om lokale mechanische eigenschappen van hydrogels en cellen te onderzoeken.

In dit protocol wordt een stapsgewijze handleiding gepresenteerd met de experimentele procedure voor het verkrijgen van nano-indentatiegegevens op hydrogels en cellen met behulp van een in de handel verkrijgbare ferrule-top optische vezeldetectie nano-indenter. Hoewel sommige stappen specifiek zijn voor het instrument dat hierin wordt gebruikt, kan het voorgestelde protocol worden gebruikt als een gids voor andere nano-indentatie-apparaten, mits sommige stappen zijn aangepast aan de richtlijnen van de fabrikant. Verder wordt een nieuwe open-source Python-software gepresenteerd die is uitgerust met een gebruiksvriendelijke grafische gebruikersinterface voor de analyse van nano-indentatiegegevens, die het mogelijk maakt om onjuist verkregen curven, gegevensfiltering, berekening van het contactpunt via verschillende numerieke procedures, de conventionele berekening van E, evenals een meer geavanceerde analyse die bijzonder geschikt is voor eencellige nano-indentatiegegevens.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De fundamentele rol van de mechanica in de biologie is tegenwoordig vastgesteld 1,2. Van hele weefsels tot afzonderlijke cellen, mechanische eigenschappen kunnen informeren over de pathofysiologische toestand van het onderzochte biomateriaal 3,4. Borstweefsel aangetast door kanker is bijvoorbeeld stijver dan gezond weefsel, een concept dat de basis is van de populaire palpatietest5. Met name is onlangs aangetoond dat de coronavirusziekte 2019 (COVID-19) veroorzaakt door ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) wordt onderstreept door veranderingen in de mechanische eigenschappen van bloedcellen, waaronder verminderde vervormbaarheid van erytrocyten en verminderde lymfocyten- en neutrofiele stijfheid in vergelijking met bloedcellen van SARS-CoV-2-naïeve personen6.

Over het algemeen is de mechanica van cellen en weefsels inherent met elkaar verweven: elk weefsel heeft specifieke mechanische eigenschappen die tegelijkertijd die van de samenstellende cellen en de extracellulaire matrix (ECM)5 beïnvloeden en ervan afhankelijk zijn. Daarom omvatten strategieën om mechanica in de biologie te bestuderen vaak technische substraten met fysiologisch relevante mechanische stimuli om celgedrag op te helderen als reactie op die stimuli. Het baanbrekende werk van Engler en collega's toonde bijvoorbeeld aan dat mesenchymale stamcellijntoeage-binding wordt gecontroleerd door matrixelasticiteit, zoals bestudeerd op zachte en stijve tweedimensionale polyacrylamide (PAAm) hydrogels7.

Er bestaan veel strategieën om het onderzochte biomateriaal mechanisch te karakteriseren, variërend in ruimtelijke schaal (d.w.z. lokaal tot bulk) en in de wijze van vervorming (bijv. Axiale versus afschuiving), wat bijgevolg verschillende informatie oplevert, die zorgvuldige interpretatie vereist 3,8,9,10. De mechanica van zachte biomaterialen wordt vaak uitgedrukt in termen van stijfheid. Stijfheid hangt echter af van zowel materiaaleigenschappen als geometrie, terwijl elastische moduli fundamentele eigenschappen van een materiaal zijn en onafhankelijk zijn van de geometrie van het materiaal11. Als zodanig zijn verschillende elastische moduli gerelateerd aan de stijfheid van een bepaald monster, en elke elastische modulus omvat de weerstand van het materiaal tegen een specifieke vervormingswijze (bijv. axiale versus afschuiving) onder verschillende randvoorwaarden (bijv. Vrije expansie versus opsluiting)11,12. Nano-indentatie-experimenten maken de kwantificering van mechanische eigenschappen via de E mogelijk, die geassocieerd is met uniaxiale vervorming (inkeping) wanneer het biomateriaal niet zijdelings is opgesloten 10,11,12.

De meest populaire methode om E van biologische systemen op microschaal te kwantificeren is AFM 13,14,15,16. AFM is een extreem krachtig instrument met krachtresolutie tot op pN-niveau en ruimtelijke resolutie tot op de sub-nm-schaal. Verder biedt AFM extreme flexibiliteit in termen van koppeling met complementaire optische en mechanische gereedschappen, waardoor haar mogelijkheden worden uitgebreid om een schat aan informatie uit het onderzochte biomateriaal te halen13. Die aantrekkelijke kenmerken komen echter met een toetredingsdrempel die wordt vertegenwoordigd door de complexiteit van de experimentele opzet. AFM vereist uitgebreide training voordat gebruikers robuuste gegevens kunnen verkrijgen, en het gebruik ervan voor dagelijkse mechanische karakterisering van biologische materialen is vaak onterecht, vooral wanneer de unieke kracht en ruimtelijke resoluties niet vereist zijn.

Hierdoor heeft een nieuwe klasse nano-indenters onlangs aan populariteit gewonnen vanwege hun gebruiksgemak, terwijl ze nog steeds AFM-vergelijkbare gegevens bieden met sub-nN krachtresolutie en μm ruimtelijke resolutie, reflecterende krachten uitgeoefend en waargenomen door cellen over relevante lengteschalen2. Met name ferrule-top nano-indentatie-apparaten op basis van optische vezeldetectietechnologie 17,18 hebben aan populariteit gewonnen bij onderzoekers die actief zijn op het gebied van mechanobiologie en daarbuiten; en een schat aan werken die de mechanische eigenschappen van biomaterialen rapporteren met behulp van deze apparaten, waaronder cellen19,20, hydrogels 8,21 en weefsels22,23 zijn gepubliceerd. Ondanks de mogelijkheden van deze systemen om lokale dynamische mechanische eigenschappen (d.w.z. opslag- en verliesmodulus) te onderzoeken, blijven quasi-statische experimenten die E opleveren de meest populaire keuze 8,19,20,21. Kortom, quasi-statische nano-indentatie-experimenten bestaan uit het inspringen van het monster met een constante snelheid tot een instelpunt dat wordt gedefinieerd door een maximale verplaatsing, kracht of inkepingsdiepte, en het registreren van zowel de kracht als de verticale positie van de cantilever in zogenaamde force-distance (F-z) curven. F-z-curven worden vervolgens omgezet in force-indentation (F-δ) curven door de identificatie van het contactpunt (CP), en uitgerust met een geschikt contactmechanicamodel (meestal het Hertz-model13) om E te berekenen.

Hoewel de werking van ferrule-top nano-indenters lijkt op AFM-metingen, zijn er specifieke kenmerken die het overwegen waard zijn. In dit werk wordt een stapsgewijze handleiding gegeven om F-z-curven van cellen en weefselnabootsende hydrogels robuust te verkrijgen met behulp van een in de handel verkrijgbare ferrule-top nano-indenter, om standaardisatie van experimentele procedures tussen onderzoeksgroepen die deze en andere vergelijkbare apparaten gebruiken aan te moedigen. Daarnaast wordt advies gegeven over hoe hydrogelmonsters en cellen het beste kunnen worden voorbereid om nano-indentatie-experimenten uit te voeren, samen met tips voor het oplossen van problemen langs de experimentele route.

Bovendien hangt veel van de variabiliteit in nano-indentatieresultaten (d.w.z. E en de distributie ervan) af van de specifieke procedure die wordt gebruikt om gegevens te analyseren, die niet-triviaal is. Om dit probleem op te lossen, worden instructies gegeven voor het gebruik van een nieuw ontwikkelde open-sourcesoftware geprogrammeerd in Python en uitgerust met een gebruiksvriendelijke grafische gebruikersinterface (GUI) voor batchanalyse van F-z-curven . De software maakt snelle gegevensscreening, filtering van gegevens, berekening van de CP door middel van verschillende numerieke procedures, de conventionele berekening van E, evenals een meer geavanceerde analyse genaamd de elasticiteitsspectra24, waardoor de bulk van de cel Young's modulus, actine cortex's Young's modulus en actine cortex's dikte kunnen worden geschat. De software kan vrij worden gedownload van GitHub en kan eenvoudig worden aangepast om gegevens afkomstig van andere systemen te analyseren door een geschikte gegevensparser toe te voegen. Er wordt benadrukt dat dit protocol kan worden gebruikt voor andere ferrule-top nano-indentatie-apparaten en andere nano-indentatie-apparaten in het algemeen, mits sommige stappen zijn aangepast aan de richtlijnen van het specifieke instrument. Het protocol is schematisch samengevat in figuur 1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Voorbereiding van substraten/cellen voor nano-inductiemetingen

  1. Volg de stappen in het Aanvullend Protocol voor de bereiding van PAAm hydrogels/cellen voor nano-inductie-experimenten. De procedure is samengevat in figuur 2.
    OPMERKING: PAAm hydrogels zijn gekozen omdat ze de meest voorkomende hydrogels zijn die worden gebruikt op het gebied van mechanobiologie. Het protocol is echter evenzeer van toepassing op elk type hydrogel25 (zie Discussie, wijzigingen van de methode).

2. Het apparaat opstarten, de testkeuze en de kalibratie van de sonde

  1. Volg de stappen in het Aanvullend Protocol voor het opstarten van het apparaat. Voor technische details over de werking van optische vezelferrule-top nano-indenters, bekijk deze referenties 17,18.
  2. Selecteer de nano-indentatiesonde zoals hieronder beschreven.
    OPMERKING: Alle in de handel verkrijgbare sondes, zoals die in dit protocol worden gebruikt, zijn uitgerust met een bolvormige punt (figuur 3A). Daarom beperkt de keuze zich tot twee variabelen: de stijfheid van de cantilever en de tipradius (figuur 3B).
    1. Kies de stijfheid van een cantilever (k in N/m) die overeenkomt met de verwachte monsterstijfheid voor de beste resultaten15 (zie Figuur 3C en Discussie, kritieke stappen in het protocol). Selecteer voor cellen een sonde met k in het bereik 0,01-0,09 N/m. Selecteer voor hydrogels een sonde met k in het bereik van 0,1-0,9 N/m, wat optimale resultaten oplevert voor gels met een verwachte E tussen enkele kPa en 100 kPa (zie Representatieve resultaten).
    2. Kies de tipradius (R in μm) op basis van de gewenste ruimtelijke resolutie van het inspringingsproces. Voor kleine cellen zoals Human Embryonic Kidney 293T (HEK293T) cellen (gemiddelde diameter van ~10-15 μm26) selecteer je een bol met R = 3 μm. Selecteer voor hydrogels een bol met R = 10-250 μm om de mechanische eigenschappen van het biomateriaal over een groot contactoppervlak te onderzoeken en lokale heterogeniteiten te vermijden.
    3. Raadpleeg figuur 3C en eventuele aanvullende richtlijnen van de fabrikant om de juiste sonde te selecteren.
  3. Zodra de sonde is geselecteerd, volgt u de stappen in het Aanvullend Protocol om deze op de nano-indenter te monteren.

3. Kalibratie van de sonde

OPMERKING: De volgende stappen zijn specifiek voor ferrule-top nano-indentatieapparaten op basis van optische vezeldetectietechnologie en ze zijn gedetailleerd voor softwareversie 3.4.1. Voor andere nano-indentatieapparaten volgt u de stappen die worden aanbevolen door de fabrikant van het apparaat.

  1. Klik in het hoofdvenster van de software op Initialiseren. Er verschijnt een kalibratiemenu. Voer de sondegegevens in (vindt u aan de zijkant van de doos van de sonde; k in N/m, R in μm en de kalibratiefactor in lucht) in de ingangsdozen.
  2. Bereid de kalibratieschaal voor: een dikke glazen petrischaal met een platte bodem (zie Bespreking, kritieke stappen in het protocol). Vul de schaal met hetzelfde medium als de monsterschaal (dit kan ook lucht zijn). Stem de temperatuur van het medium af op die van het monster.
  3. Plaats de kalibratieschaal onder de sonde. Schuif indien nodig de sonde uit de armhouder van de nanoindenter en houd deze in één hand om ruimte te maken voor plaatsing van de kalibratieschaal. Schuif de sonde terug op zijn plaats.
  4. Voer de volgende twee stappen uit voor kalibratie in vloeistof. Als u in lucht meet, gebruikt u het meegeleverde polytetrafluorethyleensubstraat voor kalibratie en gaat u verder met stap 5.
    1. Bevochtig de sonde met een druppel van 70% ethanol met behulp van een Pasteur-pipet met het uiteinde van de pipet in licht contact met de glazen ferrule, zodat de druppel over de cantilever en bolvormige tip27 glijdt (zie Discussie, kritieke stappen in het protocol).
    2. Schuif de arm van de nano-indenter handmatig naar beneden totdat de sonde volledig is ondergedompeld, maar nog steeds ver weg van de bodem van de petrischaal. Voeg indien nodig meer medium toe aan de kalibratieschaal. Wacht 5 minuten zodat evenwichtsomstandigheden in de vloeistof worden bereikt.
  5. Klik in het menu Initialiseren van de software op ScanGolflengte. Het scherm van de interferometer toont een voortgangsbalk en het livesignaalvenster in de software van de computer geeft het patroon weer dat wordt weergegeven in figuur S1A, links. Als u wilt controleren of de optische scan is geslaagd, navigeert u naar het deelvenster Golflengtescan op het vak interferometer. Indien succesvol, moet een sinusgolf zichtbaar zijn (figuur 1A, rechts). Zie Discussie (probleemoplossing van de methode) als er een fout optreedt.
  6. Klik in het menu Initialiseren op Oppervlak zoeken, waardoor de sonde geleidelijk wordt verlaagd totdat een ingestelde drempel in de buiging van de cantilever is bereikt. De sonde stopt met bewegen wanneer contact wordt gemaakt met de glazen petrischaal.
  7. Controleer of de sonde in contact staat met het oppervlak. Verplaats de sonde 1 μm naar beneden met behulp van de pijlknop y naar beneden in het hoofdvenster van de software. Observeer het groene signaal (afbuiging van de cantilever) in het Live Window van de software voor veranderingen in de basislijn bij elke stap, wanneer de cantilever in contact staat met het substraat (figuur S1B). Als er geen verandering is, is de cantilever niet in contact (zie volgende stap).
  8. Verhoog de drempelwaarde in het menu Opties op het tabblad Surface zoeken van de standaardwaarde 0,01 met een stap van 0,01 tegelijk en herhaal de stap Surface zoeken totdat u contact hebt. U kunt ook de sonde in kleine stappen van 1 μm naar beneden brengen om contact te maken totdat de groene basislijn bij elke neerwaartse stap begint te verschuiven.
    OPMERKING: Voor de zachtste uitkragingen (k = 0,025 Nm-1) verhoogt u de drempelwaarde in het menu Opties onder het tabblad Surface zoeken a priori van het uitvoeren van stap 6. Begin met een drempelwaarde van 0,06 of 0,07 en verhoog deze indien nodig tot 0,1. Dit komt omdat omgevingsgeluid er waarschijnlijk voor zorgt dat de cantilever vóór contact boven de drempel buigt. Voor zachte sondes verbetert het verlagen van de naderingssnelheid (μm/s) in hetzelfde menu ook de procedure.
  9. Klik in het menu Initialiseren op Kalibreren.
  10. Controleer het livesignaalvenster van de software en zorg ervoor dat zowel de verplaatsing van piëzo als de afbuigingssignalen van cantilever tegelijkertijd omhoog bewegen (figuur S1C).
    1. Als er een mismatch in de tijd is, staat de sonde niet volledig in contact met het glas. Ga met stappen van 1 μm naar beneden in stappen totdat de basislijn van het cantileversignaal verandert (zie stap 7) en herhaal stap 9.
    2. Als het cantileversignaal helemaal niet verandert tijdens de kalibreerstap , bevindt de sonde zich ver van het oppervlak. Verhoog de contactdrempel iteratief (zie stap 8) totdat het oppervlak correct is gevonden en herhaal de kalibratie vanaf het begin, te beginnen met de golflengtescan.
  11. Wanneer de kalibratie is voltooid, controleert u de oude en nieuwe kalibratiefactoren in het weergegeven pop-upvenster. Als de nieuwe kalibratiefactor zich in het juiste bereik bevindt, klikt u op Nieuwe factor gebruiken. Als de kalibratie mislukt en de nieuwe factor NaN is of niet binnen het verwachte bereik valt, raadpleegt u Discussie (probleemoplossing van de methode) voor oplossing.
    OPMERKING: De nieuwe factor moet ~n keer lager zijn dan die op de doos van de sonde als de kalibratie is uitgevoerd in een vloeibaar medium met brekingsindex n (n = 1,33 voor water). Als de kalibratie in lucht is uitgevoerd, moeten de nieuwe en oude kalibratiefactoren ongeveer gelijk zijn.
  12. Controleer als volgt of de demodulatiecirkel correct is gekalibreerd. Navigeer naar het tabblad Demodulatie op het bureaublad van de interferometer. Tik zachtjes op de optische tafel of op de nano-indenter om voldoende ruis te genereren. Een witte cirkel bestaande uit discrete gegevenspunten moet ongeveer de rode cirkel bedekken (figuur S1D).
  13. Als de witte cirkel niet overlapt met de rode cirkel of als er een waarschuwing verschijnt op het display van de interferometer, moet de demodulatiecirkel opnieuw worden gekalibreerd. Dit kan op twee manieren zoals hieronder beschreven.
    1. Tik continu op het lichaam van de nano-indenter om een volledige cirkel van ruis te induceren en druk op de knop Kalibreren op de interferometer.
    2. Ga in contact met het glazen substraat en druk op Kalibreren in het menu Initialiseren van het hoofdvenster van de software. Sla de kalibratiefactor niet op. Controleer op dit punt opnieuw en zorg ervoor dat de witte cirkel overlapt met de rode cirkel.
      OPMERKING: Als het signaal niet alleen iets van de demodulatiecirkel wordt verplaatst, maar eerder erg klein is geworden of helemaal niet zichtbaar is, betekent dit dat de cantilever aan de optische vezel is vastgeplakt. Volg het advies voor het oplossen van problemen voor dit probleem (zie Discussie, probleemoplossing van de methode) en herhaal stap 13.1 of 13.2. Zodra de cantilever weer in zijn horizontale positie komt (figuur 3A), zal het signaal zich herstellen naar de demodulatiecirkel.
  14. Controleer de kalibratie door direct na de kalibratie een inkeping uit te voeren op het glazen substraat, zoals hieronder beschreven.
    1. Laad of maak een experimentbestand door op Experiment configureren te klikken en voeg een stap Surface zoeken en Inspringing toe. Gebruik voor de inspringingsstap de standaardinstellingen voor de verplaatsingsmodus en wijzig de maximale verplaatsing in de kalibratieafstand (3.000 nm) om de sonde tegen het stijve substraat te verplaatsen.
    2. Klik op Experiment uitvoeren en controleer de demodulatiecirkel in het interferometervenster. Controleer het witte signaal en zorg ervoor dat het zich bovenop de rode cirkel bevindt tijdens het inspringen.
    3. Controleer de resultaten in het hoofdvenster van de software in de grafiek Tijdgegevens en zorg ervoor dat de verplaatsing van de piëzo (blauwe lijn) gelijk is aan de afbuiging van de cantilever (groene lijn) omdat de inkeping begint in contact en er geen materiaalvervorming wordt verwacht. Als de signalen niet parallel lopen, raadpleegt u Discussie (probleemoplossing van de methode).
  15. Wijzig het lokale pad in het kalibratiemenu door het kalibratieopslagpad in te stellen op een geschikte map.
  16. Wanneer de sonde met succes is gekalibreerd, verplaatst u de piëzo met 500 μm.

4. Het meten van de Young's Modulus van zachte materialen

  1. Nano-indentatie van hydrogels
    1. Plaats de petrischaal met het (de) monster(s) op het stadium van de microscoop en verplaats de sonde van de nano-indenter handmatig naar een gewenste x-y-positie boven het monster.
    2. Schuif de sonde handmatig in oplossing en zorg ervoor dat u in dit stadium 1-2 mm tussen de sonde en het oppervlak van het monster laat. Wacht 5 minuten totdat de sonde in evenwicht is in het medium.
    3. Stel het z-vlak van de optische microscoop zo in dat de sonde duidelijk zichtbaar is.
    4. Voer een enkele inspringing uit om de experimentele parameters af te stemmen zoals hieronder beschreven.
      1. Configureer een nieuw experiment in het hoofdvenster van de software. Klik op Experiment configureren, waarmee een nieuw venster wordt geopend. Voeg een Surface-stap zoeken toe. Alle parameters van de stap Surface zoeken kunnen indien nodig worden gewijzigd in het menu Opties van de software.
        OPMERKING: Het Find Surface laat de sonde zakken totdat het oppervlak is gevonden en trekt de sonde vervolgens in tot een afstand gedefinieerd door Z Boven het oppervlak (μm) boven het oppervlak van het monster. Als de geselecteerde cantilever te stijf is voor het monster of als het monster kleverig is, zal de sonde na de stap waarschijnlijk nog steeds in contact komen met het monster, wat zal resulteren in een curve zonder basislijn (figuur 4C). Om dit probleem op te lossen, verhoogt u de Z boven het oppervlak (μm).
      2. Voeg een stap Inspringing toe. Selecteer het tabblad Profiel en klik op Verplaatsingsbesturingselement. Verlaat het standaard inspringingsprofiel.
      3. Klik op Experiment uitvoeren in het hoofdvenster van de software. Dit zal het oppervlak vinden en een enkele inkeping uitvoeren. Als de enkele inkeping er niet uitziet zoals verwacht, past u de experimentele parameters aan zoals beschreven in Figuur 4 en Discussie (probleemoplossing van de methode).
    5. Zodra de inspringing er naar wens uitziet, configureert u de matrixscan zo dat een voldoende groot deel van het monster wordt ingesprongen. Klik op Experiment configureren, voeg een Surface-stap zoeken toe met de eerder bepaalde experimentele parameters en voeg een matrixscan-stap toe.
    6. Configureer voor platte hydrogels een matrixscan met 50-100 punten (d.w.z. 5 x 10 of 10 x 10 in x en y) verdeeld over 10-100 μm (d.w.z. dx = dy = 10-100 μm). Klik op Stage Position gebruiken om de matrixscan te starten vanaf de huidige fasepositie. Zorg ervoor dat het selectievakje Surface automatisch zoeken is aangevinkt om het oppervlak bij elke inspringing te vinden met behulp van de ingestelde experimentele parameters.
      1. Om oversampling te voorkomen, stelt u de stapgrootte in op ten minste tweemaal de contactradius (figure-protocol-1waarbij δ de inspringingsdiepte is).
      2. Stel het matrixscanprofiel in verplaatsingsbeheer in. Zorg ervoor dat het profiel niet in strijd is met de aannames van het Hertz-model (zie Discussie, kritieke stappen in het protocol).
      3. Laat het aantal segmenten staan op 5, wat de standaardwaarde is, en gebruik het standaard verplaatsingsprofiel. Wijzig indien nodig het verplaatsingsprofiel in termen van maximale verplaatsing en tijd voor elk hellend segment, wat van invloed is op respectievelijk de maximale inkepingsdiepte en de reksnelheid. Overschrijd de stamsnelheden > 10 μm/s niet (zie Discussie, beperkingen van de methode).
      4. Voer een waarde in voor de naderingssnelheid, die bepaalt hoe snel de sonde naar het monster wordt verplaatst voordat er contact wordt gemaakt. Stem de intreksnelheid af op de naderingssnelheid (zie opmerking hieronder).
        OPMERKING: Voor zachte uitkragingen en lawaaierige omgevingen wordt een naderingssnelheid van 1.000-2.000 nm /s aanbevolen. Voor stijvere uitkragingen en gecontroleerde omgevingen kan dit worden verhoogd.
      5. Sla het geconfigureerde experiment op in het gewenste experimentpad en selecteer een map waarin de gegevens worden opgeslagen in het pad Opslaan op het tabblad Algemeen van het venster Experiment configureren . Klik op Experiment uitvoeren.
    7. Zodra de matrixscan is voltooid, verhoogt u de sonde met 200-500 μm en verplaatst u de sonde naar een ander gebied van het monster dat voldoende ver van het eerste gebied verwijderd is.
    8. Herhaal het experiment ten minste twee keer, zodat voldoende gegevens over elk monster worden verkregen (d.w.z. ten minste twee matrixscans per monster, die elk 50-100 curven bevatten).
  2. Nano-indentatie van cellen
    1. Plaats het monster op de microscoop zoals hierboven beschreven.
    2. Voor eencellige inkepingen stelt u het z-vlak zo scherp dat zowel cellen als de sonde zichtbaar zijn bij een vergroting van 20x of 40x, afhankelijk van de celgrootte en verspreiding.
    3. Plaats de sonde boven de cel die moet worden ingesprongen.
    4. Configureer een nieuw experiment in het hoofdvenster van de software. Klik op Experiment configureren, waarmee een nieuw venster wordt geopend. Voeg een stap Surface zoeken en Inspringing toevoegen met standaardparameters in de verplaatsingsmodus.
    5. Klik op Experiment uitvoeren, dat het oppervlak vindt en een enkele inspringing uitvoert. Controleer of de inspringing is geslaagd. Als de curve er niet uitziet zoals verwacht, past u de experimentele parameters aan (zie Figuur 4 en Discussie, probleemoplossing van de methode).
    6. Als de inspringing is geslaagd, voegt u een matrixscan toe aan het experiment. Volg de stappen die worden gegeven voor nano-indentatie-experimenten van hydrogels; configureer de matrixscan zodat de stapgrootte het mogelijk maakt een klein deel van de cel in te laten inspringen; 25 punten verdeeld over 0,5-5 μm voor HEK293T-cellen.
      1. Afhankelijk van de celgrootte past u de matrixscan aan om ervoor te zorgen dat de punt niet buiten de cellimiet inspringt, d.w.z. een andere kaartgeometrie uitvoert of minder punten onderzoekt.
    7. Klik op Experiment uitvoeren en wacht tot het is voltooid.
    8. Zodra de matrixscan is voltooid, brengt u de sonde uit contact (50 μm in het z-vlak ).
    9. Verplaats de sonde boven een nieuwe cel en herhaal het proces (zie Discussie, kritieke stappen in het protocol).
  3. De sonde reinigen en het instrument uitschakelen
    1. Volg de stappen in het Aanvullend Protocol om de sonde schoon te maken en het nano-indentatieapparaat uit te schakelen.

5. Data-analyse

  1. Downloaden en installeren van de software
    1. Volg de stappen in het Aanvullend Protocol om de software voor data-analyse te downloaden en te installeren28,29.
  2. Screening van F-z-curven en productie van opgeschoonde dataset in JSON-formaat
    1. Start prepare.py vanaf de opdrachtregel op de labcomputer zoals beschreven in stap 2 tot en met 3.
    2. Als u een Windows-computer gebruikt, houdt u de Shift-toets ingedrukt terwijl u met de rechtermuisknop op de map NanoPrepare klikt en klikt u op PowerShell-venster hier openen. Typ de opdracht python prepare.py en druk op Enter . Er verschijnt een GUI op uw scherm (figuur S2).
    3. Als u een MacOS-computer gebruikt, klikt u met de rechtermuisknop op de map NanoPrepare en klikt u op Nieuwe terminal in map. Typ de opdracht python3 prepare.py en druk op Enter , waarmee de GUI wordt gestart (Figuur S2).
    4. Selecteer de O11NEW-gegevensindeling in de vervolgkeuzelijst. Als gegevens niet correct zijn geladen, start u de GUI opnieuw en selecteert u O11OLD.
      OPMERKING: Het O11NEW-formaat werkt voor gegevens die zijn verkregen met behulp van ferrule-top optische vezeldetectie nano-indentatieapparaten met softwareversie 3.4.1. Dit formaat werkt ook voor eerdere softwareversies, althans die van nano-indenters die in 2019-2020 zijn geïnstalleerd.
    5. Klik op Map laden. Selecteer een map met de te analyseren gegevens- enkele matrixscan of meerdere matrixscans. De bovenste grafiek (Onbewerkte curven) wordt gevuld met de geüploade gegevensset. Om een specifieke curve te visualiseren, klikt u erop. Dit markeert het in het groen en toont het op de onderste grafiek (Huidige curve).
    6. Reinig de gegevensset met behulp van de tabbladen aan de rechterkant van de GUI, zoals hieronder beschreven.
      1. Gebruik de knop Segment om het juiste segment te selecteren dat moet worden geanalyseerd, het voorwaartse segment van F-z-curven . Het specifieke aantal is afhankelijk van het aantal segmenten dat in de nano-indentatiesoftware is geselecteerd bij het uitvoeren van experimenten.
      2. Gebruik de knop Bijsnijden 50 nm om de curven uiterst links (als L is aangevinkt) met 50 nm bij te snijden, rechts (als R is aangevinkt) of beide zijden (als zowel R als L zijn aangevinkt). Klik meerdere keren op deze knop om zoveel bij te snijden als nodig is. Gebruik dit om artefacten te verwijderen die aanwezig zijn aan het begin/einde van F-z-curven .
      3. Inspecteer het tabblad Cantilever op de veerconstante, tipgeometrie en tipradius. Controleer het tabblad om er zeker van te zijn dat de metagegevens correct zijn gelezen.
      4. Gebruik het tabblad Screening om een krachtdrempel in te stellen waarmee alle curven worden verwijderd die de opgegeven kracht niet hebben bereikt. Weggegooide curven worden rood gemarkeerd.
      5. Gebruik de knop Handmatig in-/uitschakelen om curven die niet correct zijn verkregen handmatig te verwijderen. Verwijder eventuele curven door op de specifieke curve te klikken en OUT te selecteren, waardoor de curve rood wordt gemarkeerd.
    7. Klik op JSON opslaan. Voer een geschikte naam in voor de opgeschoonde gegevensset, die één JSON-bestand is. Stuur het JSON-bestand naar de computer waarop de NanoAnalysis-software is geïnstalleerd.

6. Formele data-analyse

  1. Start het nano.py-bestand vanaf de opdrachtregel door naar de map NanoAnalysis te navigeren en een terminal te starten zoals eerder uitgelegd. Typ de opdracht python nano.py of python3 nano.py (afhankelijk van het besturingssysteem) en druk op Enter . Er verschijnt een GUI op uw scherm (figuur S3).
  2. Klik linksboven in de GUI op Experiment laden en selecteer het JSON-bestand. Hiermee worden de bestandslijst en de grafiek Onbewerkte curven gevuld met de gegevensset in termen van F-z-curven . Zowel de F - als de z-as worden weergegeven ten opzichte van de CP-coördinaten, die op de achtergrond worden berekend bij het laden van de gegevensset (zie de volgende opmerking). Controleer in het vak Statistieken de waarden van de drie parameters: Ngeactiveerd, N mislukt en Nuitgesloten.
    OPMERKING: Ngeactiveerd vertegenwoordigt het aantal curven dat zal worden geanalyseerd in de daaropvolgende Hertz / elasticiteit spectra-analyse en in zwart zal verschijnen in de Raw Curves-grafiek . Nmislukt vertegenwoordigt het aantal curven waarop geen betrouwbare CP kon worden gevonden en in blauw in de grafiek werd weergegeven. Deze curven worden automatisch weggegooid in de daaropvolgende analyse. Bij het openen van de software kunnen sommige curven automatisch naar de mislukte set worden verplaatst. Dit komt omdat de CP wordt berekend bij het openen van de software met het standaard Threshold-algoritme (zie hieronder). Nuitgesloten vertegenwoordigt de curven die handmatig zijn geselecteerd om te worden uitgesloten van de analyse en worden in rood weergegeven in de grafiek (zie hieronder).
  3. Controleer of het aantal mislukte, uitgesloten en geactiveerde curven redelijk is. Bekijk de grafiek Onbewerkte curven om de curven te visualiseren.
  4. Om een specifieke curve in meer detail te visualiseren, klikt u erop. Dit markeert het in het groen en toont het op de current curve grafiek. Zodra een enkele curve is geselecteerd, worden de R - en k-parameters (die voor alle curven hetzelfde moeten zijn) ingevuld in het vak Statistieken van de GUI.
  5. Wijzig de status van een bepaalde curve met behulp van het vak Schakelen . Klik op de specifieke curve waarvan u de status wilt wijzigen en klik vervolgens op Geactiveerd, Mislukt of Uitgesloten. De telling in het vak Statistieken wordt automatisch bijgewerkt.
    OPMERKING: Als u de weergave van de gegevensset in de grafiek Onbewerkte curven wilt wijzigen, gebruikt u het vak Weergave . Klik op Alles om alle curven weer te geven (d.w.z. geactiveerd, mislukt en uitgesloten in de respectieve kleuren). Klik op Mislukt om de geactiveerde en de mislukte curven weer te geven en klik op Geactiveerd om alleen de geactiveerde curven weer te geven. Om de status van alle curven tussen geactiveerd en uitgesloten opnieuw in te stellen, klikt u op Geactiveerd of Uitgesloten in het vak Reset .
  6. Zodra de gegevensset verder is opgeschoond, volgt u de onderstaande pijplijn voor gegevensanalyse.
    1. Filter alle ruis die aanwezig is in de curven met behulp van de filters die zijn geïmplementeerd in de GUI (Filtering Box), namelijk een aangepast filter genaamd Prominency-filter, het Savitzky Golay 30,31 (SAVGOL) -filter en een afvlakfilter op basis van het berekenen van de mediaan van de gegevens in een bepaald venster (mediaanfilter). Zie Discussie (kritieke stappen in het protocol) voor meer informatie over filters.
    2. Controleer de gefilterde curven in de grafiek Huidige curve . De gefilterde curve wordt in zwart weergegeven, terwijl de niet-gefilterde versie van de curve in het groen wordt weergegeven.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de gegevens zo min mogelijk te filteren om kenmerken van het oorspronkelijke signaal te behouden. Overfiltering kan eventuele verschillen in de gegevens gladstrijken. Werken met het prominency filter geactiveerd is voldoende voor de Hertz analyse van nano-indentatie data. Als de gegevens bijzonder luidruchtig zijn, kunnen bovendien een SAVGOL- of mediane filters worden toegepast.
    3. Selecteer een algoritme om de CP te vinden. Kies in het vak Contactpunt een van een reeks numerieke procedures die in de software zijn geïmplementeerd, namelijk de Goodness of Fit (GoF) 32, Ratio of Variances (RoV) 32, Tweede afgeleide33 of Threshold33. Zie Discussie, kritieke stappen in het protocol voor meer informatie over de algoritmen.
      OPMERKING: De CP is het punt waarop de sonde in contact komt met het materiaal en moet worden geïdentificeerd om F-z-gegevens om te zetten in F-δ gegevens (voor zachte materialen is δ eindig en moet worden berekend). Het geselecteerde algoritme wordt toegepast op alle actieve curven van de gegevensset en curven waarbij het algoritme er niet in slaagt de CP robuust te lokaliseren, worden verplaatst naar de mislukte set.
    4. Pas de parameters van het algoritme aan uw gegevensset aan, zodat de CP correct wordt gelokaliseerd, zoals beschreven in de discussie, kritieke stappen in het protocol. Om te zien waar de CP op een enkele curve is gevonden, selecteert u de curve door erop te klikken en op Inspecteren te klikken. Controleer het pop-upvenster dat verschijnt om te identificeren waar de CP zich heeft bevonden.
    5. Controleer of de rode lijn die verschijnt, de parameter die het algoritme heeft berekend in het geselecteerde interessegebied, een maximale of minimale waarde heeft die overeenkomt met de locatie van de CP (voor de GoF is de parameter bijvoorbeeld de R2). Herhaal dit proces indien nodig voor alle curven.
      OPMERKING: De assen van de pop-up bevinden zich in absolute coördinaten, zodat de locatie van de CP kan worden weergegeven. Omgekeerd worden de assen van de grafiek Ruwe curven en huidige curven weergegeven ten opzichte van de CP, d.w.z. de locatie van de CP is (0,0).
    6. Klik op Hertz Analyse. Dit genereert drie grafieken die hieronder worden beschreven.
      1. Controleer individuele F-δ curven in de dataset samen met de gemiddelde Hertz fit (rode stippellijn). Pas de inspringing in nm aan waarop het Hertz-model is gemonteerd in het vak Resultaten onder Maximale inspringing (nm). Stel het in op maximaal ~10% van R om het Hertz-model geldig te maken (zie Discussie, kritieke stappen in het protocol).
      2. Controleer de gemiddelde F-δ curve met foutband die één standaarddeviatie (SD) weergeeft samen met de gemiddelde Hertz fit (rode stippellijn). Visualiseer de gemiddelde Hertz-fit op de Raw Curves-grafiek ter referentie en de Hertz-fit voor elke curve op de Current Curve.
      3. Controleer de spreidingsplot van E afkomstig van het passen van het Hertz-model op elke afzonderlijke curve.
    7. Klik op de bestandsnaam, F-z-curve , F-δ curve of een punt op de scatter plot om de curve in elke plot te markeren. Als een gegevenspunt in de spreidingsplot buiten de verdeling van de gegevens lijkt te liggen, klikt u erop en inspecteert u de curve waartoe het behoort. Controleer of de CP correct is gevonden door op de knop Inspecteren te klikken. Sluit de curve indien nodig uit van de analyse.
    8. Controleer het vak Resultaten op het berekende gemiddelde E en de SD (Eγ ± σ) en controleer of deze redelijk zijn voor het gegeven experiment.
    9. Klik in het vak Opslaan op Hertz. Voer in het pop-upvenster de bestandsnaam en map in. Als u klaar bent, klikt u op Opslaan. Er wordt een .tsv-bestand gemaakt. Open het .tsv-bestand in een extra voorkeurssoftware en gebruik de waarden voor statistische analyse en verdere plotting.
      OPMERKING: Het bestand bevat de E verkregen uit elke curve en de gemiddelde E en de SD. Bovendien bevat het bestand metagegevens die zijn gekoppeld aan de analyse, inclusief het aantal geanalyseerde curven, R, k en de maximale inspringing die wordt gebruikt voor het Hertz-model.
    10. Deze stap is optioneel. Klik op Gemiddelde F-Ind om de gemiddelde kracht en de gemiddelde inkeping te exporteren, samen met één SD in de kracht.
    11. Voor cel nano-indentatiegegevens klikt u op Elasticiteit Spectra Analyse (zie Representatieve resultaten en discussie). Inspecteer de twee geproduceerde plots, namelijk E als functie van de inkepingsdiepte (E (δ)) voor elke curve, en de gemiddelde E (δ) met foutband met één SD (ononderbroken rode lijn en gearceerd gebied) aangebracht door een model (zwarte stippellijn), waarmee de module young van de cel kan worden geschat, de bulk young's modulus van de cel, de bulk young's modulus van de cel, en de dikte van de actine cortex. Controleer bovendien de gemiddelde E (δ) in de bovenste grafiek in rood.
    12. Zorg ervoor dat het vakje Interpolaat is aangevinkt, dat ervoor zorgt dat de afgeleide die nodig is om de elasticiteitsspectraanalyse uit te voeren, wordt berekend op het geïnterpoleerde signaal (zie Representatieve resultaten).
    13. Inspecteer het vak Resultaten en rapporteer de Young-modulus van de cortex (E0 ± σ), de bulk Young-modulus van de cel (Eb ± σ) en de cortexdikte (d0 ± σ).
      OPMERKING: De gemiddelde elasticiteitsspectra kunnen in eerste instantie luidruchtig lijken, met prominente sinusoïdale oscillaties. Als gevolg hiervan is vergelijking (3) mogelijk niet correct aangebracht. Als dit het geval is, lost het iteratief verhogen van de vensterlengte van het gladstrijkende SAVGOL-filter34 dit probleem op.
    14. Zodra de analyse is voltooid, klikt u op ES in het vak Opslaan . Hiermee exporteert u een .tsv-bestand in de opgegeven map, met de gemiddelde elasticiteit als functie van de gemiddelde inspringingsdiepte en contactradius, de metagegevens die aan het experiment zijn gekoppeld (zie hierboven) en de geschatte modelparameters die hierboven zijn uitgelegd. Ten slotte wordt ook de gemiddelde elasticiteit gerapporteerd, rekening houdend met de afhankelijkheid van δ en zijn SD.
    15. Sluit de software en voer de opgeslagen resultaten in elke andere voorkeurssoftware in om de gegevens verder te plotten en statistische analyse uit te voeren.
    16. Deze stap is optioneel: Exporteer grafieken vanuit de GUI door met de rechtermuisknop op de grafiek te klikken en Exporteren te selecteren. Exporteer de grafiek in .svg, zodat parameters zoals lettertype, lettergrootte, lijnstijl, enz. kan worden bewerkt in een andere software naar keuze.
      OPMERKING: Aangepaste CP-algoritmen en filters kunnen worden geprogrammeerd en toegevoegd aan de reeds bestaande. Zie aanvullende aantekening 1 voor nadere bijzonderheden.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Volgens het protocol wordt een set F-z-curven verkregen. De dataset bevat hoogstwaarschijnlijk goede curven en curven die moeten worden weggegooid voordat de analyse wordt voortgezet. Over het algemeen moeten curven worden weggegooid als hun vorm afwijkt van die in figuur 4A. Figuur 5AI toont een dataset van ~100 curves verkregen op een zachte PAAm hydrogel van verwachte E 0.8 KPa35 geüpload in de NanoPrepare GUI. De mee...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol laat zien hoe krachtig krachtspectroscopie nanoindentatiegegevens kunnen worden verkregen met behulp van een in de handel verkrijgbare ferrule-top nanoindenter op zowel hydrogels als enkele cellen. Daarnaast worden instructies gegeven voor het gebruik van een open-source software geprogrammeerd in Python, bestaande uit een nauwkeurige workflow voor de analyse van nano-indentatiegegevens.

Kritieke stappen in het protocol
De volgende stappen zijn van bijzonder be...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GC en MAGO erkennen alle leden van de CeMi. MSS erkent steun via een EPSRC-programmasubsidie (EP/P001114/1).

GC: software (bijdrage aan softwareontwikkeling en algoritmen), formele analyse (analyse van nano-indentatiegegevens), validatie, onderzoek (nano-indentatie-experimenten op polyacrylamidegels), datacuratie, schrijven (origineel concept, beoordeling en bewerking), visualisatie (figuren en grafieken). MAGO: onderzoek (voorbereiding van gels en celmonsters, nano-indentatie-experimenten op cellen), schrijven (origineel concept, review en redactie), visualisatie (figuren en grafieken). NA: validatie, schrijven (review en redigeren). IL: software (bijdrage aan softwareontwikkeling en algoritmes), validatie, schrijven (review en redactie); MV: conceptualisatie, software (ontwerp en ontwikkeling van originele software en algoritmen), validatie, middelen, schrijven (origineel concept, review en redactie), supervisie, projectadministratie, financieringsovername MSS: middelen, schrijven (review en editing), supervisie, projectadministratie, financieringsacquisitie. Alle auteurs lazen en keurden het definitieve manuscript goed.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12 mm coverslipsVWR631-1577P
35 mm cell treated culture dishesGreiner CELLSTAR627160
AcrylamideSigma-AldrichA4058
AcrylsilaneAlfa AesarL16400
Ammonium PersulfateMerk7727-54-0
BisacrylamideMerk110-26-9
Chiaro nanoindenterOptics 11 Life geen catalogusnummer
Ethanolalgemeen
Fetal bovine serumGibco16140071
High glucose DMEMGibco11995065
Isopropanolalgemeen
KimwipeKimberly Clark21905-026
Microscope glass slidesVWR631-1550P
MilliQ systemMerk MilliporeZR0Q008WW
OP1550 InterferometerOptics11 Lifegeen catalogusnummer
Optics 11 Life probe (k = 0,02-0,005 N/m, R = 3-3,5 um)Optics 11 Lifegeen catalogusnummer
Optics 11 Life probe (k = 0,46-0,5 N/m, R = 50-55 um)Optics 11 Lifegeen catalogusnummer
Penicillin/StreptomycinGibco15140122
RainX rain repellentRainX26012
Standard petri dishes (90 mm)Thermo Scientific101RTIRR
TetramethylethylenediamineSigma-Aldrich110-18-9
Vaccum dessicatorThermo Scientific531-0250
Software
Data acquisition software (v 3.4.1)Optics 11 Life
GitHub Desktop (Optioneel)Microsoft
Python 3Python Software Foundation
Visual Studio Code (Optioneel)Microsoft

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Discher, D. E., Janmey, P. Y. W. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), New York, N.Y. 1139-1143 (2005).
  2. Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. Quantifying forces in cell biology. Nature Cell Biology. 19 (7), 742-751 (2017).
  3. Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering. Nature. Reviews. Materials. 5, 351-370 (2020).
  4. Moeendarbary, E., Harris, A. R. Cell mechanics: Principles, practices, and prospects. Wiley Interdisciplinary. Reviews. Systems. Biology and Medicine. 6 (5), 371-388 (2014).
  5. Butcher, D. T., Alliston, T., Weaver, V. M. A tense situation: Forcing tumour progression. Nature Reviews Cancer. 9 (2), 108-122 (2009).
  6. Kubánková, M., et al. Physical phenotype of blood cells is altered in COVID-19. Biophysical Journal. 120 (14), 2838-2847 (2021).
  7. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  8. Ciccone, G., et al. What caging force cells feel in 3D hydrogels: A rheological perspective. Advanced Healthcare Materials. 9 (17), 2000517(2020).
  9. Wu, P. H., et al. A comparison of methods to assess cell mechanical properties. Nature Methods. 15 (7), 491-498 (2018).
  10. McKee, C. T., Last, J. A., Russell, P., Murphy, C. J. Indentation versus tensile measurements of young's modulus for soft biological tissues. Tissue Engineering B Reviews. 17 (3), 155-164 (2011).
  11. Humphrey, J. D., Delange, S. L. An Introduction to Biomechanics Solids and Fluids, Analysis and Design. , Springer-Verlag. New York. 271-371 (2004).
  12. Prevedel, R., Diz-Muñoz, A., Ruocco, G., Antonacci, G. Brillouin microscopy: an emerging tool for mechanobiology. Nature Methods. 16 (10), 969-977 (2019).
  13. Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nature Reviews Physics. 1, 41-57 (2019).
  14. Norman, M. D. A., Ferreira, S. A., Jowett, G. M., Bozec, L., Gentleman, E. Measuring the elastic modulus of soft culture surfaces and three-dimensional hydrogels using atomic force microscopy. Nature Protocols. 16 (5), 2418-2449 (2021).
  15. Gavara, N. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
  16. Whitehead, A. J., Kirkland, N. J., Engler, A. J. Atomic force microscopy for live-cell and hydrogel measurement. Methods in Molecular Biology. 2299, Clifton, N.J. 217-226 (2021).
  17. Chavan, D., et al. Ferrule-top nanoindenter: An optomechanical fiber sensor for nanoindentation. The Review of Scientific Instruments. 83 (11), 115110(2012).
  18. Van Hoorn, H., Kurniawan, N. A., Koenderink Ac, G. H., Iannuzzi, D. Local dynamic mechanical analysis for heterogeneous soft matter using ferrule-top indentation. Soft Matter. 12 (12), 3066-3073 (2016).
  19. Baldini, F., et al. Biomechanics of cultured hepatic cells during different steatogenic hits. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 97, 296-305 (2019).
  20. Emig, R., et al. Piezo1 channels contribute to the regulation of human atrial fibroblast mechanical properties and matrix stiffness sensing. Cells. 10 (3), 663(2021).
  21. Dobre, O., et al. A hydrogel platform that incorporates laminin isoforms for efficient presentation of growth factors - Neural growth and osteogenesis. Advanced Functional Materials. 31 (21), 2010225(2021).
  22. Antonovaite, N., Beekmans, S. V., Hol, E. M., Wadman, W. J., Iannuzzi, D. Regional variations in stiffness in live mouse brain tissue determined by depth-controlled indentation mapping. Scientific Reports. 8 (1), 12517(2018).
  23. Wu, G., Gotthardt, M., Gollasch, M. Assessment of nanoindentation in stiffness measurement of soft biomaterials: kidney, liver, spleen and uterus. Scientific Reports. 10 (1), 18784(2020).
  24. Lüchtefeld, I., et al. Elasticity spectra as a tool to investigate actin cortex mechanics. Journal of Nanobiotechnology. 18 (1), 147(2020).
  25. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  26. Blumlein, A., Williams, N., McManus, J. J. The mechanical properties of individual cell spheroids. Scientific Reports. 7 (1), 7346(2017).
  27. Mirsandi, H., et al. Influence of wetting conditions on bubble formation from a submerged orifice. Experiments in Fluids. 61, 83(2020).
  28. Vassalli, M., Ciccone, G. CellMechLab/NanoPrepare: v0.1.1. Zendo. , (2021).
  29. Vassalli, M., Ciccone, G., Lüchtefeld, I. CellMechLab/nanoindentation: v1.0.0. Zendo. , (2021).
  30. Savitzky, A., Golay, M. J. E. Smoothing and differentiation of data by simplified least squares procedures. Analytical Chemistry. 36 (8), 1627-1639 (1964).
  31. Schafer, R. W. What is a savitzky-golay filter. IEEE Signal Processing Magazine. 28 (4), 111-117 (2011).
  32. Gavara, N. Combined strategies for optimal detection of the contact point in AFM force-indentation curves obtained on thin samples and adherent cells. Scientific Reports. 6, 21267(2016).
  33. Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis-I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).
  34. Virtanen, P., et al. SciPy 1.0: fundamental algorithms for scientific computing in Python. Nature Methods. 17 (3), 261-272 (2020).
  35. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 10 (2010).
  36. Pharr, G. M., Oliver, W. C., Brotzen, F. R. On the generality of the relationship among contact stiffness, contact area, and elastic modulus during indentation. Journal of Materials Research. 7 (3), 613-617 (1992).
  37. Kumar, R., Saha, S., Sinha, B. Cell spread area and traction forces determine myosin-II-based cortex thickness regulation. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1866 (12), 118516(2019).
  38. Kunda, P., Pelling, A. E., Liu, T., Baum, B. Moesin controls cortical rigidity, cell rounding, and spindle morphogenesis during mitosis. Current Biology: CB. 18 (2), 91-101 (2008).
  39. Allen, M., Poggiali, D., Whitaker, K., Marshall, T. R., Kievit, R. A. Raincloud plots: a multi-platform tool for robust data visualization. Wellcome Open Research. 4, 63(2019).
  40. Clark, A. G., Paluch, E. Mechanics and regulation of cell shape during the cell cycle. Results and Problems in Cell Differentiation. 53, 31-73 (2011).
  41. Langan, T. J., Rodgers, K. R., Chou, R. C. Synchronization of mammalian cell cultures by serum deprivation. Methods in Molecular Biology. 1524, Clifton, N.J. 97-105 (2017).
  42. Hodgkinson, T., et al. The use of nanovibration to discover specific and potent bioactive metabolites that stimulate osteogenic differentiation in mesenchymal stem cells. Science Advances. 7 (9), 7921(2021).
  43. Kloxin, A. M., Kloxin, C. J., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Mechanical properties of cellularly responsive hydrogels and their experimental determination. Advanced Materials (Deerfield Beach, Fla). 22 (31), 3484-3494 (2010).
  44. Loessner, D., et al. Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms. Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).
  45. Yue, K., et al. Synthesis, properties, and biomedical applications of gelatin methacryloyl (GelMA) hydrogels. Biomaterials. 73, 254-271 (2015).
  46. Sarrigiannidis, S. O., et al. A tough act to follow: collagen hydrogel modifications to improve mechanical and growth factor loading capabilities. Materials Today. Bio. 10, 100098(2021).
  47. Karoutas, A., et al. The NSL complex maintains nuclear architecture stability via lamin A/C acetylation. Nature Cell Biology. 21 (10), 1248-1260 (2019).
  48. Ryu, H., et al. Transparent, compliant 3D mesostructures for precise evaluation of mechanical characteristics of organoids. Advanced Materials (Deerfield Beach, Fla). 33 (25), 2100026(2021).
  49. Carvalho, D. T. O., Feijão, T., Neves, M. I., Da Silva, R. M. P., Barrias, C. C. Directed self-assembly of spheroids into modular vascular beds for engineering large tissue constructs Biofabrication Directed self-assembly of spheroids into modular vascular beds for engineering large tissue constructs. Biofabrication. 13 (3), 035008(2021).
  50. Chaudhuri, O., Cooper-White, J., Janmey, P. A., Mooney, D. J., Shenoy, V. B. Effects of extracellular matrix viscoelasticity on cellular behaviour. Nature. 584 (7822), 535-546 (2020).
  51. Cantini, M., Donnelly, H., Dalby, M. J., Salmeron-Sanchez, M. The plot thickens: The emerging role of matrix viscosity in cell mechanotransduction. Advanced Healthcare Materials. 9 (8), 1901259(2020).
  52. Elosegui-Artola, A. The extracellular matrix viscoelasticity as a regulator of cell and tissue dynamics. Current Opinion in Cell Biology. 72, 10-18 (2021).
  53. Chaudhuri, O. Viscoelastic hydrogels for 3D cell culture. Biomaterials Science. 5 (8), 1480-1490 (2017).
  54. Nguyen, T. D., Gu, Y. Determination of strain-rate-dependent mechanical behavior of living and fixed osteocytes and chondrocytes using atomic force microscopy and inverse finite element analysis. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (10), 101004(2014).
  55. Mokbel, M., Hosseini, K., Aland, S., Fischer-Friedrich, E. The Poisson Ratio of the Cellular Actin Cortex Is Frequency Dependent. Biophysical Journal. 118 (8), 1968-1976 (2020).
  56. Javanmardi, Y., Colin-York, H., Szita, N., Fritzsche, M., Moeendarbary, E. Quantifying cell-generated forces: Poisson's ratio matters. Communications Physics. 4, 237(2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Soft Matter NanoindentationNanoindentation WorkflowAtomic Force MicroscopyOptical Fiber NanoindenterYoung s ModulusMechanical PropertiesHydrogel StiffnessCell NanoindentationHertz ModelElasticity Spectra

Related Articles