Experimentele en data-analyse workflow voor soft matter nano-indentatie

Summary

Het protocol presenteert een complete workflow voor nano-indentatie-experimenten met zacht materiaal, inclusief hydrogels en cellen. Ten eerste zijn de experimentele stappen om krachtspectroscopiegegevens te verkrijgen gedetailleerd; vervolgens wordt de analyse van dergelijke gegevens gedetailleerd beschreven via een nieuw ontwikkelde open-source Python-software, die gratis te downloaden is van GitHub.

Abstract

Nanoindentatie verwijst naar een klasse van experimentele technieken waarbij een micrometrische krachtsonde wordt gebruikt om de lokale mechanische eigenschappen van zachte biomaterialen en cellen te kwantificeren. Deze aanpak heeft een centrale rol gekregen op het gebied van mechanobiologie, biomaterialenontwerp en weefselmanipulatie, om een goede mechanische karakterisering van zachte materialen te verkrijgen met een resolutie die vergelijkbaar is met de grootte van enkele cellen (μm). De meest populaire strategie om dergelijke experimentele gegevens te verkrijgen, is het gebruik van een atoomkrachtmicroscoop (AFM); hoewel dit instrument een ongekende resolutie biedt in kracht (tot pN) en ruimte (sub-nm), wordt de bruikbaarheid ervan vaak beperkt door de complexiteit die routinematige metingen van integrale indicatoren van mechanische eigenschappen, zoals Young's Modulus (E), voorkomt. Een nieuwe generatie nano-indenters, zoals die op basis van optische vezeldetectietechnologie, is onlangs populair geworden vanwege het gemak van integratie, terwijl het mogelijk is om sub-nN-krachten toe te passen met een ruimtelijke resolutie van μm, waardoor het geschikt is om lokale mechanische eigenschappen van hydrogels en cellen te onderzoeken.

In dit protocol wordt een stapsgewijze handleiding gepresenteerd met de experimentele procedure voor het verkrijgen van nano-indentatiegegevens op hydrogels en cellen met behulp van een in de handel verkrijgbare ferrule-top optische vezeldetectie nano-indenter. Hoewel sommige stappen specifiek zijn voor het instrument dat hierin wordt gebruikt, kan het voorgestelde protocol worden gebruikt als een gids voor andere nano-indentatie-apparaten, mits sommige stappen zijn aangepast aan de richtlijnen van de fabrikant. Verder wordt een nieuwe open-source Python-software gepresenteerd die is uitgerust met een gebruiksvriendelijke grafische gebruikersinterface voor de analyse van nano-indentatiegegevens, die het mogelijk maakt om onjuist verkregen curven, gegevensfiltering, berekening van het contactpunt via verschillende numerieke procedures, de conventionele berekening van E, evenals een meer geavanceerde analyse die bijzonder geschikt is voor eencellige nano-indentatiegegevens.

Introduction

De fundamentele rol van de mechanica in de biologie is tegenwoordig vastgesteld ^1,2. Van hele weefsels tot afzonderlijke cellen, mechanische eigenschappen kunnen informeren over de pathofysiologische toestand van het onderzochte biomateriaal ^3,4. Borstweefsel aangetast door kanker is bijvoorbeeld stijver dan gezond weefsel, een concept dat de basis is van de populaire palpatietest⁵. Met name is onlangs aangetoond dat de coronavirusziekte 2019 (COVID-19) veroorzaakt door ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-....

Protocol

1. Voorbereiding van substraten/cellen voor nano-inductiemetingen

1. Volg de stappen in het Aanvullend Protocol voor de bereiding van PAAm hydrogels/cellen voor nano-inductie-experimenten. De procedure is samengevat in figuur 2.
   OPMERKING: PAAm hydrogels zijn gekozen omdat ze de meest voorkomende hydrogels zijn die worden gebruikt op het gebied van mechanobiologie. Het protocol is echter evenzeer van toepassing op elk type hydrogel²⁵ (zie Discussie, wijzigingen van de methode).

2. Het apparaat opstarten, de testkeuz....

Results

Volgens het protocol wordt een set F-z-curven verkregen. De dataset bevat hoogstwaarschijnlijk goede curven en curven die moeten worden weggegooid voordat de analyse wordt voortgezet. Over het algemeen moeten curven worden weggegooid als hun vorm afwijkt van die in figuur 4A. Figuur 5AI toont een dataset van ~100 curves verkregen op een zachte PAAm hydrogel van verwachte E 0.8 KPa³⁵ geüpload in de NanoPrepare GUI. De mee.......

Discussion

Dit protocol laat zien hoe krachtig krachtspectroscopie nanoindentatiegegevens kunnen worden verkregen met behulp van een in de handel verkrijgbare ferrule-top nanoindenter op zowel hydrogels als enkele cellen. Daarnaast worden instructies gegeven voor het gebruik van een open-source software geprogrammeerd in Python, bestaande uit een nauwkeurige workflow voor de analyse van nano-indentatiegegevens.

Kritieke stappen in het protocol
De volgende stappen zijn van bijzonder be.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 mm coverslips	VWR	631-1577P
35 mm cell treated culture dishes	Greiner CELLSTAR	627160
Acrylamide	Sigma-Aldrich	A4058
Acrylsilane	Alfa Aesar	L16400
Ammonium Persulfate	Merk	7727-54-0
Bisacrylamide	Merk	110-26-9
Chiaro nanoindenter	Optics 11 Life		no catologue number
Ethanol			general
Fetal bovine serum	Gibco	16140071
High glucose DMEM	Gibco	11995065
Isopropanol			general
Kimwipe	Kimberly Clark	21905-026
Microscope glass slides	VWR	631-1550P
MilliQ system	Merk Millipore	ZR0Q008WW
OP1550 Interferometer	Optics11 Life		no catalogue number
Optics 11 Life probe (k = 0.02-0.005 N/m, R = 3-3.5 um)	Optics 11 Life		no catologue number
Optics 11 Life probe (k = 0.46-0.5 N/m, R = 50-55 um)	Optics 11 Life		no catologue number
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122
RainX rain repellent	RainX	26012
Standard petri dishes (90 mm)	Thermo Scientific	101RTIRR
Tetramethylethylenediamine	Sigma-Aldrich	110-18-9
Vaccum dessicator	Thermo Scientific	531-0250
Software
Data acquisition software (v 3.4.1)	Optics 11 Life
GitHub Desktop (Optional)	Microsoft
Python 3	Python Software Foundation
Visual Studio Code (Optional)	Microsoft