Methodenartikel

Snelle Golgi-vlek voor dendritische wervelkolomvisualisatie in hippocampus en prefrontale cortex

DOI:

10.3791/63404

⸱

3 december 2021

 , 
1Department of Science Education, Donald and Barbara Zucker School of Medicine at Hofstra/Northwell, 2Department of Psychology, Sacred Heart University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol beschrijft een wijziging van de snelle Golgi-methode, die kan worden aangepast aan elk deel van het zenuwstelsel, voor het kleuren van neuronen in de hippocampus en de mediale prefrontale cortex van de rat.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Golgi-impregnatie, met behulp van de Golgi-kleuringskit met kleine aanpassingen, wordt gebruikt om dendritische stekels in de hippocampus van de rat en de mediale prefrontale cortex te impregneren. Deze techniek is een duidelijke verbetering ten opzichte van eerdere methoden van Golgi-impregnatie omdat de voorgemengde chemicaliën veiliger zijn om te gebruiken, neuronen consequent goed geïmpregneerd zijn, er veel minder achtergrondresten zijn en voor een bepaald gebied zijn er extreem kleine afwijkingen in de wervelkolomdichtheid tussen experimenten. Bovendien kunnen hersenen na een bepaald punt worden opgehoopt en bevroren worden gehouden tot verdere verwerking. Met behulp van deze methode kan elk hersengebied van belang worden bestudeerd. Eenmaal gekleurd en bedekt, wordt de dendritische wervelkolomdichtheid bepaald door het aantal stekels voor een lengte van dendriet te tellen en uitgedrukt als wervelkolomdichtheid per 10 μm dendriet.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De methode voor het gebruik van kaliumdichromaat en zilvernitraat om neuronen te labelen werd voor het eerst beschreven door Camillo Golgi 1,2 en vervolgens gebruikt door Santiago Ramon y Cajal om een immens oeuvre te produceren dat neuronale en gliale subtypen onderscheidt. Een recent verschenen boek met zijn illustraties is nu beschikbaar3. Na de studies van Ramon y Cajal, die meer dan 100 jaar geleden werden gepubliceerd, werd zeer weinig Golgi-impregnatie gebruikt. Golgi-impregnatie is een moeizaam proces dat driedimensionale visualisatie van neuronen met een lichtmicroscoop mogelijk maakt. Er zijn in de loop der jaren talloze wijzigingen van de Golgi-methode geweest om de methode gemakkelijker te maken en de kleuring consistenter4. In 1984 beschreven Gabbott en Somogyi5 de eensectie Golgi-impregnatieprocedure die een snellere verwerking mogelijk maakte. Deze Golgi-impregnatiemethode vereist perfusie met 4% paraformaldehyde en 1,5% picrinezuur, postfixatie gevolgd door vibratome-sectie in een bad van 3% kaliumdichromaat. Secties worden gemonteerd op glazen dia's, de vier hoeken van coverslips gelijmd zodat bij onderdompeling in zilvernitraat de diffusie geleidelijk verloopt. Coverslips worden vervolgens afgeklapt, secties worden uitgedroogd en uiteindelijk permanent afgedekt met montagemedium. Deze techniek werd met succes gebruikt om neuronen en glia 6,7,8 in de hippocampus te labelen. De hier beschreven snelle Golgi-methode is een verbetering omdat er veel minder blootstelling is aan zowel kaliumdichromaat als zilvernitraat en er geen paraformaldehyde en picrinezuur worden gebruikt. Bovendien, hoewel cellen die werden geïmpregneerd met behulp van modificaties van de Gabbott- en Somogyi5-methode konden worden geanalyseerd, waren de secties vaak over- of onderbelicht of vielen ze van de dia's tijdens de uitdrogingsstap en over het algemeen moesten verschillende experimenten worden samengevoegd om voldoende cellen voor analyse te hebben.

Het huidige protocol beschrijft het gebruik van de Golgi-kleuringskit (zie Materiaaltabel) om dendrieten en dendritische stekels in de hippocampus en mediale prefrontale cortex (mPFC) van de rat te labelen. De voordelen van deze methode ten opzichte van eerdere zijn dat het snel is, er minder blootstelling is aan schadelijke chemicaliën voor de onderzoeker en er is consistente kleuring van neuronen. Het hieronder beschreven protocol is met kleine wijzigingen gebruikt om de dendritische wervelkolomdichtheid in de hippocampus en mPFC van de rat te beoordelen in vele onderzoeken 9,10,11,12,13,14,15.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimentele procedures zijn goedgekeurd door de Sacred Heart University Institutional Animal Care and Use Committee en zijn in overeenstemming met de NIH Guide for the Care and Use of Animals.

1. Isolatie en infiltratie van hersenweefsel

  1. Premix oplossingen A en B van de Golgi beitsset 24 uur voor gebruik en bewaren in donkere flessen en/of in het donker. Maak ongeveer 80 ml oplossing A en B-mengsel dat voldoende is om de oplossing na 24 uur te veranderen. Bewaren in luchtdichte flessen.
    OPMERKING: Perfusie met zoutoplossing of paraformaldehyde is niet nodig.
  2. Offer ratten op door guillotine na kooldioxide-euthanasie en verwijder hersenen binnen enkele seconden. Spoel de hersenen in zoutoplossing indien nodig, maar is niet nodig.
    1. Plaats de hersenen, cortex naar beneden zodat de hypothalamus zichtbaar is omdat de sneden vooraan en achteraan worden gemaakt, op een niet-poreus oppervlak. Gesneden in een voorste (bevat de prefrontale cortex) en achterste (bevat de hippocampus) blok zoals weergegeven in figuur 1.
  3. Plaats blokken in de voorgemengde oplossingen van A en B en zorg ervoor dat ze goed in de oplossing worden ondergedompeld. Zorg ervoor dat het volume van de oplossingen A en B voldoende is om de blokken onder te dompelen. Bewaar blokken in bruine flessen of heldere flessen bedekt met folie (om licht buiten te houden) in het donker bij kamertemperatuur.
  4. Vervang de oplossing na 24 uur en bewaar nog 13 dagen in het donker bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Bij gebruik met muizenhersenen is het niet nodig om te blokkeren en kunnen de hele hersenen in de oplossing worden geplaatst. Bij het kleuren van hersengebieden, die verschillend zijn in grootte, moet de tijd in oplossingen A en B mogelijk met vallen en opstaan worden bepaald.
  5. Na twee weken wordt het weefsel goed geïnfiltreerd met oplossingen A en B, breng de blokken over naar de cryoprotectieve oplossing (oplossing C in de Golgi-kleuringskit) en laat ze 48-72 uur bij 4 °C staan.
    OPMERKING: Na cryoprotectie kunnen blokken worden ingevroren tot verdere verwerking. Houd er ook rekening mee dat alle oplossingen uit de kit worden verzameld en verwijderd als gevaarlijk afval.
  6. Hersenen bevriezen, cortex naar beneden, op een glazen glijbaan op droogijs. Eenmaal ingevroren, snijd op de cryostaat of bewaar bij -80 °C totdat u door een cryostaat snijdt.
    OPMERKING: Bevries niet in vloeibare stikstof omdat dit scheuren in het weefsel veroorzaakt.

2. Doorsnede van hersenweefsels

  1. Plaats een kleine hoeveelheid weefselmedium op een voorgekoelde cryostaathouder. Monteer blokken op cryostaat klauwplaten door een kant van het blok iets in de hand te ontdooien (gehandschoend) en op het weefselmedium te plaatsen.
    OPMERKING: Het is niet nodig om het weefsel in te bedden. Het blok met de hippocampus is iets gemakkelijker door te snijden dan het blok met de prefrontale cortex omdat deze laatste voor het corpus callosum staat en de twee helften gescheiden zijn.
  2. Snijd 100 μm secties op een cryostaat bij -22 °C en monteer op subbed dia's. Secties tot 150 μm dikte kunnen worden gebruikt. Probeer 3-4 coronale secties per dia te monteren, omdat dit het aantal dia's vermindert dat moet worden verwerkt. Gebruik een van de volgende technieken om de secties bevroren te houden totdat ze op de dia komen.
    OPMERKING: Deze secties zijn niet op de gebruikelijke manier gefixeerd en daarom hebben ze de neiging om snel te smelten. Laat de secties smelten op de dia. Als ze beginnen te smelten voordat ze op de dia worden geplaatst, is het onmogelijk om ze plat op de dia te krijgen. Er zijn verschillende technieken om dit te doen.
    1. Gebruik een vriesspray op het mes en het blok. Afhankelijk van de temperatuur en luchtvochtigheid in de ruimte kan dit voor elke sectie nodig zijn. Gebruik de antirolplaat of een borstel om het gedeelte vlak te houden tijdens het snijden.
      OPMERKING: Zorg voor voldoende vriesspray. Verschillende blikken kunnen worden gebruikt bij het snijden van 20 blokken.
    2. Ontdooi de montage, indien mogelijk, met behulp van een dia op kamertemperatuur en breng deze snel aan de sectie. Met oefening kan men meerdere secties tegelijk monteren. Als dit niet werkt, bewaar dia's dan in de cryostaat zodat ze erg koud zijn en breng het gedeelte over met een koude tang of een koude verfkwast en ontdooi vervolgens de montage.
  3. Maak het mes schoon met papieren doekjes tussen de plakjes. Als het mes meer reiniging nodig heeft, gebruik dan 100% ethanol (EtOH) en laat het drogen voordat je de volgende plak snijdt.
  4. Eenmaal gemonteerd op de dia, plaatst u de dia plat op kartonnen schuifbakken en laat u secties drogen bij kamertemperatuur (gedurende enkele uren tot maximaal 48 uur) in het donker. Dek de schuiflade niet af. Zorg ervoor dat de secties volledig droog zijn voordat Golgi impregneert. Bewaar plat, in het donker, op schuifbakken tot Golgi impregnatie.
    OPMERKING: Het drogen van de secties veroorzaakt geen schade.

3. Kleuring en uitdroging van hersenweefsel

  1. Voer vlekken uit in glasbeitsschalen. Meng oplossingen D en E onmiddellijk voorafgaand aan het kleuren. Voeg volgens het protocol een deel van oplossing D, een deel van oplossing E en twee delen gedestilleerd water toe. Maak voor glasbeitsschalen een oplossing van 200 ml om de secties volledig onder te dompelen. Voor Koplin-potten vereist dit minder volume.
  2. Plaats dia's in rekken die ver genoeg uit elkaar staan om de oplossing toegang te geven tot secties.
  3. Plaats secties gedurende 4 min (2x) in gedestilleerd water voordat je ze gedurende 10 minuten in de Golgi impregnatiekleuringsoplossing plaatst. Vervang de kleuringsoplossing om de 70 secties. Ververs het gedestilleerde water wanneer het geel wordt.
    OPMERKING: De timing voor de kleuringsstap is van cruciaal belang. Te kort laat niet genoeg kleuring toe en te lange veroorzaakt overkleuring, waardoor de dendrieten moeilijk te scheiden zijn bij het uitvoeren van analyses. Eenmaal uit de kleuringsoplossing is de timing minder kritisch.
  4. Droog de secties als volgt uit: 70% EtOH (5 min), 95% EtOH (5 min; 2x), 100% EtOH (5 min; 2x), clearing agent (5 min; 3x). Vervang alle oplossingen vaak, vooral de 100% EtOH en het reinigingsmiddel om ervoor te zorgen dat de secties watervrij blijven.
    OPMERKING: Het is niet nodig om een 50% EtOH-stap te doorlopen. Counterstaining is niet nodig voor celvisualisatie omdat de Golgi-impregnatie voldoende contrast biedt. Het gebruik van andere clearingmiddelen heeft niet zo goed gewerkt als het gebruik dat hier wordt gebruikt (zie tabel met materialen).
  5. Coverslip met glazen coverslips die 60 mm lang zijn met een royale hoeveelheid montagemedium. Zorg ervoor dat er zo min mogelijk luchtbellen zijn. Verwijder indien nodig zorgvuldig de coverslip en doe deze opnieuw (kan zelfs weken later worden gedaan). Doe dit heel langzaam om het gedeelte niet te beschadigen (kan worden gedaan vanwege de grote hoeveelheid montagemedium).
    OPMERKING: Een grote hoeveelheid montagemedium is enigszins rommelig maar nog steeds noodzakelijk omdat er voldoende montagemedium moet worden gebruikt om de dikke secties van 100 μm te bedekken.
  6. Om ervoor te zorgen dat er slechts één coverslip op de secties wordt geplaatst, scheidt u de coverslips voorafgaand aan het proces.
  7. Zodra de hoes is uitgegleden, glijdt droog plat op niet-poreus papier gedurende 3-5 dagen, waarbij ze iets worden verplaatst, vooral na de eerste dag, om te voorkomen dat ze blijven plakken. Breng na 3-5 dagen de dia's over naar diahouders en, idealiter, droog dia's gedurende ten minste 3 weken voordat u ze onderzoekt. Houd dia's vlak om de kans op het vormen van luchtbellen te verkleinen.

4. Bepaling van de dendritische wervelkolomdichtheid

  1. Voor analyse van de dendritische wervelkolomdichtheid in piramidale neuronen van zowel het mPFC- als het CA1-gebied van de hippocampus, onderzoekt u de meest laterale secundaire basale dendrieten en de meest laterale tertiaire apicale dendrieten zoals beschreven in stap 4.1.1 (figuur 2).
    1. Kies een dendriet, meet de lengte van de dendriet met behulp van een beeldanalyseprogramma, tel de stekels op de dendrieten met behulp van een handteller en noteer zowel de lengte als het aantal stekels.
  2. Bestudeer en analyseer zes cellen per regio (mPFC, CA1) per hersenen. Kwantificeer minimaal zes hersenen per groep zoals eerder beschreven 7,8. Kies neuronen die voldoen aan de volgende criteria voor analyse: cellichamen en dendrieten zijn goed geïmpregneerd; dendrieten zijn te onderscheiden van aangrenzende cellen en zijn continu.
  3. Tel de stekels op 1000x (olie-onderdompeling) door met de hand te tellen met een lichtmicroscoop en meet dendritische lengte met behulp van een beeldanalyseprogramma. Bereken de rugdichtheid door het ruggetal te delen door de lengte van de dendriet en druk gegevens uit als het aantal stekels / 10 μm dendriet.
    OPMERKING: Er zijn veel geavanceerdere methoden voor het onderscheiden van wervelkolomsubtypen en dendritische architectuur die kunnen worden gebruikt, maar met de hand tellen met een lichtmicroscoop op 1000x kan een snel resultaat geven dat vervolgens kan bepalen of verder onderzoek nodig is. Hoewel alles in het werk wordt gesteld om consequent vergelijkbare dendrieten te bemonsteren, zijn er variaties in dikte die de telling kunnen beïnvloeden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van de snelle Golgi-methode worden cellen consequent goed geïmpregneerd, zodat er voldoende cellen zijn om te analyseren. Dit is een duidelijke verbetering ten opzichte van eerdere methoden waarbij experimenten moesten worden samengevoegd om voldoende gegevens voor analyse te hebben. Daarom kunnen meer monsters tegelijk worden verwerkt en kunnen hersenen bevroren worden opgeslagen tot de verwerking. Voorbeelden van met Golgi geïmpregneerde cellen in het CA1-gebied van de hippocampus worden weergegeven bij laag...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het huidige protocol beschrijft een methode van Golgi-impregnatie die een snelle gelijktijdige verwerking van vele secties mogelijk maakt. Het is een verbetering ten opzichte van eerder beschreven5 meer arbeidsintensieve methoden en levert consequent geïmpregneerde neuronen op voor analyse. Bovendien is er minder blootstelling aan giftige chemicaliën die worden gebruikt bij Golgi-impregnatie. Het meest uitdagende deel van het proces is om de secties plat op de dia's te krijgen, wat veel oefening v...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door Sacred Heart University Undergraduate Research InitiativeGrants.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Cardboard slides traysFisher Scientific12-587-10
Coverslips 24 x 60mmFisher Scientific12-545-M
FD Rapid GolgiStain kitFD NeurotechnologiesPK 401Stabiel bij RT in het donker voor maanden; Golgi kleuring kit
Freezing SprayFisher Scientific23-022524
HISTO-CLEARFisher Scientific50-899-90147klaringsmiddel
NCSS SoftwareKaysville, UT, USA
PermountFisher ScientificSP-15-100montagemedium
Superfrost Plus Microscope slidesFisher Scientific12-550-15
Tissue Tek CTYO OCT CompoundFisher Scientific14-373-65Wordt gebruikt om hersenen op cryostat chuck te monteren

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pannese, E. The Golgi Stain: invention, diffusion and impact on neurosciences. Journal of the History of the Neurosciences. 8 (2), 132-140 (1999).
  2. Bentivoglio, M., et al. The Original Histological Slides of Camillo Golgi and His Discoveries on Neuronal Structure. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 3(2019).
  3. Swanson, L. W., Newman, E., Araque, A., Dubinsky, J. M. The Beautiful Brain: The Drawings of Santiago Ramon y Cajal. , Abrams. 208(2017).
  4. Dall'Oglio, A., Ferme, D., Brusco, J., Moreira, J. E., Rasia-Filho, A. A. The "single-section" Golgi method adapted for formalin-fixed human brain and light microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 189 (1), 51-55 (2010).
  5. Gabbott, P. L., Somogyi, J. The 'single' section Golgi-impregnation procedure: methodological description. Journal of Neuroscience Methods. 11 (4), 221-230 (1984).
  6. Gould, E., Frankfurt, M., Westlind-Danielsson, A., McEwen, B. S. Developing forebrain astrocytes are sensitive to thyroid hormone. Glia. 3 (4), 283-292 (1990).
  7. Gould, E., Woolley, C. S., Frankfurt, M., McEwen, B. S. Gonadal steroids regulate dendritic spine density in hippocampal pyramidal cells in adulthood. Journal of Neuroscience. 10 (4), 1286-1291 (1990).
  8. Woolley, C. S., Gould, E., Frankfurt, M., McEwen, B. S. Naturally occurring fluctuation in dendritic spine density on adult hippocampal pyramidal neurons. Journal of Neuroscience. 10 (12), 4035-4039 (1990).
  9. Frankfurt, M., Salas-Ramirez, K., Friedman, E., Luine, V. Cocaine alters dendritic spine density in cortical and subcortical brain regions of the postpartum and virgin female rat. Synapse. 65 (9), 955-961 (2011).
  10. Frankfurt, M., Luine, V. The evolving role of dendritic spines and memory: Interaction(s) with estradiol. Hormones Behavior. 74, 28-36 (2015).
  11. Bowman, R. E., Luine, V., Khandaker, H., Villafane, J. J., Frankfurt, M. Adolescent bisphenol-A exposure decreases dendritic spine density: role of sex and age. Synapse. 68 (11), 498-507 (2014).
  12. Bowman, R. E., et al. Bisphenol-A exposure during adolescence leads to enduring alterations in cognition and dendritic spine density in adult male and female rats. Hormones Behavior. 69, 89-97 (2015).
  13. Eilam-Stock, T., Serrano, P., Frankfurt, M., Luine, V. Bisphenol-A impairs memory and reduces dendritic spine density in adult male rats. Behavioral Neuroscience. 126 (1), 175-185 (2012).
  14. Inagaki, T., Frankfurt, M., Luine, V. Estrogen-induced memory enhancements are blocked by acute bisphenol A in adult female rats: role of dendritic spines. Endocrinology. 153 (7), 3357-3367 (2012).
  15. Jacome, L. F., et al. Gonadal Hormones Rapidly Enhance Spatial Memory and Increase Hippocampal Spine Density in Male Rats. Endocrinology. 157 (4), 1357-1362 (2016).
  16. Frankfurt, M. Bisphenol-A: a plastic manufacturing compound disrupts critical brain structures and impairs memory. Research Features. , https://researchfeatures.com/wp-content/uploads/2021/05/Maya-Frankfurt.pdf (2021).
  17. Wallace, M., Luine, V., Arellanos, A., Frankfurt, M. Ovariectomized rats show decreased recognition memory and spine density in the hippocampus and prefrontal cortex. Brain Research. 1126 (1), 176-182 (2006).
  18. Wallace, M., Frankfurt, M., Arellanos, A., Inagaki, T., Luine, V. Impaired recognition memory and decreased prefrontal cortex spine density in aged female rats. Annals of the New York Academy of Science. 1097, 54-57 (2007).
  19. Bowman, R. E., Hagedorn, J., Madden, E., Frankfurt, M. Effects of adolescent Bisphenol-A exposure on memory and spine density in ovariectomized female rats: Adolescence vs adulthood. Hormones Behavior. 107, 26-34 (2019).
  20. Novaes, L. S., Dos Santos, N. B., Perfetto, J. G., Goosens, K. A. Environmental enrichment prevents acute restraint stress-induced anxiety-related behavior but not changes in basolateral amygdala spine density. Psychoneuroendocrinology. 98, 6-10 (2018).
  21. Trzesniewski, J., Altmann, S., Jäger, L., Kapfhammer, J. P. Reduced Purkinje cell size is compatible with near normal morphology and function of the cerebellar cortex in a mouse model of spinocerebellar ataxia. Experimental Neurology. 311, 205-212 (2019).
  22. Zemmar, A., et al. Oligodendrocyte- and Neuron-Specific Nogo-A Restrict Dendritic Branching and Spine Density in the Adult Mouse Motor Cortex. Cerebral Cortex. 28 (6), 2109-2117 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

HippocampusanalyseGolgi impregnatiecryostaatsnijdenspindichtheidpiramidale neuronenneuroanatomische tracingverrijking van de omgeving

Gerelateerde artikelen